Name: purification and visualization of lipopolysaccharide from gram-negative bacteria by hot aqueous-phenol extraction
Uploaded: 2012-05-28T12:00:00
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Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud y la Fundación de Fibrosis Quística.

1. Preparación de las bacterias para la extracción de LPS <ol><li> Empezar un cultivo de una noche en 5 ml de caldo Luria (LB), suplementado con antibióticos si es necesario. Cultive hasta el día (12-18 horas) en una incubadora de agitación a 37 ° C y 200 rpm. </li><li> Diluir la 1:10 de cultivo con LB y tener un 600 OD lectura en un espectrofotómetro. Sobre la base de los 600 OD lectura, hacer una suspensión de 1,5 ml a las bacterias a un OD 600 de 0,5. </li><li> Sedimentar la...

<ol>
	<li>Raetz, C. R., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+endotoxins.">Lipopolysaccharide endotoxins.</a> Annu. Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).</li><li>Valvano, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Export+of+O-specific+lipopolysaccharide.">Export of O-specific lipopolysaccharide.</a> Front. Biosci. 8, 452-471 (2003).</li><li>Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide:+a+major+virulence+factor,+initiator+of+inflammation+and+target+for+effective+immunity.">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide: a major virulence factor, initiator of inflammation and target for effective immunity.</a> Int. J. Med. Microbiol. 297, 277-295 (2007).</li><li>Freudenberg, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+lipopolysaccharide+susceptibility+in+the+innate+immune+response+to+Salmonella+typhimurium+infection:+LPS,+a+primary+target+for+recognition+of+Gram-negative+bacteria.">Role of lipopolysaccharide susceptibility in the innate immune response to Salmonella typhimurium infection: LPS, a primary target for recognition of Gram-negative bacteria.</a> Microbes Infect. 3, 1213-1222 (2001).</li><li>Jann, K., Jann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharide+antigens+of+Escherichia+coli.">Polysaccharide antigens of Escherichia coli.</a> Rev. Infect. Dis. 9, S517-S526 (1987).</li><li>McCallum, K. L., Schoenhals, G., Laakso, D., Clarke, B., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-molecular-weight+fraction+of+smooth+lipopolysaccharide+in+Klebsiella+serotype+O1:K20+contains+a+unique+O-antigen+epitope+and+determines+resistance+to+nonspecific+serum+killing.">A high-molecular-weight fraction of smooth lipopolysaccharide in Klebsiella serotype O1:K20 contains a unique O-antigen epitope and determines resistance to nonspecific serum killing.</a> Infect. Immun. 57, 3816-3822 (1989).</li><li>Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+isolates+from+patients+with+cystic+fibrosis:+a+class+of+serum-sensitive,+nontypable+strains+deficient+in+lipopolysaccharide+O+side+chains.">Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis: a class of serum-sensitive, nontypable strains deficient in lipopolysaccharide O side chains.</a> Infect. Immun. 42, 170-177 (1983).</li><li>Gupta, S. K., Masinick, S., Garrett, M., Hazlett, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide+binds+galectin-3+and+other+human+corneal+epithelial+proteins.">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide binds galectin-3 and other human corneal epithelial proteins.</a> Infect. Immun. 65, 2747-2753 (1997).</li><li>Hitchcock, P. J., Brown, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+heterogeneity+among+Salmonella+lipopolysaccharide+chemotypes+in+silver-stained+polyacrylamide+gels.">Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels.</a> J. Bacteriol. 154, 269-277 (1983).</li><li>Westphal, O., Jann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lipopolysaccharides.">Bacterial lipopolysaccharides.</a> Methods Carbohyr. Chem. 5, 83 (1965).</li><li>Lieberman, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+bacterial+evolution+within+multiple+patients+ties+novel+genes+to+pathogenesis.">Parallel bacterial evolution within multiple patients ties novel genes to pathogenesis.</a> Nat Genet. , (2011).</li></ol>

