Name: purification and visualization of lipopolysaccharide from gram-negative bacteria by hot aqueous-phenol extraction
Uploaded: 2012-05-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction at JoVE.com

Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institutes of Health och cystisk fibros Foundation.

1. Beredning av bakterier för LPS Extraction <ol><li> Starta en odling över natten i 5 ml Luria Broth (LB), kompletterat med antibiotika om så är nödvändigt. Växa kultur över natten (12-18 timmar) i en skakinkubator vid 37 ° C och 200 rpm. </li><li> Späd kulturen 1:10 med LB och ta en OD 600 behandlingen i en spektrofotometer. Baserat på OD 600 läsning, gör en 1,5 ml suspension av dina bakterier till en OD 600 av 0,5. </li><li> Pelletera bakterier i en mikrocentrifug vid 1...

<ol>
	<li>Raetz, C. R., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+endotoxins.">Lipopolysaccharide endotoxins.</a> Annu. Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).</li><li>Valvano, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Export+of+O-specific+lipopolysaccharide.">Export of O-specific lipopolysaccharide.</a> Front. Biosci. 8, 452-471 (2003).</li><li>Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide:+a+major+virulence+factor,+initiator+of+inflammation+and+target+for+effective+immunity.">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide: a major virulence factor, initiator of inflammation and target for effective immunity.</a> Int. J. Med. Microbiol. 297, 277-295 (2007).</li><li>Freudenberg, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+lipopolysaccharide+susceptibility+in+the+innate+immune+response+to+Salmonella+typhimurium+infection:+LPS,+a+primary+target+for+recognition+of+Gram-negative+bacteria.">Role of lipopolysaccharide susceptibility in the innate immune response to Salmonella typhimurium infection: LPS, a primary target for recognition of Gram-negative bacteria.</a> Microbes Infect. 3, 1213-1222 (2001).</li><li>Jann, K., Jann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharide+antigens+of+Escherichia+coli.">Polysaccharide antigens of Escherichia coli.</a> Rev. Infect. Dis. 9, S517-S526 (1987).</li><li>McCallum, K. L., Schoenhals, G., Laakso, D., Clarke, B., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-molecular-weight+fraction+of+smooth+lipopolysaccharide+in+Klebsiella+serotype+O1:K20+contains+a+unique+O-antigen+epitope+and+determines+resistance+to+nonspecific+serum+killing.">A high-molecular-weight fraction of smooth lipopolysaccharide in Klebsiella serotype O1:K20 contains a unique O-antigen epitope and determines resistance to nonspecific serum killing.</a> Infect. Immun. 57, 3816-3822 (1989).</li><li>Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+isolates+from+patients+with+cystic+fibrosis:+a+class+of+serum-sensitive,+nontypable+strains+deficient+in+lipopolysaccharide+O+side+chains.">Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis: a class of serum-sensitive, nontypable strains deficient in lipopolysaccharide O side chains.</a> Infect. Immun. 42, 170-177 (1983).</li><li>Gupta, S. K., Masinick, S., Garrett, M., Hazlett, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide+binds+galectin-3+and+other+human+corneal+epithelial+proteins.">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide binds galectin-3 and other human corneal epithelial proteins.</a> Infect. Immun. 65, 2747-2753 (1997).</li><li>Hitchcock, P. J., Brown, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+heterogeneity+among+Salmonella+lipopolysaccharide+chemotypes+in+silver-stained+polyacrylamide+gels.">Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels.</a> J. Bacteriol. 154, 269-277 (1983).</li><li>Westphal, O., Jann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lipopolysaccharides.">Bacterial lipopolysaccharides.</a> Methods Carbohyr. Chem. 5, 83 (1965).</li><li>Lieberman, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+bacterial+evolution+within+multiple+patients+ties+novel+genes+to+pathogenesis.">Parallel bacterial evolution within multiple patients ties novel genes to pathogenesis.</a> Nat Genet. , (2011).</li></ol>

Vi har beskrivit ett förfarande för rening av LPS från andra cellulära komponenter, inklusive nukleinsyror och proteiner. Denna metod tillhandahåller hög kvalitet LPS som kan användas i ett antal olika visualisering metoder, inklusive kolhydrat-färgning av SDS-PAGE-geler, såsom visas i figur 1. Denna metod kan användas för att serotypa LPS från olika stammar, med användning av specifika anti-sera, eller för att visa släktskap mellan isolat genom direkt visualisering. Till exempel en nyligen Genomvid sekve...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> DNas I rekombinant, RNas-fri </td><td> Roche </td><td> 04716728001 </td></tr><tr><td> RNas A </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> Proteinas K </td><td> Fisher </td><td> BP1700 </td></tr><tr><td> Tris-mättad fenol </td><td> Fisher </td><td> BP1750-100 </td></tr><tr><td> Dietyleter </td><td> Thomas Scientific </td><td> C313K31 </td></tr><tr><td> Pro-Q Emerald 300 Lipopolysackarid Gel Stain Kit </td><td> Molecular Probes </td><td> P20495 </td></tr></tbody></table>

purification and visualization of lipopolysaccharide from gram-negative bacteria by hot aqueous-phenol extraction

