Name: chromatin isolation by rna purification (chirp)
Uploaded: 2012-03-25T14:00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP at JoVE.com

Vi takker T. Hung, MC. Tsai, O. Manor, E. Segal, M. Kuroda, T. Swigut, og I. Shestopalov for diskusjoner. Støttet av Byrået for vitenskap, teknologi og forskning Singapore (CC), NIH R01-CA118750 og R01-HG004361 (HYC), og California Institute for regenerativ medisin (HYC). HYC er en Early Career Scientist av Howard Hughes Medical Institute.

1. Probe Design Design anti-følelse DNA flislegging prober for selektiv uthenting av RNA mål av Chirp. <ol><li> Design anti-sense oligo probes i bruk den elektroniske sonden designer hos <a href="http://singlemoleculefish.com">singlemoleculefish.com</a> 18. </li><li> Bruk disse parametrene: antall prober = 1 probe / 100 bp av RNA lengde, 2) Target GC% = 45, 3) Oligonucleotide lengde = 20, 4) Mellomrom lengde = 60-80. Bryt RNA inn i segmenter hvis for lang for designeren. Utelat områder av gjentakelser eller omfattende homologi. </li><li> Bestill anti-sense DNA prober med BiotinTEG ved 3-prime end. </li><li> Etiketten sonder etter sine posisjoner langs RNA. Skille dem i to bassenger, slik at &quot;selv&quot; pool inneholder alle sonder 2 nummerering, 4, 6 osv. og &quot;odd&quot; pool inneholder prober nummerering 1, 3, 5 osv. Fortynn pool av sonder til 100 mikrometer konsentrasjon og Oppbevar ved -20 ° C. </li><li> Alle eksperimenter skal utføres ved hjelpbegge bassengene, som fungerer som interne kontroller for hverandre. Ekte RNA-avhengige signal ville være til stede fra begge bassengene, mens probe-spesifikke lyder ville være unik for hver pool. Dette gjelder for både kvitre-qPCR og chirp-seq. </li></ol> 2. Harvests Celler Samle celler som skal brukes til chirp eksperiment. <ol><li> Grow celler i vev kultur plater eller kolber til confluency. Skyll med fosfat saltløsning (PBS) én gang og trypsinize. Slukk trypsin med&gt; 2x volum av media, pipette opp og ned for å løsne cellene og resuspender i single cellesuspensjon. Overfør alle medier og resuspendert celler inn i 50 ml Falcon rør. 20 millioner celler er vanligvis tilstrekkelig for en chirp prøve. </li><li> Spinn cellene ved 800RCF for 4 min. Sug media og Resuspender 40 millioner celler i 40 ml PBS, kombinere rør om nødvendig. Spinn cellene ved 800RCF for 4 min. Dekanter PBS, forsiktig aspirer på en vinkel gjenværende væske. </li></ol&gt; 3. Cross-link Cells og samle cellepelleten Kryssbindingsfordelingen samlet celler med glutaraldehyd å bevare RNA-Chromatin interaksjoner og forberede cellepelleten. <ol><li> Utfør alle trinnene ved romtemperatur. </li><li> Forbered 1% glutaraldehyd i romtemperatur PBS. Forbered 10 ml per 10 millioner celler (0,4 ml 25% glutaraldehyd lager + 9,6 mL PBS). Glutaraldehyde må brukes fersk. </li><li> Trykk bunnen av Falcon rør for å løsne pellets. Resuspender cellepelleten i 1% glutaraldehyd, starter med et lite volum for å unngå biter, deretter fylle opp til full volum. Inverter å blande. Kryssbindingsfordelingen for 10min ved romtemperatur på en ende-til-ende shaker eller rotator. </li><li> Slukke kryssbinding reaksjon med 1/10th volum på 1,25 M glysin i romtemperatur i 5 min. </li><li> Snurr på 2000RCF i 5 min. Aspirer supernatanten og vask pellet med 20 mL kjølt PBS gang, spinning på 2000RCF i 5 min. </li><li> Aspirer og resuspender wforaskes, tverrbundet pellet med 1 ml kjølt PBS per 20 millioner celler. Overfør hver ml til en Eppendorf rør og spinn på 2000RCF for 3 min ved 4 C. Ta så mye PBS som mulig med pipettespissen nøye. </li><li> Flash-fryse cellen pellets i flytende nitrogen og oppbevar ved -80 ° C på ubestemt tid. </li></ol> 4. Cellelyse Lyse krysskoblet celler til å forberede celle lysate. <ol><li> Tin frosne celle