Name: a step-by-step method for the reconstitution of an abc transporter into nanodisc lipid particles
Uploaded: 2012-08-31T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles at JoVE.com

Detta arbete stöddes av den kanadensiska Institute of Health Research. CSC har finansierats av en postdoktorsstipendium från naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada. FD är en Tier II Canada Research Chair.

<html> Övergripande Beredning Process Den beredning startar genom att blanda membranet ställningen proteinet (MSP) med den renade MalFGK 2 komplexet i närvaro av detergent-solubiliserade fosfolipider. Det steget följs av långsamma avlägsnande av detergenten genom ett adsorberande polystyrenmaterialet kallas Bio-Beads eller Amberlite (figur 1). Den automatiska monteringen sker troligen på grund av de opolära växelverkan mellan de hydrofoba fosfolipider, den Ma...

<ol>
	<li>Denisov, I. G., Ginkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+self-assembly+of+monodisperse+phospholipid+bilayer+Nanodiscs+with+controlled+size.">Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 3477-3487 (2004).</li><li>Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+separate+chemoreceptor+oligomeric+states+and+reveal+their+signaling+properties.">Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 11509-11514 (2006).</li><li>Bass, B. J., Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotropic+cooperativity+of+monomeric+cytochrome+P450+3A4+in+a+nanoscale+native+bilayer+environment.">Homotropic cooperativity of monomeric cytochrome P450 3A4 in a nanoscale native bilayer environment.</a> J. Biol. Chem. 282, 7066-7076 (2007).</li><li>Alami, M., Dalal, K., Lelj-Garolla, B., Sligar, S. G., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+unravel+the+interaction+between+the+SecYEG+channel+and+its+cytosolic+partner+SecA.">Nanodiscs unravel the interaction between the SecYEG channel and its cytosolic partner SecA.</a> EMBO J. 26, 1995-2004 (2007).</li><li>Mi, L. -. Z., Grey, M. J., Nishida, N., Walz, T., Lu, C., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+stability+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+detergent+micelles+and+phospholipid+nanodiscs.">Functional and structural stability of the epidermal growth factor receptor in detergent micelles and phospholipid nanodiscs.</a> Biochemistry. 47, 10314-10323 (2008).</li><li>Sch&#228;gger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217, 220-230 (1994).</li><li>Dalal, K., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+SecY+translocon+in+Nanodiscs.">Reconstitution of the SecY translocon in Nanodiscs.</a> Methods Mol. Biol. 619, 145-156 (2010).</li><li>Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+assay+for+nanomole+amounts+of+inorganic+phosphate.">An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate.</a> Anal. Biochem. 100, 95-97 (1979).</li><li>Davidson, A. L., Dassa, E., Orelle, C., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+evolution+of+bacterial+ATP-binding+cassette+systems.">Structure, function and evolution of bacterial ATP-binding cassette systems.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 72, 317-364 (2008).</li><li>Bordignon, E., Grote, M., Schneider, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maltose+ATP-binding+cassette+transporter+in+the+21st+century-towards+a+structural+dynamic+perspective+on+its+mode+of+action.">The maltose ATP-binding cassette transporter in the 21st century-towards a structural dynamic perspective on its mode of action.</a> Mol. Microbiol. 77, 1354-1366 (2010).</li><li>Alvarez, F. J., Orelle, C., Davidson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+reconstitution+of+an+ABC+transporter+for+use+in+electron+paramagnetic+resonance+spectroscopy.">Functional reconstitution of an ABC transporter for use in electron paramagnetic resonance spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 9513-9515 (2010).</li><li>Ritchie, T. K., Grinkova, Y. V., Bayburt, T. H., Denisov, I. G., Zolnerciks, J. K., Atkins, W. M., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+Nanodiscs.">Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 464, 211-231 (2009).</li><li>Gl&#252;ck, J. M., Koenig, B. W., Willbold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+allow+the+use+of+integral+membrane+proteins+as+analytes+in+surface+plasmon+resonance+studies.">Nanodiscs allow the use of integral membrane proteins as analytes in surface plasmon resonance studies.</a> Anal. Biochem. 408, 46-52 (2011).</li><li>Wan, C. -. P. L., Chiu, M. H., Wu, X., Lee, S. K., Prenner, E. J., Weers, P. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein-induced+conversion+of+phosphatidylcholine+bilayer+vesicles+into+nanodisks.">Apolipoprotein-induced conversion of phosphatidylcholine bilayer vesicles into nanodisks.</a> Biochim. Biophys. Acta (BBA). 1808, 606-613 (2011).</li><li>Nath, A., Trexler, A. J., Koo, P. K., Miranker, A. D., Atkins, W. M., Rhoades, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+fluorescence+spectroscopy+using+phospholipid+bilayer+Nanodiscs.">Single-molecule fluorescence spectroscopy using phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 472, 89-117 (2010).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochromes+P450+in+Nanodiscs.">Cytochromes P450 in Nanodiscs.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1814, 223-229 (2011).</li><li>Zhang, X. X., Chan, C. S., Bao, H., Fang, Y., Foster, L. J., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+and+SILAC-based+mass+spectrometry+to+identify+a+membrane+protein+interactome.">Nanodiscs and SILAC-based mass spectrometry to identify a membrane protein interactome.</a> J. Proteome Res. , (2011).</li></ol>

