Name: retrograde fluorescent labeling allows for targeted extracellular single-unit recording from identified neurons in vivo
Uploaded: 2013-06-26T12:00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo at JoVE.com

Los fondos de la Fundación Nacional para la Ciencia (IOS-1050701 a BAC), los Institutos Nacionales de Salud (NS54174 a SM y F30DC0111907 de AML-W.), La Fundación Uehara Memorial de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (G2205 a los conocimientos tradicionales ). Damos las gracias a Julian Meeks por su apoyo y orientación sobre el tema de las grabaciones extracelulares axonal. Damos las gracias a Carl Hopkins para proporcionar una cámara de registro prototipo.

<ol>
	<li>Meeks, J. P., Jiang, X., Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potential+fidelity+during+normal+and+epileptiform+activity+in+paired+soma-axon+recordings+from+rat+hippocampus.">Action potential fidelity during normal and epileptiform activity in paired soma-axon recordings from rat hippocampus.</a> J. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loose-patch-juxtacellular+recording+in+vivo--a+method+for+functional+characterization+and+labeling+of+neurons+in+macaque+V1.">Loose-patch-juxtacellular recording in vivo--a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1.</a> J. Neurosci. Methods. 156, 37-49 (2006).</li><li>Margrie, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+whole-cell+recordings+in+the+mammalian+brain+in+vivo.">Targeted whole-cell recordings in the mammalian brain in vivo.</a> Neuron. 39, 911-918 (2003).</li><li>Lima, S. Q., Hrom&#225;dka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINP:+A+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording.">PINP: A new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4, e6099 (2009).</li><li>Foust, A., Popovic, M., Zecevic, D., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials+initiate+in+the+axon+initial+segment+and+propagate+through+axon+collaterals+reliably+in+cerebellar+Purkinje+neurons.">Action potentials initiate in the axon initial segment and propagate through axon collaterals reliably in cerebellar Purkinje neurons.</a> J. Neurosci. 30, 6891-6902 (2010).</li><li>Lehman, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+as+a+transneuronal+tracer.">Herpes simplex virus as a transneuronal tracer.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 22, 695-708 (1998).</li><li>Joris, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dogged+pursuit+of+coincidence.">A dogged pursuit of coincidence.</a> J. Neurophysiol. 96, 969-972 (2006).</li><li>Heiligenberg, W., Rose, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+and+amplitude+computations+in+the+midbrain+of+an+electric+fish:+Intracellular+studies+of+neurons+participating+in+the+jamming+avoidance+response+of+Eigenmannia.">Phase and amplitude computations in the midbrain of an electric fish: Intracellular studies of neurons participating in the jamming avoidance response of Eigenmannia.</a> J. Neurosci. 5, 515-531 (1985).</li><li>Morales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Releasing+the+peri-neuronal+net+to+patch-clamp+neurons+in+adult+CNS.">Releasing the peri-neuronal net to patch-clamp neurons in adult CNS.</a> Pfl&#252;gers Archiv European J. Physiol. 448, 248-258 (2004).</li><li>Friedman, M. A., Hopkins, C. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+mechanisms+of+temporal+analysis+in+the+knollenorgan+pathway+of+mormyrid+electric+fish.">Central mechanisms of temporal analysis in the knollenorgan pathway of mormyrid electric fish.</a> J. Exp. Biol. 202, 1311-1318 (1999).</li><li>Amagai, S., Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+coding+in+the+midbrain+of+mormyrid+electric+fish.+I.+Physiology+and+anatomy+of+cells+in+the+nucleus+exterolateralis+pars+anterior.">Time coding in the midbrain of mormyrid electric fish. I. Physiology and anatomy of cells in the nucleus exterolateralis pars anterior.</a> J. Comp. Physiol. A: Neuroethol Sens Neural. Behav. 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Neurosci. 29, 9417-9428 (2009).</li><li>Mugnaini, E., Maler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytology+and+immunocytochemistry+of+the+nucleus+extrolateralis+anterior+of+the+mormyrid+brain:+possible+role+of+GABAergic+synapses+in+temporal+analysis.">Cytology and immunocytochemistry of the nucleus extrolateralis anterior of the mormyrid brain: possible role of GABAergic synapses in temporal analysis.</a> Anat Embryol. (Berl). 176, 313-336 (1987).</li><li>Kohashi, T., Lyons-Warren, A. M., Mennerick, S., Carlson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+submillisecond+spike+timing+differences+based+on+delay-line+anticoincidence+detection.">Detection of submillisecond spike timing differences based on delay-line anticoincidence detection.</a> J. Neurophysiol. 110, 2295-2311 (2013).</li><li>Colin, W., Donoff, R. B., Foote, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+latex+microspheres+as+a+retrograde+tracer+in+the+peripheral+nervous+system.">Fluorescent latex microspheres as a retrograde tracer in the peripheral nervous system.</a> Brain Res. 486, 334-339 (1989).</li><li>Katz, L. C., Burkhalter, A., Dreyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+latex+microspheres+as+a+retrograde+neuronal+marker+for+in+vivo+and+in+vitro+studies+of+visual+cortex.">Fluorescent latex microspheres as a retrograde neuronal marker for in vivo and in vitro studies of visual cortex.</a> Nature. 310, 498-500 (1984).</li><li>Brown, S. P., Hestrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracortical+circuits+of+pyramidal+neurons+reflect+their+long-range+axonal+targets.">Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets.