Name: retrograde fluorescent labeling allows for targeted extracellular single-unit recording from identified neurons in vivo
Uploaded: 2013-06-26T12:00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo at JoVE.com

Finansiering fra National Science Foundation (IOS-1.050.701 til BAC), National Institutes of Health (NS54174 til SM og F30DC0111907 til AML-W.), Er Uehara Memorial Foundation og Japan Society for fremme af Science (G2205 til TK ). Vi takker Julian Meeks for hans støtte og vejledning om emnet ekstracellulære axonale optagelser. Vi takker Carl Hopkins til tilvejebringelse af en prototype optagelse kammer.

<ol>
	<li>Meeks, J. P., Jiang, X., Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potential+fidelity+during+normal+and+epileptiform+activity+in+paired+soma-axon+recordings+from+rat+hippocampus.">Action potential fidelity during normal and epileptiform activity in paired soma-axon recordings from rat hippocampus.</a> J. Physiol. 566, 425-441 (2005).</li><li>Pinault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+single-cell+staining+procedure+performed+in+vivo+under+electrophysiological+control:+morpho-functional+features+of+juxtacellularly+labeled+thalamic+cells+and+other+central+neurons+with+biocytin+or+Neurobiotin.">A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin.</a> J. Neurosci. Methods. 65, 113-136 (1996).</li><li>Joshi, S., Hawken, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loose-patch-juxtacellular+recording+in+vivo--a+method+for+functional+characterization+and+labeling+of+neurons+in+macaque+V1.">Loose-patch-juxtacellular recording in vivo--a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1.</a> J. Neurosci. Methods. 156, 37-49 (2006).</li><li>Margrie, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+whole-cell+recordings+in+the+mammalian+brain+in+vivo.">Targeted whole-cell recordings in the mammalian brain in vivo.</a> Neuron. 39, 911-918 (2003).</li><li>Lima, S. Q., Hrom&#225;dka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINP:+A+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording.">PINP: A new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4, e6099 (2009).</li><li>Foust, A., Popovic, M., Zecevic, D., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials+initiate+in+the+axon+initial+segment+and+propagate+through+axon+collaterals+reliably+in+cerebellar+Purkinje+neurons.">Action potentials initiate in the axon initial segment and propagate through axon collaterals reliably in cerebellar Purkinje neurons.</a> J. Neurosci. 30, 6891-6902 (2010).</li><li>Lehman, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+as+a+transneuronal+tracer.">Herpes simplex virus as a transneuronal tracer.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 22, 695-708 (1998).</li><li>Joris, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dogged+pursuit+of+coincidence.">A dogged pursuit of coincidence.</a> J. Neurophysiol. 96, 969-972 (2006).</li><li>Heiligenberg, W., Rose, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+and+amplitude+computations+in+the+midbrain+of+an+electric+fish:+Intracellular+studies+of+neurons+participating+in+the+jamming+avoidance+response+of+Eigenmannia.">Phase and amplitude computations in the midbrain of an electric fish: Intracellular studies of neurons participating in the jamming avoidance response of Eigenmannia.</a> J. Neurosci. 5, 515-531 (1985).</li><li>Morales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Releasing+the+peri-neuronal+net+to+patch-clamp+neurons+in+adult+CNS.">Releasing the peri-neuronal net to patch-clamp neurons in adult CNS.</a> Pfl&#252;gers Archiv European J. Physiol. 448, 248-258 (2004).</li><li>Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+for+species+recognition+in+the+time-coding+electrosensory+pathway+of+mormyrid+electric+fish.">Neural substrates for species recognition in the time-coding electrosensory pathway of mormyrid electric fish.</a> J. Neurosci. 18, 1171-1185 (1998).</li><li>Hitschfeld, &. #. 2. 0. 1. ;. M., Stamper, S. A., Vonderschen, K., Fortune, E. S., Chacron, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+restraint+and+immobilization+on+electrosensory+behaviors+of+weakly+electric+fish.">Effects of restraint and immobilization on electrosensory behaviors of weakly electric fish.</a> ILAR. J. 50, 361-372 (2009).</li><li>Xu-Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+mechanisms+of+temporal+analysis+in+the+knollenorgan+pathway+of+mormyrid+electric+fish.">Central mechanisms of temporal analysis in the knollenorgan pathway of mormyrid electric fish.</a> J. Exp. Biol. 202, 1311-1318 (1999).</li><li>Amagai, S., Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+coding+in+the+midbrain+of+mormyrid+electric+fish.+I.+Physiology+and+anatomy+of+cells+in+the+nucleus+exterolateralis+pars+anterior.">Time coding in the midbrain of mormyrid electric fish. I. Physiology and anatomy of cells in the nucleus exterolateralis pars anterior.</a> J. Comp. Physiol. A: Neuroethol Sens Neural. Behav. Physiol. 182, 115-130 (1998).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bull World Health Organ. 2, 143-144 (1965).