Name: a step-by-step method for the reconstitution of an abc transporter into nanodisc lipid particles
Uploaded: 2012-08-31T12:00:00
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이 작품은 건강 연구의 캐나다 연구소에 의해 지원되었다. CSC는 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구위원회에서 박사 친목의 지원을받는되었다. FD는 등급 II 캐나다 연구 의자입니다.

<html> 전체 Reconstitution 프로세스 reconstitution 과정은 세제 - solubilized phospholipids의 존재에 정화 MalFGK이 컴플렉스로 ​​막 비계 단백질 (MSP)를 혼합하여 시작합니다. 단계는 바이오 비즈 나 Amberlite (그림 1)라는 흡착제 폴리스티렌 소재로 세제의 느린 제거을합니다. 자동 조립 공정 때문에 소수성 phospholipids, MalFGK이 복잡하고 MSP amphipathic 단백질의 표면 ?...

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	<li>Denisov, I. G., Ginkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+self-assembly+of+monodisperse+phospholipid+bilayer+Nanodiscs+with+controlled+size.">Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 3477-3487 (2004).</li><li>Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+separate+chemoreceptor+oligomeric+states+and+reveal+their+signaling+properties.">Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 11509-11514 (2006).</li><li>Bass, B. J., Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotropic+cooperativity+of+monomeric+cytochrome+P450+3A4+in+a+nanoscale+native+bilayer+environment.">Homotropic cooperativity of monomeric cytochrome P450 3A4 in a nanoscale native bilayer environment.</a> J. Biol. Chem. 282, 7066-7076 (2007).</li><li>Alami, M., Dalal, K., Lelj-Garolla, B., Sligar, S. G., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+unravel+the+interaction+between+the+SecYEG+channel+and+its+cytosolic+partner+SecA.">Nanodiscs unravel the interaction between the SecYEG channel and its cytosolic partner SecA.</a> EMBO J. 26, 1995-2004 (2007).</li><li>Mi, L. -. Z., Grey, M. J., Nishida, N., Walz, T., Lu, C., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+stability+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+detergent+micelles+and+phospholipid+nanodiscs.">Functional and structural stability of the epidermal growth factor receptor in detergent micelles and phospholipid nanodiscs.</a> Biochemistry. 47, 10314-10323 (2008).</li><li>Sch&#228;gger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217, 220-230 (1994).</li><li>Dalal, K., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+SecY+translocon+in+Nanodiscs.">Reconstitution of the SecY translocon in Nanodiscs.</a> Methods Mol. Biol. 619, 145-156 (2010).</li><li>Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+assay+for+nanomole+amounts+of+inorganic+phosphate.">An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate.</a> Anal. Biochem. 100, 95-97 (1979).</li><li>Davidson, A. L., Dassa, E., Orelle, C., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+evolution+of+bacterial+ATP-binding+cassette+systems.">Structure, function and evolution of bacterial ATP-binding cassette systems.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 72, 317-364 (2008).</li><li>Bordignon, E., Grote, M., Schneider, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maltose+ATP-binding+cassette+transporter+in+the+21st+century-towards+a+structural+dynamic+perspective+on+its+mode+of+action.">The maltose ATP-binding cassette transporter in the 21st century-towards a structural dynamic perspective on its mode of action.</a> Mol. Microbiol. 77, 1354-1366 (2010).</li><li>Alvarez, F. J., Orelle, C., Davidson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+reconstitution+of+an+ABC+transporter+for+use+in+electron+paramagnetic+resonance+spectroscopy.">Functional reconstitution of an ABC transporter for use in electron paramagnetic resonance spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 9513-9515 (2010).</li><li>Ritchie, T. K., Grinkova, Y. V., Bayburt, T. H., Denisov, I. G., Zolnerciks, J. K., Atkins, W. M., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+Nanodiscs.">Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 464, 211-231 (2009).</li><li>Gl&#252;ck, J. M., Koenig, B. W., Willbold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+allow+the+use+of+integral+membrane+proteins+as+analytes+in+surface+plasmon+resonance+studies.">Nanodiscs allow the use of integral membrane proteins as analytes in surface plasmon resonance studies.</a> Anal. Biochem. 408, 46-52 (2011).</li><li>Wan, C. -. P. L., Chiu, M. H., Wu, X., Lee, S. K., Prenner, E. J., Weers, P. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein-induced+conversion+of+phosphatidylcholine+bilayer+vesicles+into+nanodisks.">Apolipoprotein-induced conversion of phosphatidylcholine bilayer vesicles into nanodisks.</a> Biochim. Biophys. Acta (BBA). 1808, 606-613 (2011).</li><li>Nath, A., Trexler, A. J., Koo, P. K., Miranker, A. D., Atkins, W. M., Rhoades, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+fluorescence+spectroscopy+using+phospholipid+bilayer+Nanodiscs.">Single-molecule fluorescence spectroscopy using phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 472, 89-117 (2010).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochromes+P450+in+Nanodiscs.">Cytochromes P450 in Nanodiscs.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1814, 223-229 (2011).</li><li>Zhang, X. X., Chan, C. S., Bao, H., Fang, Y., Foster, L. J., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+and+SILAC-based+mass+spectrometry+to+identify+a+membrane+protein+interactome.">Nanodiscs and SILAC-based mass spectrometry to identify a membrane protein interactome.</a> J. Proteome Res. , (2011).</li></ol>