pellets ved romtemperatur. Trykk vanskelig å løsne og blande cellepelleten. Spinn ned pellet ved 2000RCF for 3 min ved 4 ° C. Bruk en skarp 10 mL pipette for å fjerne eventuelle gjenværende PBS. </li><li> På en elektronisk balanse (nøyaktig til 1 mg) tara massen av en tom Eppendorf rør (våre rør veier 1.060 gram veldig konsekvent). Veie hver pellet og registrere sin vekt. En full 15 cm rett av tverrbundet Jakten celler veier vanligvis 100 mg. </li><li> Supplement Lysis buffer (10X massen av pellets, en f.eks ml for 100 mg) med FRESh proteasehemmer, PMSF og Superase-i (se vedlagte buffer liste). Bland godt. </li><li> Legg 10X volumet supplert Lysis Buffer til hvert rør og resuspender pelleten. For små pellets &lt;25 mg, resuspender i 250 mL supplert lysis buffer. Suspensjon skal være glatt. Hvis ikke, dele suspensjonen i 500 mL alikvoter og bruke en motorisert pellet mikser til å bryte opp klumper. Fortsett straks til sonikator. </li></ol> 5. Sonikator Shear DNA ved sonicating krysskoblet celle lysates. <ol><li> Sonicate celle lysate i Bioruptor i 15 ml Falcon rør. Bruk &lt;1,5 ml lysate i hvert rør, og for raskere sonikator, sonicate ikke mer enn to rørene på en gang. </li><li> Sonicate i en 4 ° C vannbad ved høyeste innstilling med 30 sekunder på, 45 sekunder av puls intervaller. Sjekk lysate hvert 30 min. Fortsett sonicating inntil cellen lysate ikke lenger grumset. Dette kan ta så lite som 30 min og så mange som fire timer. Talletav rør, vil prøvevolum, badet temperatur, og perioden med sonikator tid påvirke hvor lang tid prosessen tar. Rør vil trolig sonicate ved ulike priser, så pool dem sammen hver 30 min og redistribuere inn originale rør for å sikre homogenitet. Merk: glutaraldehyd-krysskoblet celler tar vesentlig lengre tid å sonicate enn formaldehyd ekvivalenter. </li><li> Når lysate snur klar, overføre 5 mL lysate til en frisk Eppendorf rør. Legg 90 mL DNA Protease K (PK) Buffer (se buffer liste) og 5 mL PK. Vortex å spinne og mixe ned kort. Inkuber i 45 min ved 50 ° C. </li><li> Pakk DNA med Qiagen PCR rensing kit. Eluer DNA i 30 mL Qiagen eluering Buffer (EB) og sjekke DNA størrelse på 1% agarose gel. Dersom mesteparten av DNA smøre er 100-500 bp, er sonikator fullført. Hvis ikke, fortsetter å sonicate. </li><li> Sentrifuger sonicated prøver på 16100RCF i 10 min ved 4 ° C. Kombiner supernatants, alikvoter i 1 ml prøver og flash-fryse i flytende nitrogen. Oppbevares ved -80 ° C. </li></ol> 6. Kvitre Hybridize biotinylated DNA prober til RNA og isolere bundet kromatin. <ol><li> Thaw rør av kromatin ved romtemperatur. </li><li> Forbered Hybridisering Buffer (se buffer liste, forberede 2 ml per ml av kromatin). Vortex å blande. </li><li> For en typisk kvitre prøve ved hjelp av 1 ml lysate, fjerne 10 mL for RNA-inngang og 10 mL for DNA-inngang og plass i Eppendorf-rør. Hold på is inntil videre bruk. </li><li> Overfør 1 mL kromatin til 15 ml Falcon rør. Tilsett 2 mL Hybridisering Buffer til hvert rør. For total volum &lt;1,5 ml, bruke Eppendorf-rør. </li><li> Tin prober ved romtemperatur. Nanodrop prober for å sjekke beløpet hvis du ikke har brukt det i lang tid (100 mikrometer sondene skulle spec ~ 500-600 ng / mL hjelp enkelt strand DNA innstilling). Legg passende mengde prober til bestemte rør (100 pmol sonde per 1 ml kromatin, 1 mL av 100 pmol / mL probe per 1 ml kromatin).Bland godt. Inkuber ved 37 ° C i 4 timer med risting. </li><li> Med 20 min igjen for hybridisering, forberede C-1 magnetiske kuler (som er lagret ved 4 º C). Bruk 100 mL per 100 pmol av sonder. Vask med 1 ml unsupplemented Lysis Buffer tre ganger, ved hjelp av DynaMag-2 magnet stripe til separate perler fra buffer. </li><li> Resuspender perler i original volum av Lysis buffer; supplere med frisk PMSF, PI og