</li><li>Carlson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal-pattern+recognition+by+single+neurons+in+a+sensory+pathway+devoted+to+social+communication+behavior.">Temporal-pattern recognition by single neurons in a sensory pathway devoted to social communication behavior.</a> J. Neurosci. 29, 9417-9428 (2009).</li><li>Mugnaini, E., Maler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytology+and+immunocytochemistry+of+the+nucleus+extrolateralis+anterior+of+the+mormyrid+brain:+possible+role+of+GABAergic+synapses+in+temporal+analysis.">Cytology and immunocytochemistry of the nucleus extrolateralis anterior of the mormyrid brain: possible role of GABAergic synapses in temporal analysis.</a> Anat Embryol. (Berl). 176, 313-336 (1987).</li><li>Kohashi, T., Lyons-Warren, A. M., Mennerick, S., Carlson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+submillisecond+spike+timing+differences+based+on+delay-line+anticoincidence+detection.">Detection of submillisecond spike timing differences based on delay-line anticoincidence detection.</a> J. Neurophysiol. 110, 2295-2311 (2013).</li><li>Colin, W., Donoff, R. B., Foote, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+latex+microspheres+as+a+retrograde+tracer+in+the+peripheral+nervous+system.">Fluorescent latex microspheres as a retrograde tracer in the peripheral nervous system.</a> Brain Res. 486, 334-339 (1989).</li><li>Katz, L. C., Burkhalter, A., Dreyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+latex+microspheres+as+a+retrograde+neuronal+marker+for+in+vivo+and+in+vitro+studies+of+visual+cortex.">Fluorescent latex microspheres as a retrograde neuronal marker for in vivo and in vitro studies of visual cortex.</a> Nature. 310, 498-500 (1984).</li><li>Brown, S. P., Hestrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracortical+circuits+of+pyramidal+neurons+reflect+their+long-range+axonal+targets.">Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets.</a> Nature. 457, 1133-1136 (2009).</li><li>Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+recording+from+identifiable+neurons+of+the+locomotor+network+in+the+developing+zebrafish.">In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish.</a> J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).</li><li>Pollak, G. D., Burger, R. M., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+circuitry+of+the+auditory+system.">Dissecting the circuitry of the auditory system.</a> Trends Neurosci. 26, 33-39 (2003).</li><li>Wurtz, R. H., Albano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual-motor+function+of+the+primate+superior+colliculus.">Visual-motor function of the primate superior colliculus.</a> Annu. Rev. Neurosci. 3, 189-226 (1980).</li><li>O'Malley, D. M., Zhou, Q., Gahtan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+neural+circuits+in+the+zebrafish:+a+suite+of+optical+techniques.">Probing neural circuits in the zebrafish: a suite of optical techniques.</a> Methods. 30, 49-63 (2003).</li><li>Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+techniques+for+tracing+pathways+in+the+central+nervous+system+of+developing+and+adult+mammals.">Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals.</a> Brain Res. Bull. 51, 11-28 (2000).</li><li>Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+with+cellular+resolution+reveals+precise+micro-architecture+in+visual+cortex.">Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex.</a> Nature. 433, 597-603 (2005).</li><li>Gahtan, E., O'Malley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+lesioning+of+large+numbers+of+identified+vertebrate+neurons:+applications+in+zebrafish.">Rapid lesioning of large numbers of identified vertebrate neurons: applications in zebrafish.</a> J. Neurosci. Methods. 108, 97-110 (2001).</li><li>Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lucifer+Yellow+slows+voltage-gated+Na++current+inactivation+in+a+light-dependent+manner+in+mice.">Lucifer Yellow slows voltage-gated Na+ current inactivation in a light-dependent manner in mice.</a> J. Physiol. 550, 159-167 (2003).</li><li>Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+voltage-sensitive+dyes+modulate+GABAA+receptor+function.">Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function.</a> J. Neurosc. 30, 2871-2879 (2010).</li><li>Oxford, G. S., Pooler, J. P., Narahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+and+external+application+of+photodynamic+sensitizers+on+squid+giant+axons.">Internal and external application of photodynamic sensitizers on squid giant axons.</a> J. Membr. Biol. 36, 159-173 (1977).</li><li>Roberts, T. F., Tschida, K. A., Klein, M. E., Mooney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spine+stabilization+and+synaptic+enhancement+at+the+onset+of+behavioural+learning.">Rapid spine stabilization and synaptic enhancement at the onset of behavioural learning.</a> Nature. 463, 948-952 (2010).</li><li>Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+nonlinear+optical+imaging:+beyond+fluorescence+microscopy.">Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).</li><li>Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+three-dimensional+fluorescence+imaging+of+activity+in+neural+populations+by+objective-coupled+planar+illumination+microscopy.">Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy.</a> Neuron. 57, 661-672 (2008).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