우리는 nanodiscs에 말토오스 수송의 reconstitution에 대한 간단한 절차를 설명합니다. 전송은 ATPase 활성 상태이며 수용성 바인딩 파트너 남성과의 상호 작용은 (그림 3) 재현 할 수 있습니다. nanodiscs에 전송의 성공 reconstitution 추가 biophysical 및 생화학 분석 방법을 엽니 다. 특히 관심 MalK ATPase 및 세제의 말토오스 수송 활동, 리포좀과 nanodiscs 체계적인 분석됩니다. ABC의 이동 장치는 전송 사?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> Amicon 울트라-4 50K 원심 필터 </td><td> Millipore </td><td> UFC805008 </td><td> 적절한 사용을 위해 제조업체의 규정을 따르 </td></tr><tr><td> 바이오 비즈 SM-2 흡착제 </td><td> 바이오 RAD </td><td> 152-3920 </td><td></td></tr><tr><td> 대장균 총 지질 </td><td> 벤티 폴라 지질 </td><td> 100500C </td><td> 클로로포름에 용해, 유기 용매에 따라 처리 </td></tr><tr><td> 니켈 세 파로스 HP 수지 </td><td> GE 헬스 케어 </td><td> 17-5268-01 </td><td></td></tr><tr><td> 인 표준 솔루션 </td><td>시그마 - 알드리치 </td><td> P3869 </td><td></td></tr><tr><td> pMSP1D1 </td><td> Addgene </td><td> 20,061 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 HR 3백분의 10 </td><td> GE 헬스 케어 </td><td> 17-5172-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 I. 특정 시약. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 구성 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> DDM 주식 </td><td> 10% w / V DDM </td><td> -20 ° C에서 milliQ 물과 저장소에 Resuspend </td></tr><tr><td> MalFGK이 주식 </td><td> 1-2 MG / ML 50 MM 트리스 - HCL, pH7.9 100 MM NaCl 10% 브이 / v 글리세롤 0.03 % w / V DDM </td><td> -70에서 저장 ° C 정화 후 </td></tr><tr><td> MSP 주식 </td><td> 10-15 MG / ML 50 MM 트리스 - HCL, pH7.9 100 MM NaCl 10% 브이 / v 글리세롤 </td><td> -70에서 저장 ° C &lt;1 ML의 aliquots에서 정화 이후 과도한 동결 / 해동 사이클을 방지 </td></tr><tr><td> 인지질 재고 </td><td> 5 NM E. 대장균은 지질를 집계 0.5 % w / V (10 ㎜) DDM 50 MM 트리스 - HCL, pH를 7.9 50 MM NaCl </td><td> 일주 4 ° C에서 저장 </td></tr><tr><td> TS 버퍼 </td><td> 50 MM 트리스 - HCL, pH를 7.9 50 MM NaCl </td><td> 4에 저장 ° C </td></tr><tr><td> TSG10 버퍼 </td><td> 50 MM 트리스 - HCL, pH7.9 100 MM NaCl 10% 브이 / v 글리세롤 </td><td> 4에 저장 ° C </td></tr><tr><td> TSG20 버퍼 </td><td> 50 MM 트리스 - HCL, pH8 100 MM NaCl 20% 브이 / v 글리세롤 </td><td> 4에 저장 ° C </td></tr><tr><td> TSGD 버퍼 </td><td> 50 MM 트리스 - HCL, pH7.9 100 MM NaCl 10% 브이 / v 글리세롤 0.03 % w / V DDM </td><td> 4 ° C에서 저장 불과 사용하기 전에 DDM을 추가 </td></tr><tr><td colspan="3"> 표 II. 솔루션 요리. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

a step-by-step method for the reconstitution of an abc transporter into nanodisc lipid particles

nanodisc는 discoidal 입자 (~ 10-12 nm의 넓은)는 트랩 막 단백질 인지질 이중층의 작은 패치로.입니다 nanodisc 특히 리간드 - 수용체 상호 작용의 맥락에서, 막 단백질을 공부에 특히 매력적인 옵션입니다. 방법은 Sligar에 의해 개척 및 동료는 apolipoprotein A1에서 파생 설계 높은 - 나선형 비계 단백질의 amphipathic 특성에 기반을두고 있습니다. 극지방의 수성 환경에 직면 반면 비계 단백질의 소수성 얼굴은 지질 이중층의 지방산 아실 사이드 체인과 상호 작용할 수 있습니다. 입자가 작은 균질하고 수용성이기 때문에 nanodiscs의 막 단백질의 분석은 리포좀에 비해 상당한 장점이 있습니다. 또한, 일반적으로 수용성 단백질에 예약 생​​화학 및 biophysical 방법이 적용하고 막 양쪽에서 할 수 있습니다. 이 시각 프로토콜에서, 우리는 잘 charac의 단계별로 reconstitution을 제시terized 세균 ABC의 전송, 남성 MalFGK이 복잡. 디스크의 형성은 세제의 진보적 인 제거에있어 소수성 상호 작용에 따라 자기 조립 과정입니다. 우리는 필수적인 단계를 설명하고 우리는 집계 및 큰 polydisperse 리포좀과 같은 입자의 형성을 제한하기 위해 올바른 단백질 - 투 - 지질의 비율을 선택의 중요성을 강조 표시합니다. 간단한 품질은 디스크가 올바르게 재구성되었는지 확인 겔 여과 크로마토 그래피, 기본 겔 전기 영동 및 동적 광 산란 분광법으로 제어합니다.

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A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

Nanodiscs는 인지질 이중층의 작은 패치로 막 단백질을 포함 작은 원반 모양의 입자입니다. 우리는 디스크에 MalFGK2 수송의 단계별 설립을 보여줍니다 시각적 프로토콜을 제공합니다.

Nanodisc 지질 입자로 ABC의 전송의 Reconstitution을위한 단계별 방법

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

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