Lipopolysackarid (LPS) är en huvudkomponent i Gram-negativa bakteriella yttre membranen. Det är en tredelad molekyl bestående av lipid A, som är inbäddad i det yttre membranet, en kärna oligosackarid och upprepande O-antigenenheter som sträcker sig utåt från ytan av cellen 1, 2. LPS är en immundominant molekyl som är viktig för virulens och patogenesen för många bakteriearter, inklusive Pseudomonas aeruginosa, Salmonella-arter, och Escherichia coli 3-5, och skillnader i LPS O-antigen komposition utgör grunden för serotypning av stammar. LPS är involverad i anslutning till värdceller i början av infektionen och ger skydd mot komplement-medierad dödande, stammar som saknar LPS kan dämpas för virulens 6-8. Av dessa skäl är det viktigt att visualisera LPS, i synnerhet från kliniska isolat. Visualisera LPS bandmönster och erkännande av särskilda enntibodies kan vara användbara för att identifiera stam linjer och för att karakterisera olika mutanter. I denna rapport beskriver vi en varm vattenhaltig fenol-metoden för isolering och rening av LPS från Gram-negativa bakterieceller. Detta protokoll möjliggör utvinning av LPS bort från nukleinsyror och proteiner som kan interferera med visualisering av LPS som inträffar med kortare och mindre intensiva extraktionsmetoder 9. LPS framställdes på detta sätt kan separeras genom natriumdodecylsulfat (SDS)-polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) och direkt färgas med användning av kolhydrat / glykoprotein fläckar eller standard silver metoder missfärgning. Många anti-sera mot LPS innehålla antikroppar som korsreagerar med yttermembranproteiner eller andra mål antigena som annars skulle hämma reaktivitet observerades efter Western immunoblotting med SDS-PAGE-separerade råa cell-lysat. Proteasbehandling av råa cellysat enbart är inte alltid ett effektivt sätt att avlägsna dennabakgrunden med denna eller andra metoder visualisering. Vidare kan omfattande proteas behandling i ett försök att avlägsna denna bakgrund att leda till dålig kvalitet LPS som inte är väl upplösta genom någon av de förutnämnda metoderna. Av dessa skäl anser vi att följande protokoll, anpassas från Westpahl och Jann 10, är idealisk för LPS extraktion.

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction at JoVE.com

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Vi beskriver en modifierad varm vattenhaltig-fenolextraktion förfarande för rening av lipopolysackarid (LPS) från Gram-negativa bakterier. Gång extraherades kan LPS därefter analyseras med SDS-PAGE och visualiserades genom direkt färgning eller Western immunoblotting.

Rening och visualisering av lipopolysackarid från Gram-negativa bakterier genom varm vattenhaltig fenol Extraktion

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Rening av specifik cell Befolkningen efter Fluorescens Aktivt cellsortering (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol PEG Precipitation

IgY Teknik: Utvinning av Kyckling Antikroppar från äggula med polyetylenglykol (PEG) Nederbörd

Hens can be immunized by means of  i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume  0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Rening av patogener vakuoler från<em&gt; Legionella</em&gt;-Infekterade Fagocyter

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

A Method for Generating Pulmonary Neutrophilia Using Aerosolized Lipopolysaccharide

En metod för att generera Pulmonell neutrofili Använda aerosoliserad Lipopolysackarid

Acute lung injury (ALI) is a severe disease characterized by alveolar neutrophilia, with limited treatment options and high mortality. Experimental models ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Snabb identifiering av gramnegativa bakterier från Blood Culture Broth Använda MALDI-TOF masspektrometri

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Tillämpning av fluorescerande nanopartiklar för att studera Ombyggnad av Endo-lysosomala System från intracellulära bakterier

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

T-celler Fånga Bakterier från Transinfection från dendritiska celler

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

Bestämning av biofilm Initiation på virusinfekterade celler av bakterier och svampar

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Isolering, karakterisering och rening av makrofager från vävnader som påverkas av fetma-relaterade Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

Dissekera multi signalering proteinkomplex av Bimolecular komplettering affinitet rening (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...