Når mestrer, vil denne teknik tillader en at målrette identificerede neuroner, herunder individuelle axoner, til in vivo optagelser i mange modelsystemer. Desuden giver denne teknik ét til pålideligt optage spike output fra neuroner med unikke anatomiske karakteristika, der gør traditionelle in vivo indspilningsmetoder udfordrende. Vi har udnyttet denne teknik til at optage fra ela &quot;små celler&quot; i mormyrid svagt elektrisk fisk. Tidligere forsøg på at studerer tuning egenskaber af &quot;små celler&quot; var mislykkedes på grund af udfordrende optageforhold 11, 14. Lignende anatomiske træk skabe hindringer for opnåelse af single-unit optagelser fra mange forskellige hvirveldyr auditive og electrosensory neuroner 8-10. For at overvinde disse udfordringer i vores system, vi tog fordel af det faktum, at &quot;små celler&quot; er de eneste celler i ela at projekt til ELP. Således retrograd transport af farvestof placeret i ELP begrænser mærkning ela til &quot;smallcelle &quot;SOMA og axoner. Fluorescerende mærkning af axoner tilladt præcis elektrodeplacering siden mærkede axoner, hvilket gør single-unit optagelser fra identificerede celler muligt til trods utilgængelige SOMA. Vi har forsøgt somatiske optagelser, men forgæves, sandsynligvis på grund af de omgivende altopslugende synapser 11 , 17.. var imidlertid somatisk mærkning tydeligt antyder, at denne teknik kan anvendes til at målrette somatiske optagelser i andre celletyper og andre kredsløb. Fluorescerende mærkning af neuroner gennem retrograd transport i vivo er blevet anvendt til at styre målrettede optagelser in vitro 19-21 . En lignende teknik blev brugt til målrettet in vivo optagelser fra motoriske neuroner i zebrafisk rygmarven 22.. Vores arbejde repræsenterer en ny udvidelse af denne tilgang, hvor både mærkning og registrering er færdig in vivo i hjernen. Vores metode viser, at in vivo mærkning af CNS områder med en retrograd tracer kan udvides til undersøgelse af andre intakte kredsløb med tilsvarende selektive projektion neuroner. For eksempel, i pattedyr auditive behandling inferior colliculus (IC) tjener som en vigtig relæ center for input fra flere rhombencephalic strukturer 23. Farvestof injektion i IC selektivt ville mærke de projektion celler fra hver af disse kerner. Den overlegne colliculus (SC) serverer en lignende funktion for visioner 24.. Rygmarv præparater er særligt velegnet til denne teknik, da rygmarven nemt tilgås, kan farvestof injektion forekomme langt fra optagelsen site, og det kan kombineres med intracellulær optagelse og fyldning af udvalgte neuroner at erhverve mere detaljerede anatomiske oplysninger 25.. Endelig tarmkanalen-sporing er en veletableret teknik, der anvendes i hele det centrale nervesystem til at kortlægge komplekse kredsløb 26. Vores metode kan anvendes til at tilføje funktionel information til disse undersøgelser, som er blevet gjort wed calcium-sensitive indikatorer i cat visuelle cortex 27.. Operationen, som er veletableret, pålidelig, og anvendes regelmæssigt til blinde in vivo optagelser 16, skal udfyldes med minimal blødning og ingen skader på overfladen af hjernen for at tillade dyret og væv til at overleve. Med praksis, kan kirurgi og farvestoffet ansøgning være afsluttet i 30-45 minutter. Vi har med held mærket &quot;småcellet&quot; axoner i 67% af forberedelserne. De fleste præparater har kun 1 eller 2 synlige mærkede axoner, men nogle har så mange som 8. Af de 119 mærket forsøgt enheder opnåede vi single-unit optagelser fra 26 enheder fordelt over 12 præparater (tabel 2). Således blev der indsamlet data fra 41% af præparater med mærket axoner til en samlet succesrate på 28%. Den kritiske aspekt af farvestof ansøgning mærkning dybde. Lavvandet indsættelse af wolfram ledning vil resultere i farvestoffet bliver vasket away. Men hvis indtrængningen er for dybt, vil mærket axoner ikke være synlig for målretning. Endvidere må nogle mekaniske skader på cellen forekomme farvestoffet til at blive tilstrækkeligt taget op 25, 28. Imidlertid vil for meget skade dræbe