Hemos descrito un método de purificación de LPS de distancia de otros componentes celulares, incluyendo los ácidos nucleicos y proteínas. Este método proporciona alta calidad de LPS que pueden ser utilizados en un número de métodos de visualización diferentes, incluyendo tinción de carbohidratos de geles de SDS-PAGE, como se muestra en la Figura 1. Este método puede ser utilizado al serotipo LPS de una variedad de cepas, utilizando anticuerpos específicos anti-sueros, o para mostrar la relación entre los ais...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> DNasa I recombinante, libre de RNasa </td><td> Roche </td><td> 04716728001 </td></tr><tr><td> RNasa A </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> Proteinasa K </td><td> Pescador </td><td> BP1700 </td></tr><tr><td> Tris-fenol saturado </td><td> Pescador </td><td> BP1750-100 </td></tr><tr><td> Éter dietílico </td><td> Thomas Scientific </td><td> C313K31 </td></tr><tr><td> Pro-Q Esmeralda 300 lipopolisacárido Kit de Gel Stain </td><td> Molecular Probes </td><td> P20495 </td></tr></tbody></table>

purification and visualization of lipopolysaccharide from gram-negative bacteria by hot aqueous-phenol extraction

Lipopolisacárido (LPS) es un componente importante de bacterias Gram-negativas membranas externas de bacterias. Es una molécula tripartito compuesto de lípido A, que está incrustada en la membrana exterior, un núcleo de oligosacáridos y repetición de O-antígeno unidades que se extienden hacia fuera desde la superficie de la célula 1, 2. LPS es una molécula inmunodominante que es importante para la virulencia y patogénesis de muchas especies de bacterias, incluyendo Pseudomonas aeruginosa, especies de Salmonella, Escherichia coli y 3-5, y las diferencias en forma LPS composición antígeno O-la base para serotipado de las cepas. LPS está implicado en la unión a las células huésped en el inicio de la infección y proporciona protección contra la muerte mediada por complemento; cepas que carecen de LPS puede ser atenuada para la virulencia 6-8. Por estas razones, es importante visualizar LPS, particularmente a partir de aislados clínicos. LPS Visualización de los patrones de bandas y el reconocimiento por una específicantibodies pueden ser herramientas útiles para identificar linajes de tensión y para caracterizar distintos mutantes. En este informe, se describe un acuosa caliente-fenol método para el aislamiento y purificación de LPS de bacterias Gram-negativas células bacterianas. Este protocolo permite la extracción de LPS de distancia a partir de ácidos nucleicos y proteínas que pueden interferir con la visualización de LPS que se produce con más cortos, los métodos de extracción menos intensivas 9. LPS preparado de esta manera se pueden separar por dodecil sulfato sódico (SDS)-poliacrilamida electroforesis en gel (PAGE) y se tiñeron utilizando directamente carbohidrato / glicoproteína manchas o estándar métodos de tinción de plata. Muchos anti-sueros a LPS contienen anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con las proteínas de membrana externa u otros objetivos antigénicos que pueden obstaculizar la reactividad observados después de inmunotransferencia Western de SDS-PAGE-separados lisados ​​celulares crudos. Tratamiento de la proteasa de lisados ​​celulares crudos por sí solos no siempre es una manera eficaz de eliminar estede fondo de usar este u otros métodos de visualización. Además, el tratamiento de la proteasa extensa en un intento de eliminar este fondo puede llevar a LPS de baja calidad que no está bien resueltas por cualquiera de los métodos antes mencionados. Por estas razones, creemos que el protocolo siguiente, adaptado de Westpahl y Jann 10, es ideal para la extracción de LPS.

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Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Se describe una modificación acuosa caliente-fenol método de extracción para la purificación de lipopolisacárido (LPS) de bacterias Gram-negativas. Una vez extraído, el LPS puede ser seguidamente analizadas por SDS-PAGE y se visualizaron mediante tinción directa o inmunotransferencia Western.

La purificación y la visualización de lipopolisacárido de bacterias Gram-negativas por Hot acuosa de fenol-Extracción

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Research

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