</a> Nature. 457, 1133-1136 (2009).</li><li>Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+recording+from+identifiable+neurons+of+the+locomotor+network+in+the+developing+zebrafish.">In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish.</a> J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).</li><li>Pollak, G. D., Burger, R. 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Methods. 108, 97-110 (2001).</li><li>Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lucifer+Yellow+slows+voltage-gated+Na++current+inactivation+in+a+light-dependent+manner+in+mice.">Lucifer Yellow slows voltage-gated Na+ current inactivation in a light-dependent manner in mice.</a> J. Physiol. 550, 159-167 (2003).</li><li>Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+voltage-sensitive+dyes+modulate+GABAA+receptor+function.">Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function.</a> J. Neurosc. 30, 2871-2879 (2010).</li><li>Oxford, G. S., Pooler, J. P., Narahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+and+external+application+of+photodynamic+sensitizers+on+squid+giant+axons.">Internal and external application of photodynamic sensitizers on squid giant axons.</a> J. Membr. Biol. 36, 159-173 (1977).</li><li>Roberts, T. F., Tschida, K. A., Klein, M. E., Mooney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spine+stabilization+and+synaptic+enhancement+at+the+onset+of+behavioural+learning.">Rapid spine stabilization and synaptic enhancement at the onset of behavioural learning.</a> Nature. 463, 948-952 (2010).</li><li>Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+nonlinear+optical+imaging:+beyond+fluorescence+microscopy.">Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).</li><li>Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+three-dimensional+fluorescence+imaging+of+activity+in+neural+populations+by+objective-coupled+planar+illumination+microscopy.">Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy.</a> Neuron. 57, 661-672 (2008).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Una vez dominado, esta técnica permitirá una para apuntar a las neuronas identificadas, incluyendo los axones individuales en grabaciones in vivo en muchos sistemas modelo. Además, esta técnica permite grabar fiable de salida de pico de las neuronas con características anatómicas únicas que lo hacen tradicional en métodos de grabación que desafían in vivo. Hemos utilizado esta técnica para grabar desde ELA &quot;pequeñas células&quot; en mormyrid peces débilmente eléctrica. Los intentos anteriores para estudiar las propiedades de ajuste de &quot;celdas pequeñas&quot; no tuvieron éxito debido a las condiciones difíciles de grabación 11, 14. Características anatómicas similares crean barreras para obtener grabaciones de una sola unidad de diversos vertebrados y neuronas auditivas electrosensoriales 8-10. Para superar estos retos de nuestro sistema, tomamos ventaja del hecho de que &quot;células pequeñas&quot; son las únicas células en ELA que proyectan a ELP. Por lo tanto, el transporte retrógrado de colorante colocado en ELP limita etiquetado en ELA para &quot;pequeña&quot;somas celulares y axones. etiquetado fluorescente de los axones permite la colocación precisa del electrodo al lado de los axones marcados, por lo que las grabaciones de una sola unidad de células identificadas posibles a pesar de somas inaccesibles. Se intentó grabaciones somáticas, pero no tuvieron éxito, probablemente debido a las sinapsis envolventes alrededor de 11 , 17. Sin embargo, somática etiquetado era claramente visible lo que sugiere que esta técnica podría ser utilizada para orientar grabaciones somáticas en otros tipos de células y otros circuitos. etiquetado fluorescente de las neuronas a través de transporte retrógrado in vivo se ha usado para guiar grabaciones específicas in vitro 19-21 . Una técnica similar se utiliza para dirigido en grabaciones in vivo de las neuronas motoras en la médula espinal pez cebra 22. Nuestro trabajo representa una nueva expansión de este enfoque, en el que tanto el etiquetado y la grabación se realiza in vivo en el cerebro. Nuestro método demuestra que en vivo etiquetado de las áreas del sistema nervioso central con una retrógrada tcorredor se puede ampliar para el estudio de otros circuitos intactos con las neuronas de proyección similar selectivos. Por ejemplo, en el procesamiento auditivo mamífero, el colículo inferior (CI) sirve como un centro de retransmisión importante para las entradas de múltiples estructuras rhombencephalic 23. Inyección de un contraste en el IC se etiquete selectivamente las células de proyección de cada uno de estos núcleos. El colículo superior (SC) cumple una función similar para la visión 24. Preparaciones de médula espinal son particularmente adecuados para esta técnica, como la médula espinal es de fácil acceso, la inyección de medio de contraste puede ocurrir lejos del sitio de registro, y que se pueden combinar con el registro intracelular y el llenado de las neuronas seleccione para adquirir información más detallada anatómica 25. Finalmente, el trazado de las vías es una técnica bien establecida usada en todo el sistema nervioso central para asignar circuitos complejo 26. Nuestro método se puede utilizar para añadir información funcional a estos estudios como se ha hecho windicadores sensibles al calcio ith de gato corteza visual 27. La cirugía, que está bien establecida, fiable, y se usa regularmente para ciego in vivo grabaciones 16, debe ser completada con un sangrado mínimo y ningún daño a la superficie del cerebro para permitir que el animal y el tejido para sobrevivir. Con la práctica, la aplicación de la cirugía y el tinte se puede completar en 30-45 