cellerne. Vi forsøgte mærkning med andre farvestoffer og andre metoder (tabel 2), herunder anterograd mærkning gennem farvestof injektion i ela parret med optagelse fra mærkede axoner i ELP (tabel 3). Vi hypotesen, at anterograd mærkningen ikke var en succes, fordi mærkning var begrænset til celler med somatiske skader, hvilket gør dem reagerer. Derudover kan præsynaptiske terminaler være blevet forstyrret. Derimod minimerer retrograd mærkning begge disse bekymringer. Mængden og placeringen af ​​farvestof ansøgning kan ændres i henhold til den særlige kredsløb blive undersøgt. Maksimal mærkning sker med den største farvestofkoncentrationen, som vi opnåede ved hjælp af belagte wolfram ledninger. Men for mærkning axoner med deep fremskrivninger kan farvestof kommet fra en tungsten nål, som det er avanceret. I disse tilfælde vil trykindsprøjtning være mere passende. Farvestofoptagelse og transport er hurtig, med mærkede axoner i vores forberedelse bliver synlig så tidligt som 2 timer efter injektion og yderligere mærket axoner optræder så sent som 6 timer efter injektion. Således kan mærkning og registrering ske på en enkelt dag, fjerne tekniske vanskeligheder forbundet med overlevelse kirurgi. Timing vil variere for hver applikation afhængigt af afstanden kræves for farvestof transport. Et andet kritisk aspekt er elektrodeplacering. Det er vigtigt at indtaste væv tæt på webstedet af det mærkede axon at forhindre tilstopning af spidsen. For tæt væv, såsom i Ela minimerer en lang, tynd skaft på optagelsen elektroden overskydende bevægelse af omgivende væv. Hvis det lykkes optagelse ikke opnås ved første forsøg, gentag med friske elektroderne, indtil en optagelse er opnået, eller Tissue er forstyrret til det punkt, hvor Axon ikke længere er synlig. Men det er også vigtigt hurtigt at placere elektroden ved siden Axon at minimere mængden af fluorescerende eksponering, hvilket kan forårsage fototoksicitet, blegning og kan påvirke fysiologiske egenskaber af cellen 29-31. Når et segment af Axon succesfuldt suges ind i elektrode, kan optagelser opnås i flere timer. Hvis enhederne konsekvent tabt i mindre end 1 time, overveje at gøre mindre elektrode tips til at forhindre Axon glide ud. På den anden side kan en for lille spids resultere i tilstopning, lavt signal-til-støj, eller skade på Axon. En støt fald i spike amplitude og &quot;tilbagevenden &#39;af en enhed med ekstra sug er en indikation af, at spidsen er for stor. For meget sugning kan forårsage uoprettelig skade på Axon. En løsning er at tillade en lille læk i luftledningen så trykket langsomt vender tilbage til nul. Hurtigt udligne the tryk vil resultere i en forbigående relativ-passiv &quot;push&quot;, som kan udvise Axon. Selv om denne teknik er en stor fordel for at opnå målrettede optagelser fra identificerede projektion neuroner, vil det ikke være nyttigt for at skelne lokale interneuroner, som farvestof vil blive taget op af alle celletyper på injektionsstedet. Teoretisk kan brug af flere fluorophores med separate injektionssteder tillade denne metode, der skal udvides. For eksempel kunne sammenligning af enkelt-versus dobbelt-mærkning anvendes til at skelne interneuroner fra projektion neuroner efter dobbelt injektioner på to punkter i kredsløbet 32.. Tilsvarende kan retrograd sporstoffer kombineres med andre avancerede billeddiagnostiske teknikker, såsom to-foton billedbehandling, som det skete for nylig i zebra finke High Vocal center (HVC) 32. Også, du optager områder begrænset til dem nær overfladen, når du bruger epifluorescens mikroskoper, som vi var kun i stand til at løse 1 &amp;mu, m strukturer inden for de første 30 um af væv. Imidlertid kunne denne dybde udvides ved brug af andre mikroskopi teknikker, såsom to-foton mikroskopi 33 eller objektiv koblede plane belysning mikroskopi 34.. Samlet denne teknik er et vigtigt fremskridt i studiet af neurale kredsløb in vivo, fordi det kan bruges til at optage fra enkelte neuroner i mange forskellige kredsløb i en række modelsystemer - herunder dem, der er relativt utilgængelige.