Superase-in. Etter 4 timers hybridisering reaksjonen er ferdig, tilsett 100 mL perler i hvert rør. Bland godt. Inkuber ved 37 ° C i 30 min med risting. </li><li> Forbered vaskebuffer (5 ml per prøve). Vortex å blande. Forvarm til 37 ° C. Legg PMSF før bruk. </li><li> Vask perler med 1 ml vaskebuffer fem ganger. På den første vask, bruk DynaMag-15 magnetstripen til egne perler, decant og Resuspender i 1 ml vaskebuffer. Overføring volum til 1,5 ml Eppendorf rør. Inkuber ved 37 ° C med risting i 5 min. </li><li> Ved senere vask, spinner ned hvert rør på en minicentrifugeSetter prøve på DynaMag-2 magnetstripen i 1 min. Dekanter prøven, tørke noen drypp med en Kimwipe, resuspender i 1 ml vaskebuffer. Inkuber ved 37 ° C med risting i 5 min. Gjenta i fem totalt vask. </li><li> Endelig vask, resuspender perlene godt. Fjern 100 mL og satt til side for RNA isolering. Reserve 900 mL for DNA brøkdel. Plasser alle rør på DynaMag-2 magnetstripen og fjerne vaskebuffer. Spinn alle rør ned kort; plassere dem på magnet stripen. Fjern den siste bit av vaskebuffer helt med en skarp 10 mL pipette tips. </li></ol> 7. RNA Isolation Utdrag RNA brøkdel fra kvitre prøver å quantitate av Qrt-PCR. <ol><li> Ta 100 mL perle prøver og 10 mL RNA INPUT prøven. Legg 85 mL RNA PK Buffer pH 7,0 til RNA INPUT. Resuspender perler i 95 mL RNA PK Buffer pH 7,0. Tilsett 5 mL Proteinease K og Inkuber ved 50 ° C i 45 min med ende-til-ende risting. </li><li> Kort spinne ned alle rør ogkoke prøver for 10 min på varme blokk ved 95 ° C. </li><li> Chill prøver på is, tilsett 500 mL TRIzol, vortex kraftig i 10 sek. Inkuber ved romtemperatur i 10 min. Oppbevares ved -80 ° C eller gå videre til trinn 4. </li><li> Tilsett 100 mL kloroform til TRIzol behandlet prøvene. Vortex kraftig i 10 sek. Snurr på 16100RCF på en stasjonær sentrifuge i 15 min ved 4 ° C. </li><li> Fjern ~ 400 mL vandig supernatant, unngå organisk og grensesnitt. </li><li> Legg 600 mL (1,5 volum) 100% etanol og bland godt. Spinn prøven gjennom MIRNeasy mini kolonner. Vask 1x med RWT (MIRNeasy mini kit), 2x med RPE per produsentens protokoll. Eluer med 30 mL nukleasefritt H 2 O (NFH 2 O). </li><li> Unn RNA eluatet med DNA-free per produsentens protokoll. Etter at reaksjonen er ferdig, varme prøven i 15 minutter ved 65 ° C til helt inaktivere eventuelle gjenværende DNase. </li><li> Bruk 1 mL RNA isolere per brønn for QRT-PCR-analyse for å bekrefte lncRNAhenting. GAPDH blir ofte brukt som en negativ kontroll. </li></ol> 8. DNA Utdrag DNA fraksjon fra kvitre prøver å identifisere ved sekvensering eller quantitate av qPCR. <ol><li> Forbered DNA eluering Buffer (se buffer liste), 150 mL per prøve, inkludert DNA INPUT. </li><li> Tilsett 1 0μL RNase A (10 mg / ml) og 10 mL RNase H (10 U / mL) per ml av DNA eluering buffer, og virvle å blande. </li><li> Resuspender hver prøve av perler i 150 mL av DNA eluering buffer med RNases. (Resuspender DNA INPUT i 140 mL) Inkuber ved 37 ° C i 30 min med risting. </li><li> Separate perler og supernatanten på DynaMag-2 magnetstripen. Fjern supernatanten og legge til merket rør. </li><li> Utarbeide en andre delmengde av DNA eluering buffer med 10 mL RNase A (10 mg / ml) og RNaseH (10 U / mL) nøyaktig som gjøres i 8.2). Tilsett 150 mL til hver prøve (inkludert DNA-inngang), inkuber, og fjern supernatanten. Samle all supernatanten (should være ~ 300 mL). </li><li> Tilsett 15 mL PK til hver prøve. Inkuber ved 50 ° C i 45 min med risting. </li><li> Pre-spinner ned gule fase-lock gel rør (5PRIME). Overføring DNA-prøver til fase-lock gel rør, og legg 300 mL PhOH: kloroform: Isoamyl per prøve. Rist kraftig i 10 min, og spinne ned på en Borstemmaskin sentrifuger ved 16100RCF i 5 min ved 4 ° C. Ta vandig fra toppen (~ 300 mL). Legg 3 mL GlycoBlue, 30 mL NaOAc, og 