Vi beskriver ett enkelt förfarande för beredning av maltos transportören till nanodiscs. Transportören är ATPas aktiv och samspelet med den lösliga bindningspartnern MalE kan återskapas (Figur 3). Den framgångsrika rekonstituering av transportören till nanodiscs bana väg för ytterligare biofysiska och biokemiska analyser. Av särskilt intresse är den systematiska analysen Malk ATPas och maltos transportverksamhet i tvättmedel, liposom och nanodiscs. ABC transportörer byter konformationer u...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-4 50K centrifugalfilter </td><td> Millipore </td><td> UFC805008 </td><td> Följ tillverkarens protokoll för korrekt användning </td></tr><tr><td> Bio-Beads SM-2 Adsorbent </td><td> Bio-Rad </td><td> 152-3920 </td><td></td></tr><tr><td> E. coli totala lipider </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 100500C </td><td> Löstes i kloroform, handtag som är lämpligt för ett organiskt lösningsmedel </td></tr><tr><td> Ni Sepharose HP-harts </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5268-01 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfor standardlösning </td><td>Sigma-Aldrich </td><td> P3869 </td><td></td></tr><tr><td> pMSP1D1 </td><td> Addgene </td><td> 20.061 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 HR 10/300 </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5172-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabell I. Specifika reagens. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Namn </td><td> Sammansättning </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> DDM lager </td><td> 10% vikt / vol DDM </td><td> Återsuspendera i MilliQ-vatten och förvara vid -20 ° C </td></tr><tr><td> MalFGK 2 lager </td><td> 1-2 mg / ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 100 mM NaCl 10% vol / vol glycerol 0,03% vikt / vol DDM </td><td> Lagra vid -70 ° C efter rening </td></tr><tr><td> MSP lager </td><td> 10-15 mg / ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 100 mM NaCl 10% vol / vol glycerol </td><td> Lagra vid -70 ° C efter rening i &lt;1 ml alikvoter och undvika alltför frysnings / upptiningscykler </td></tr><tr><td> Phospholipid lager </td><td> 5 nM E. E. coli totalt lipider 0,5% vikt / vol (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM NaCl </td><td> Lagra vid 4 ° C under 1 vecka </td></tr><tr><td> TS-buffert </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM NaCl </td><td> Förvaras vid 4 ° C </td></tr><tr><td> TSG10 buffert </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 100 mM NaCl 10% vol / vol glycerol </td><td> Förvaras vid 4 ° C </td></tr><tr><td> TSG20 buffert </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH 8 100 mM NaCl 20% vol / vol glycerol </td><td> Förvaras vid 4 ° C </td></tr><tr><td> TSGD buffert </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 100 mM NaCl 10% vol / vol glycerol 0,03% vikt / vol DDM </td><td> Lagra vid 4 ° C och tillsätt DDM strax före användning </td></tr><tr><td colspan="3"> Tabell II. Lösning recept. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

a step-by-step method for the reconstitution of an abc transporter into nanodisc lipid particles