<table border="1" cellspacing="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tricaine Methanesulfonate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E10521</td>
 <td>MS-222</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gallamine Triethiodide </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8134</td>
 <td>Flaxedil</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lidocaine Hydrochloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>L5647</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hickman's Ringer Solution </td>
 <td>NA</td>
 <td>NA</td>
 <td>NaCl (6.48 g/l), KCl (0.15 g/l), CaCl2&bull;2H20 (0.29 g/l), MgSO4 (0.12 g/l), NaHCO3 (0.084 g/l), NaH2PO4 (0.06 g/l)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peristaltic Pump</td>
 <td>Gilson or Rainin</td>
 <td>Minipulse 3 Model 312; RP-1</td>
 <td>10.0 &plusmn; 1.0 rpm, Alternatively, a gravity-fed line with a flow-meter</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection Microscope </td>
 <td>Nikon</td>
 <td>SM2645</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Super Glue</td>
 <td>Super Glue Corporation</td>
 <td>SGH2</td>
 <td>2g tube</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Omni Drill 35</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>503-598</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ball Mill Carbide Drill Bit #1/4</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501860</td>
 <td>0.19 DIA (bit diameter = 0.48 mm) </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low Temp Cautery Kit</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>500391</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manual Micromanipulator</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>M3301R</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dextran Conjugated Alexa Fluor 568</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>D-22912</td>
 <td>2mM concentration; 10,000MW The choice of dye wavelength should be selected to match the microscope filter settings</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epifluorescent Microscope</td>
 <td>Nikon </td>
 <td>E600 FN</td>
 <td>A remote focus accessory is helpful for fine focus TRITC filter - or appropriate filter to match focal planes for different dye wavelengths</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low Power Objective</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>93182</td>
 <td>CFI Plan Achromat Series, 4X N.A. 0.1, W.D. 30mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High Power Objective</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>93148</td>
 <td>CFI Fluor Series, 40X WI N.A. 0.8, W.D. 2.0 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>White Light Source</td>
 <td>Dolan-Jenner</td>
 <td>Model 190</td>
 <td>Fiber Optic Illuminator</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent Light Source </td>
 <td>Lumen Dynamics</td>
 <td>X-Cite 120Q</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low-light Level Camera</td>
 <td>Photometrics</td>
 <td>CoolSnap ES</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Digital Manometer</td>
 <td>Omega Engineering</td>
 <td>HHP-201</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Motorized Micromanipulator</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>MP-285</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Headstage</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>CV-7B</td>
 <td>Axon Instruments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amplifier</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>MultiClamp 700B</td>
 <td>Axon Instruments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Data Acquisition System</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>Digidata 1322A</td>
 <td>Axon Instruments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Isolated Pulse Stimulator</td>
 <td>A-M Systems</td>
 <td>2100</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>P-97</td>
 <td>Program settings for our application: Heat: ramp + 1, Pull: '0', Velocity: 60, Time: 90 Box filament</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipette Glass</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>1B100F-4</td>
 <td>Borosilicate capillary glass with filament (1 mm OD, 0.58 mm ID) </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