900 mL 100% EtOH. Bland godt og oppbevar ved -20 ° C over natten. </li><li> Spinn prøver på 16100RCF i 30 min ved 4 ° C. </li><li> Dekanter supernatanten forsiktig. Tilsett 1 ml 70% EtOH og virvle å blande. Snurr på 16100RCF i 5 min. Fjern supernatanten ved pipette. Lufttørke for 1min. Resuspender i 30 mL EB. </li><li> DNA-prøver er klare for analyse av qPCR eller forberedelse av high-throughput sekvensering biblioteker per Illumina protokollen. </li></ol> 10. Representative Resultater Figur 1 </strong&gt; skildrer chirp arbeidsflyten. En vellykket Chirp eksperiment beriker typisk target RNA betydelig over ikke-spesifikke RNA. Figur 2 viser anrikning av menneskelig telomerase RNA (TERC) fra Jakten celler enn GAPDH, et rikt cellulære RNA som fungerer som en negativ kontroll. Flertallet av TERC RNA (~ 88%) til stede i cellen ble dratt ned ved å utføre kvitre, mens bare 0,46% av GAPDH RNA ble hentet frem, viser en berikelse faktor på ~ 200 fold. Uspesifikke prober som prober rettet LacZ RNA, som ikke er uttrykt i pattedyrceller (figur 2), kan brukes som ekstra negative kontroller. DNA regioner forventes å binde målet lncRNA er typisk beriket enn negative regioner målt ved qPCR. Figur 3 viser qPCR validering av fire HOTAIR-bundet steder i primære humane foreskin fibroblaster at vi bestemt ved å utføre kvitre-seq i samme celle linje, mens TERC og GAPDH DNA-områder SErve som negativ kontroll regioner. Både &quot;selv&quot; og &quot;odd&quot; probe setter ga sammenlignbare anrikning av forventede HOTAIR-bundet områder enn negative regioner, et kjennetegn på ekte lncRNA-bindingssteder. High-throughput sekvensering av kvitre beriket DNA gir en global kart over lncRNA-bindingssteder. Den Drosophila lncRNA roX2 er kjent for å samhandle med X-kromosomet på en måte som er nødvendig for doseringen kompensasjon. Figur 4 viser roX2 binding profil over en del av X-kromosomet. Både &quot;selv&quot; og &quot;rare&quot; prøver har blitt sekvensert og deres unike lyder har blitt eliminert å produsere et spor av overlappende signaler. Hver &quot;peak&quot; indikerer her en sterk stedet roX2 bindende. Den komplette spor og liste over roX2 målgener har blitt beskrevet i Chu et al. 2011 17. <img alt="Figur 1." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig1.jpg" /> Figur 1. Flow diagram av chirp proseDure. Kromatin er tverrbundet til lncRNA: protein-addukter i vivo Biotinylated fliser sonder er hybridisert å målrette lncRNA, og kromatin komplekser blir renset ved hjelp av magnetiske streptavidin perler, fulgt av strenge vasker.. Vi Eluer lncRNA bundet DNA eller proteiner med en cocktail av Rnase A og H. A antatte lncRNA bindende sekvensen er skjematisert i oransje. Tidligere publisert i Chu et al. 2011. 17 <img alt="Figur 2." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig2.jpg" /> Figur 2. Kvitre beriker for menneskelig TERC RNA. TERC-asDNA prober hente ~ 88% av mobilnettet TERC RNA og undetectable GAPDH. LacZ-asDNA prober brukes som negative kontroller og hente verken RNAS. Mean + sd vises. Tidligere publisert i Chu et al. 2011. 17 <img alt="Figur 3." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig3.jpg" /> Figur 3. HOTAIR kvitre-qPCR i primær menneskelig foreskin fibroblaster. NFKBIA, HOXD3-4, SERINC5 og ABCA2 er regioner som samhandler med HOTAIR. TERC og GAPDH fungerte som negative kontroller. Mean + sd vises. Tidligere publisert i Chu et al. 2011. 17 <img alt="Figur 4." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig4.jpg" /> Figur 4. Kvitre-seq data av roX2 RNA i SL2 Drosophila celler. &quot;Even&quot; og &quot;odd&quot; ble sekvensert separat; sine data fusjonere å reflektere bare vanlige topper i begge. Det fusjonerte sporet vises. Tidligere publisert i Chu et al. 2011. 17