minutos. Hemos marcado con éxito &quot;pequeñas células&quot; axones en el 67% de las preparaciones. La mayoría de las preparaciones de tener sólo 1 o 2 axones marcados visibles, pero algunos tienen el mayor número 8. De las 119 unidades etiquetadas intentos, se obtuvo grabaciones de una sola unidad de 26 unidades distribuidas en 12 preparaciones (Tabla 2). Por lo tanto, los datos se obtuvieron de 41% de las preparaciones con axones etiquetados para una tasa de éxito del 28%. El aspecto crítico de la aplicación de tinte es el etiquetado profundidad. Poca inserción del alambre de tungsteno dará lugar a que el colorante de ser lavada away. Sin embargo, si la penetración es demasiado profunda, los axones marcados no serán visibles para la orientación. Además, algunos daños mecánicos en la celda debe ocurrir para que el medio de contraste para ser tomada adecuadamente hasta 25, 28. Sin embargo, demasiado daño matará a las células. Hemos intentado marcar con otros tintes y otros métodos (Tabla 2), incluido el etiquetado anterógrada a través de inyección de tinta en ELA junto con la grabación de los axones marcados en ELP (Tabla 3). Nuestra hipótesis es que el etiquetado anterógrada no tuvo éxito porque el etiquetado se limita a las células con daños somáticos, por lo que no responde. Además, los terminales presinápticos pueden haber sido perturbado. Por el contrario, el etiquetado retrógrada minimiza tanto de estas preocupaciones. La cantidad y la ubicación de la aplicación del colorante pueden ser modificados de acuerdo con el circuito particular que está siendo estudiado. Etiquetado máxima se produce con la mayor concentración de colorante, lo que hemos logrado con alambres de tungsteno recubiertas. Sin embargo, para la rotulación de los axones conproyecciones ep, colorante podrían salir de una aguja de tungsteno, ya que es avanzado. En estos casos, la inyección de presión sería más apropiado. La absorción de colorante y el transporte son rápidos, con los axones marcados en nuestra preparación son visibles tan temprano como 2 horas después de la inyección y los axones marcados adicionales que aparecen tan tarde como 6 horas después de la inyección. Por lo tanto, el etiquetado y registro pueden llevarse a cabo en un solo día, la eliminación de dificultades técnicas asociadas con la cirugía de la supervivencia. El tiempo variará para cada aplicación en función de la distancia necesaria para el transporte de tinte. Otro aspecto crítico es la colocación de electrodos. Es importante para entrar en el tejido cerca del sitio del axón marcado para evitar la obstrucción de la punta. Para tejido denso como en ELA, un largo, pierna delgada en el electrodo de registro minimiza el movimiento excesivo de los tejidos circundantes. Si una grabación correcta no se consigue en el primer intento, repita con electrodos frescos hasta que se obtiene una grabación o el TISSue se interrumpe hasta el punto en el que el axón es ya no es visible. Sin embargo, también es importante para colocar rápidamente el electrodo al lado del axón para reducir al mínimo la cantidad de exposición fluorescente, que puede causar fototoxicidad, blanqueo y puede afectar a las propiedades fisiológicas de la célula 29-31. Una vez que un segmento de axón se filtra con succión con éxito en el electrodo de registro, las grabaciones se puede conseguir por varias horas. Si las unidades se pierden constantemente en menos de 1 hora, considerar la posibilidad de puntas de los electrodos más pequeños para prevenir el axón se deslice fuera. Por otra parte, demasiado pequeño de una punta puede dar lugar a la obstrucción, baja relación señal-ruido, o daños en el axón. Una disminución constante de la amplitud de la espiga y el &quot;retorno&quot; de una unidad con succión adicional es una indicación de que la punta es demasiado grande. El exceso de aspiración puede causar daños irreparables en el axón. Una solución es permitir que una pequeña fuga en la línea de aire para que la presión lentamente vuelve a cero. Rápidamente igualar ªpresión e dará lugar a un &quot;empuje&quot; relativa-transitoria de salida que puede expulsar al axón. Aunque esta técnica representa una gran ventaja para la obtención de grabaciones específicas de las neuronas de proyección identificados, no será útil para distinguir interneuronas locales, como colorante estaría ocupado por todos los tipos de células en el sitio de la inyección. Teóricamente, el uso de múltiples fluoróforos con distintos lugares de inyección puede permitir que este método se expanda. Por ejemplo, la comparación de un solo frente de doble etiquetado podría ser utilizado para distinguir interneuronas de las neuronas de proyección después de las inyecciones de doble en dos puntos en el circuito 32. Del mismo modo, los trazadores retrógrados se pueden combinar con otras técnicas de imagen avanzadas, tales como la imagen de dos fotones, como se hizo recientemente en el centro de Vocal zebra finch High (HVc) 32. Además, las regiones de grabación se limitan a los que están cerca de la superficie cuando se utiliza microscopios de epifluorescencia, ya que sólo hemos sido capaces de resolver 1 &amp;mu; estructuras m dentro de los primeros 30 micras de tejido. Sin embargo, esta profundidad se podría extender a través de la utilización de otras técnicas de microscopía, como la microscopía de dos fotones 33 u objetivo-junto microscopía de iluminación plana 34. En general, esta técnica representa un avance importante en el estudio de los circuitos neuronales in vivo, ya que puede ser utilizado para grabar desde las neuronas individuales en muchos circuitos diferentes en una variedad de sistemas de modelos - incluyendo aquellos que son relativamente inaccesibles.