retrograde fluorescent labeling allows for targeted extracellular single-unit recording from identified neurons in vivo

Det overordnede mål med denne metode er at optage single-unit svar fra en identificeret population af neuroner. In vivo elektrofysiologiske optagelser fra de enkelte neuroner er afgørende for at forstå, hvordan neurale kredsløb fungerer under naturlige forhold. Traditionelt har disse optagelser udført i blinde &quot;, hvilket betyder, at identiteten af ​​den konstaterede celle er ukendt ved begyndelsen af ​​optagelsen. Cellular identitet kan efterfølgende bestemmes via intracellulære 1 juxtacellular 2 eller løs-patch 3 iontophoresis farvestof, men disse optagelser kan ikke på forhånd rettet mod bestemte neuroner i regioner med funktionelt heterogene celletyper. Fluorescerende proteiner kan udtrykkes i en celle-typespecifik måde tillader visuelt guidet encellede elektrofysiologi 4-6. Men der er mange modelsystemer som disse genetiske værktøjer ikke er tilgængelige. Selv i genetisk tilgængelige modelsystemer, det ønskede promoter kan være ukendt eller genetisk homogene neuroner kan have varierende projektion mønstre. Tilsvarende er virale vektorer blevet anvendt til at mærke specifikke undergrupper af projektion neuroner 7, men brugen af denne metode er begrænset af toksicitet og mangel på trans-synaptisk specificitet. Således er yderligere teknikker, der tilbyder særlige pre-visualisering til at optage fra identificerede enkeltstoffer neuroner in vivo nødvendig. Pre-visualisering af målet neuron er særlig anvendelig til udfordrende optageforholdene, hvor klassiske encellede optagelser ofte uoverkommeligt vanskelig 8-11. Den nye teknik beskrevet i denne meddelelse anvender retrograd transport af et fluorescerende farvestof anvendes ved hjælp wolfram nåle til hurtigt og selektivt mærke en specifik undergruppe af celler inden for en bestemt område af hjernen baseret på deres unikke aksonal fremspring, hvorved der tilvejebringes en visuel at opnå målrettede elektrofysiologiske optagelser fra identificerede neuroner i en intakt kredsløb withina hvirveldyr CNS. Den mest markante roman udvikling af vores metode er brugen af ​​fluorescerende mærkning til at målrette specifikke celletyper i en ikke-genetisk tilgængelig modelsystem. Svagt elektrisk fisk er en fremragende model system til at studere neurale kredsløb i vågen tilstand, opfører dyr 12.. Vi udnyttet denne teknik til at studere sensorisk behandling med &quot;små celler&quot; i den forreste exterolateral kerne (ELA), i svagt elektrisk mormyrid fisk. &quot;Små celler&quot; er en hypotese at være tid komparator neuroner vigtige til påvisning submillisecond forskelle i ankomsttider for præsynaptiske pigge 13.. Imidlertid har anatomiske træk såsom tæt myelin, opsluger synapser, og små cellelegemer gjort det yderst vanskeligt at optage fra disse celler ved hjælp af traditionelle metoder 11, 14. Her viser vi, at vores ny metode selektivt mærker disse celler i 28% af præparater, der giver mulighed for pålidelige, robuste optagelser og charactefinitioner, godkendelse af svar til electrosensory stimulation.

Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo at JoVE.com

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograd transport af fluorescerende farvestof mærker en sub-population af neuroner baseret på anatomiske projektion. Mærkede axoner kan visuelt målrettes<em&gt; In vivo</em&gt;, Tillader ekstracellulær optagelse fra identificerede axoner. Denne teknik gør det lettere at optage, når neuroner ikke kan mærkes gennem genetisk manipulation eller er vanskelige at isolere med &#39;blinde&#39;<em&gt; In vivo</em&gt; Tilgange.

Retrograd fluorescensmærkning Tillader Målrettet Extracellular Single-unit Optagelse fra Identificerede Neuroner<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Identified by Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamic Slices

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating ...

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Information about the visual world is transmitted to the brain in sequences of action potentials in retinal ganglion cell axons that make up the optic ...

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

Kirurgisk implantation af Kroniske Neurale elektroder til Optagelse Single Unit Aktivitet og Electrocorticographic signaler

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Samtidig optagelse af calcium Signaler fra Identificerede Neuroner og spiseadfærd af Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Optagelse elektrisk aktivitet fra Identificerede Neuroner i ubeskadiget Brain af transgene fisk

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Intracellulær Optagelse, Sensory Field Mapping, og dyrkning Identificerede neuroner i Leech, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

Retrograd Mærkning af retina-ganglieceller i Voksen Zebrafisk med fluorescerende farvestoffer

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

En guide til<em&gt; In vivo</em&gt; Single-enhed Optagelse fra Optogenetically identificeret Cortical Inhibitory interneuroner

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Perforeret Patch-clamp Registrering af Mouse Olfactory sensoriske neuroner i Intakt neuroepithelium: Funktionel analyse af neuroner udtrykker en identificeret odorantreceptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...