<ol>
	<li>Koziol, M. J., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+traffic+control+of+chromatin+complexes.">RNA traffic control of chromatin complexes.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 142-148 (2010).</li><li>Mercer, T. R., Dinger, M. E., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNAs:+insights+into+functions.">Long non-coding RNAs: insights into functions.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 155-159 (2009).</li><li>Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+demarcation+of+active+and+silent+chromatin+domains+in+human+HOX+loci+by+noncoding+RNAs.">Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs.</a> Cell. 129, 1311-1323 (2007).</li><li>Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+proteins+targeted+by+a+short+repeat+RNA+to+the+mouse+X+chromosome.">Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome.</a> Science. 322, 750-756 (2008).</li><li>Kelley, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+spreading+of+the+Drosophila+dosage+compensation+complex+from+roX+RNA+genes+into+flanking+chromatin.">Epigenetic spreading of the Drosophila dosage compensation complex from roX RNA genes into flanking chromatin.</a> Cell. 98, 513-522 (1999).</li><li>Pandey, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kcnq1ot1+antisense+noncoding+RNA+mediates+lineage-specific+transcriptional+silencing+through+chromatin-level+regulation.">Kcnq1ot1 antisense noncoding RNA mediates lineage-specific transcriptional silencing through chromatin-level regulation.</a> Mol. Cell. 32, 232-246 (2008).</li><li>Wang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+noncoding+RNA+maintains+active+chromatin+to+coordinate+homeotic+gene+expression.">A long noncoding RNA maintains active chromatin to coordinate homeotic gene expression.</a> Nature. 472, 120-124 (2011).</li><li>Khalil, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Many+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+associate+with+chromatin-modifying+complexes+and+affect+gene+expression.">Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 11667-11672 (2009).</li><li>Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq.">Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol. Cell. 40, 939-953 (2010).</li><li>Meller, V. H., Wu, K. H., Roman, G., Kuroda, M. I., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=roX1+RNA+paints+the+X+chromosome+of+male+Drosophila+and+is+regulated+by+the+dosage+compensation+system.">roX1 RNA paints the X chromosome of male Drosophila and is regulated by the dosage compensation system.</a> Cell. 88, 445-457 (1997).</li><li>Franke, A., Baker, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rox1+and+rox2+RNAs+are+essential+components+of+the+compensasome,+which+mediates+dosage+compensation+in+Drosophila.">The rox1 and rox2 RNAs are essential components of the compensasome, which mediates dosage compensation in Drosophila.</a> Mol. Cell. 4, 117-122 (1999).</li><li>Gupta, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+HOTAIR+reprograms+chromatin+state+to+promote+cancer+metastasis.">Long non-coding RNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis.</a> Nature. 464, 1071-1076 (2010).</li><li>Tsai, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNA+as+modular+scaffold+of+histone+modification+complexes.">Long noncoding RNA as modular scaffold of histone modification complexes.</a> Science. 329, 689-693 (2010).</li><li>Zappulla, D. C., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+as+a+flexible+scaffold+for+proteins:+yeast+telomerase+and+beyond.">RNA as a flexible scaffold for proteins: yeast telomerase and beyond.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol.. 71, 217-224 (2006).</li><li>Nagano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Air+noncoding+RNA+epigenetically+silences+transcription+by+targeting+G9a+to+chromatin.">The Air noncoding RNA epigenetically silences transcription by targeting G9a to chromatin.</a> Science. 322, 1717-1720 (2008).</li><li>Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+chromatin+regulatory+interactions+in+vivo.">Long-range chromatin regulatory interactions in vivo.</a> Nature. 32, 623-626 (2002).</li><li>Chu, C., Qu, K., Zhong, F. L., Artandi, S. E., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Maps+of+Long+Noncoding+RNA+Occupancy+Reveal+Principles+of+RNA-Chromatin+Interactions.">Genomic Maps of Long Noncoding RNA Occupancy Reveal Principles of RNA-Chromatin Interactions.</a> Mol. Cell. , (2011).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).</li></ol>