<table border="1" cellspacing="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tricaine Methanesulfonate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E10521</td>
 <td>MS-222</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gallamine Triethiodide </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8134</td>
 <td>Flaxedil</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lidocaine Hydrochloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>L5647</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hickman's Ringer Solution </td>
 <td>NA</td>
 <td>NA</td>
 <td>NaCl (6.48 g/l), KCl (0.15 g/l), CaCl2&bull;2H20 (0.29 g/l), MgSO4 (0.12 g/l), NaHCO3 (0.084 g/l), NaH2PO4 (0.06 g/l)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peristaltic Pump</td>
 <td>Gilson or Rainin</td>
 <td>Minipulse 3 Model 312; RP-1</td>
 <td>10.0 &plusmn; 1.0 rpm, Alternatively, a gravity-fed line with a flow-meter</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection Microscope </td>
 <td>Nikon</td>
 <td>SM2645</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Super Glue</td>
 <td>Super Glue Corporation</td>
 <td>SGH2</td>
 <td>2g tube</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Omni Drill 35</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>503-598</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ball Mill Carbide Drill Bit #1/4</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501860</td>
 <td>0.19 DIA (bit diameter = 0.48 mm) </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low Temp Cautery Kit</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>500391</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manual Micromanipulator</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>M3301R</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dextran Conjugated Alexa Fluor 568</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>D-22912</td>
 <td>2mM concentration; 10,000MW The choice of dye wavelength should be selected to match the microscope filter settings</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epifluorescent Microscope</td>
 <td>Nikon </td>
 <td>E600 FN</td>
 <td>A remote focus accessory is helpful for fine focus TRITC filter - or appropriate filter to match focal planes for different dye wavelengths</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low Power Objective</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>93182</td>
 <td>CFI Plan Achromat Series, 4X N.A. 0.1, W.D. 30mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High Power Objective</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>93148</td>
 <td>CFI Fluor Series, 40X WI N.A. 0.8, W.D. 2.0 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>White Light Source</td>
 <td>Dolan-Jenner</td>
 <td>Model 190</td>
 <td>Fiber Optic Illuminator</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent Light Source </td>
 <td>Lumen Dynamics</td>
 <td>X-Cite 120Q</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low-light Level Camera</td>
 <td>Photometrics</td>
 <td>CoolSnap ES</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Digital Manometer</td>
 <td>Omega Engineering</td>
 <td>HHP-201</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Motorized Micromanipulator</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>MP-285</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Headstage</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>CV-7B</td>
 <td>Axon Instruments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amplifier</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>MultiClamp 700B</td>
 <td>Axon Instruments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Data Acquisition System</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>Digidata 1322A</td>
 <td>Axon Instruments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Isolated Pulse Stimulator</td>
 <td>A-M Systems</td>
 <td>2100</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>P-97</td>
 <td>Program settings for our application: Heat: ramp + 1, Pull: '0', Velocity: 60, Time: 90 Box filament</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipette Glass</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>1B100F-4</td>
 <td>Borosilicate capillary glass with filament (1 mm OD, 0.58 mm ID) </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