Det nanodisc är en skivformig partikel (~ 10-12 nm stor) den fällan membranproteiner i en liten bit fosfolipid tvåskiktsmembran. Den nanodisc är ett särskilt attraktivt alternativ för att studera membranproteiner, i synnerhet inom ramen av ligand-receptor-interaktioner. Metoden uppfunnen av Sligar och kollegor bygger på amfipatiska egenskaperna hos en konstruerad mycket en-spiralformad byggnadsställning protein från apolipoprotein A1. De hydrofoba ytor schavotten proteinet interagera med fettacyl sidokedjor av lipiddubbelskiktet medan polarområdena inför den vattenhaltiga omgivningen. Analyser av membranproteiner i nanodiscs har betydande fördelar jämfört med liposom eftersom partiklarna är små, homogena och vatten-lösliga. Dessutom, kan biokemiska och biofysiska metoder som normalt reserveras för lösliga proteiner appliceras, och från vardera sidan av membranet. I denna visuella protokoll, presenterar vi ett steg-för-steg rekonstitution av en väl teckenterized bakteriellt ABC-transportprotein, de manliga-MalFGK 2 komplex. Bildandet av skivan är en självorganiserande processen som beror på hydrofoba interaktioner som äger rum under det gradvisa avlägsnandet av tvättmedlet. Vi beskriver de viktigaste stegen och vi betona vikten av att välja rätt protein-till-lipid för att begränsa bildandet av aggregat och större polydispersa liposom-liknande partiklar. Enkel kvalitetskontroller såsom gelfiltreringskromatografi, nativ gelelektrofores och dynamisk ljusspridning spektroskopi säkerställa att skivorna har blivit riktigt rekonstituerats.

Watch this Scientific Journal Video about A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles at JoVE.com

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

Nanodiscs är små skivformiga partiklar som innehåller membranproteiner i en liten lapp av fosfolipid tvåskiktsmembran. Vi tillhandahåller en visuell protokoll som visar steg-för-steg inkorporering av MalFGK2 transportören till en skiva.

En steg-för-steg metod för beredning av en ABC Transporter i Nanodisc lipidpartiklar

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

Expression, tvättmedel Lösningsgörande, och rening av ett membran transportören, MexB multidrogresistensgenen Protein

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Blås-medierad affinitetskromatografi med magnetkamera Aktivt cellsortering (LIMACS): en ny metod för att analysera protein-lipid Interaktion

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Beredning av Active T. castaneum Telomeras

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

En enkel metod för Imaging Arabidopsis Blad Använda Perfluorodecalin som en infiltrativ Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

Beredning av ett Kv Channel i lipidmembraner för strukturella och funktionella studier

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Beredning av ett transmembranprotein, den spänningskänsliga jonkanaler, KvAP, in Giant enlamellvesiklar för mikroskopi och Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Förfarande för att utvärdera effektiviteten av flockningsmedel för att avlägsna dispergerade partiklarna från växtextrakt

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

En effektiv In Vitro införlivande metod av en Transcriptionally reglerade Sleeping Beauty System paketeras i en Integration defekta Lentiviral Vector

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...

An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing

Ett luft-flytande gränssnitt Bronchial Epitelial Modell för realistisk, upprepad inandningsexponering för luftburna partiklar för toxicitetstestning

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Tjudrade Bilayer Lipidmembran för att övervaka värmeöverföring mellan guldnanopartiklar och lipidmembran

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...