C. Chu og HY Chang er navngitt som oppfinnere på en patentsøknad basert på denne metoden.

Her har vi beskrevet kvitre-seq, en metode for kartlegging in vivo lncRNA bindingssteder genom-wide. De viktigste parametrene for suksess er de delte bassenger av flislegging oligonukleotid prober og glutaraldehyd crosslinking. Utformingen av affinity-prober er grei gitt RNA sekvensen og krever ingen forkunnskaper i RNA struktur eller funksjonelle domener. Vår suksess med roX2, TERC, og HOTAIR - tre ganske forskjellige RNA i to arter - antyder at kvitre-seq er sannsynlig generalizable til mange lncRNAs. Som med alle eksperimenter, er omsorg og riktig kontroller er nødvendig for å tolke resultatene. Ulike lncRNA kan kreve titrering av forholdene, og klok endring av forhold som valg av forskjellige affinitet sonder eller crosslinkers, kan fremheve ulike aspekter av RNA-kromatin interaksjoner. Som Chip-seq, ikke alle bindende hendelser er nødvendigvis funksjonelle, og flere studier er nødvendig for å fastslå de biologiske konsekvensene av RNA occupancy på kromatin. Likevel, forutser vi mange interessante anvendelser av denne teknologien for forskere fra andre kromatin-tilknyttede lncRNAs, som nå nummer i tusenvis 8,9. Akkurat som Chip-seq har åpnet døren for genom-wide undersøkelser av DNA-protein interaksjoner, kan kvitre-seq studier av den &quot;RNA interactome&quot; åpenbare mange nye muligheter for biologi.

Buffer List:
Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20&deg;C.
Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0 
10 mM EDTA 
1% SDS 
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer (for DNA)
100 mM NaCl 
10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0) 
1 mM EDTA 
0.5% SDS 
Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use
Hybridization Buffer
750 mM NaCl 
1% SDS 
50 mM Tris-Cl pH 7.0 
1 mM EDTA 
15% formamide (store in the dark at 4&deg;C) 
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use
Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock) 
0.5% SDS 
Always add PMSF fresh before use
DNA elution Buffer
50 mM NaHCO3 
1% SDS
Table of specific reagents and equipment:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (EM grade)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882-10x10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized pellet mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>V8185-904</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>78830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superase-in</td>
			<td>Ambion</td>
			<td><a href="http://www.ambion.com/catalog/CatNum.php?AM2696">AM2696</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>UCD-200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes (for sonication)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2546</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-1 magnetic beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7626-25G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-15 magnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123-01D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 magnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123-21D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIRNeasy mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase H</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>R0601K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R4875-100MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Lock Gel Heavy</td>
			<td>5 PRIME</td>
			<td>2302810</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:Isoamyl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Ricca</td>
			<td>RSOC0020-1C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9515</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4057-06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10010-049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer (EB)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x SSC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15557-036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553-027</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-free</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1906</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15515-026</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin isolation by rna purification (chirp)