retrograde fluorescent labeling allows for targeted extracellular single-unit recording from identified neurons in vivo

El objetivo general de este método consiste en registrar las respuestas de una sola unidad de una población seleccionada de las neuronas. En los registros electrofisiológicos in vivo de neuronas individuales son fundamentales para la comprensión de cómo funcionan los circuitos neuronales en condiciones naturales. Tradicionalmente, estas grabaciones se han realizado &quot;a ciegas&quot;, es decir, la identidad de la célula registrada es desconocido al inicio de la grabación. Identidad celular puede determinarse posteriormente mediante intracelular 1, juxtacellular 2 o sueltas-patch 3 iontoforesis de tinte, pero estas grabaciones no se puede pre-dirigido a neuronas específicas en regiones con tipos de células funcionalmente heterogéneas. Las proteínas fluorescentes se pueden expresar de una manera específica del tipo de célula que permite visualmente guiada por electrofisiología de una sola célula 4-6. Sin embargo, hay muchos sistemas modelo para el que estas herramientas genéticas no están disponibles. Incluso en sistemas de modelos genéticamente accesibles, el programa deseadopromotor puede ser desconocida o neuronas genéticamente homogéneos puede haber diferentes patrones de proyección. Del mismo modo, los vectores virales se han utilizado para etiquetar los subgrupos específicos de las neuronas de proyección 7, pero el uso de este método está limitada por la toxicidad y la falta de especificidad trans-sináptica. Por lo tanto, se necesitan técnicas adicionales que ofrecen pre-visualización específica para grabar desde neuronas individuales identificados in vivo. Pre-visualización de la neurona diana es particularmente útil para condiciones de grabación desafiantes, para los que las grabaciones de una sola célula clásicos a menudo son prohibitivamente difícil 8-11. La novedosa técnica descrita en este documento se utiliza el transporte retrógrado de un colorante fluorescente aplicada, utilizando agujas de tungsteno para etiquetar rápidamente y selectivamente un subconjunto específico de células dentro de una región particular del cerebro sobre la base de sus proyecciones axonales únicas, proporcionando de ese modo una señal visual para obtener registros electrofisiológicos dirigidos de las neuronas identificadas en un circuito intacto withina vertebrado SNC. La novela avance más significativo de nuestro método es el uso de etiquetado fluorescente para apuntar a tipos de células específicos en un sistema modelo accesible no genéticamente. Débilmente peces eléctricos son un excelente sistema modelo para el estudio de los circuitos neuronales en despierto, comportándose los animales 12. Hemos utilizado esta técnica para estudiar el procesamiento sensorial de &quot;células pequeñas&quot; en el núcleo exterolateral anterior (ELA) de peces mormyrid débilmente eléctrica. &quot;Células pequeñas&quot; son la hipótesis de que el tiempo de comparación neuronas importantes para detectar diferencias submillisecond en los tiempos de llegada de los picos presináptica 13. Sin embargo, las características anatómicas tales como la mielina densa, que envuelve las sinapsis, y cuerpos celulares pequeños han hecho extremadamente difícil para grabar a partir de estas células utilizando métodos tradicionales 11, 14. Aquí nos demuestran que nuestro método novedoso etiqueta selectivamente estas células en el 28% de los preparativos, lo que permite, grabaciones robustos y fiables caracrización de las respuestas a la estimulación electrosensory.