Lange noncoding RNAS er sentrale regulatorer av kromatin stater for viktige biologiske prosesser som dosering kompensasjon, imprinting, og utviklingsmessige genuttrykk 1,2,3,4,5,6,7. Den nylige oppdagelsen av tusenvis av lncRNAs i forbindelse med konkrete kromatin modifisering komplekser, som Polycomb Undertrykkende Complex 2 (PRC2) som medierer histone H3 lysin 27 trimethylation (H3K27me3), foreslår brede roller for mange lncRNAs i å håndtere kromatin stater i et gen-spesifikk mote 8,9. Mens noen lncRNAs er tenkt å fungere i CIS på nærliggende gener, andre lncRNAs jobbe i trans å regulere fjernt beliggende gener. For eksempel Drosophila lncRNAs roX1 og roX2 binder mange regioner på X-kromosomet av mannlige celler, og er kritisk for dosering kompensasjon 10,11. Imidlertid er de eksakte plasseringen av deres bindingssteder ikke kjent på høy oppløsning. Tilsvarende kan mennesker lncRNA HOTAIR påvirke PRC2 belegg på hundreds av gener genom-wide 3,12,13, men hvor spesifisitet oppnås er uklart. LncRNAs kan også tjene som modulære stillasene å rekruttere montering av flere protein komplekser. Den klassiske trans-acting RNA stillaset er TERC RNA som fungerer som mal og stillaset for telomerase komplekse 14; HOTAIR kan også tjene som et stillas for PRC2 og en H3K4 demethylase kompleks 13. Tidligere studier kartlegging RNA utleiegrad på kromatin har avdekket betydelige innsikt 15,16, men bare på ett enkelt gen locus av gangen. Utleiegraden stedene i de fleste lncRNAs er ikke kjent, og rollene til lncRNAs i kromatin regulering har vært mest utledes fra de indirekte virkningene av lncRNA forstyrrelse. Akkurat som kromatin immunoprecipitation etterfulgt av microarray eller dyp-sekvensering (Chip-chip eller chip-seq, henholdsvis) har kraftig forbedret vår forståelse av protein-DNA vekselvirkninger på en genomisk skala, her vi illustrere en recently publisert strategi for å kartlegge lang RNA utleiegrad genom-wide med høy oppløsning 17. Denne metoden, Chromatin Isolering av RNA Purification (kvitring) (figur 1), er basert på slektskap fangst av målet lncRNA: kromatin kompleks av flislegging antisens-oligos, som deretter genererer et kart over genomisk bindingssteder i en oppløsning på flere hundre baser med høy følsomhet og lavt bakgrunn. Chirp er aktuelt for mange lncRNAs fordi utformingen av affinity-prober er grei gitt RNA sekvensen og krever ingen kunnskap om RNA struktur eller funksjonelle domener.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP at JoVE.com

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Chirp er en roman og rask teknikk for å kartlegge genomisk bindingssteder lange noncoding RNA (lncRNAs). Metoden utnytter den spesifisitet av anti-sense fliser oligonukleotider for å tillate opptellingen av lncRNA-bundet genomisk nettsteder.

Kromatin Isolering av RNA Purification (kvitre)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

Isolering og karakterisering av RNA som inneholder Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

In vivo Lever endocytose Etterfulgt av Rensing av leverceller av leveren Perfusjons

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolering og rensing av kinesin fra Drosophila Embryoer

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transkripsjon og tildekking av Gaussia luciferase mRNA Etterfulgt av Jakten Cell Transfeksjon

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Rapid isolering og rensing av Mitokondrier for transplantasjon Av Tissue Dissosiasjon og differensial Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Generasjon og rensing av menneske INO80 Chromatin remodeling komplekser og Subcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

RNA Isolasjon fra Mouse Pancreas: En Ribonuclease rike Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...