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Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Transporte retrógrado de tinte fluorescente etiqueta a una subpoblación de neuronas en base a la proyección anatómica. Axones etiquetadas pueden orientarse visualmente<em&gt; In vivo</em&gt;, Que permite la grabación extracelular de los axones identificados. Esta técnica facilita la grabación cuando las neuronas no se pueden etiquetar a través de la manipulación genética o son difíciles de aislar el uso de &quot;ciego&quot;<em&gt; In vivo</em&gt; Enfoques.

Marcaje fluorescente retrógrada Permite dirigida extracelular sola unidad de grabación de neuronas identificadas<em&gt; En vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Identified by Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamic Slices

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

Las grabaciones de doble somáticas de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) identificados por la proteína verde fluorescente (GFP) en cortes de hipotálamo

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating ...

Investigación

Neurociencias

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Una sola unidad En vivo Grabaciones de la quiasma óptico de la rata

Information about the visual world is transmitted to the brain in sequences of action potentials in retinal ganglion cell axons that make up the optic ...

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

Etiquetado DiOLISTIC de las neuronas de los roedores y no humanos rodajas de cerebro de los primates

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

La implantación quirúrgica de electrodos neuronales crónicas para registrar la actividad y señales de una sola unidad electrocorticográfica

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

La grabación simultánea de señales de calcio en neuronas identificadas y comportamiento de alimentación de Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Registro de la actividad eléctrica de las neuronas identificadas en el cerebro intacto de peces transgénicos

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Intracelular de grabación, Sensorial Asignación de campos, y el cultivo de neuronas identificadas en el Leech, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

Etiquetado retrógrada de células ganglionares retinianas en adultos de pez cebra con tintes fluorescentes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Una guía para<em&gt; En vivo</em&gt; Single-unidad de grabación de Optogenetically Identificado cortical inhibitorio interneuronas

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Perforado grabación de patch-clamp de ratón neuronas sensoriales olfativas en neuroepitelio Intacto: Análisis funcional de las neuronas que expresan un odorante del receptor Identificado

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...