Name: affinity precipitation of active rho-gefs using a gst-tagged mutant rho protein (gst-rhoa(g17a)) from epithelial cell lysates
Uploaded: 2012-03-31T13:00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates at JoVE.com

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الكندي للبحوث الصحية (CIHR) (MOP-97774)، والعلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC، ومنحة NR: 480619). كانساس هو حاصل على جائزة محقق جديد KRESCENT (جائزة مشتركة لمؤسسة الكلى من كندا، والكندي جمعية أمراض الكلى والمعهد الكندي للبحوث الصحية)، وجائزة الباحث في وقت مبكر من وزارة أونتاريو للبحوث والابتكار. معتمد من قبل مهاجم شينغ لي كا منحة دراسية.

<ol>
	<li>Jaffe, A. B., Hall, A. R. h. o. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPases:+biochemistry+and+biology.">GTPases: biochemistry and biology.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 247-269 (2005).</li><li>Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEF+means+go:+turning+on+RHO+GTPases+with+guanine+nucleotide-exchange+factors.">GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 167-180 (2005).</li><li>Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPLN,+a+guanine+nucleotide+exchange+factor+for+RhoA+and+RhoB,+but+not+RhoC.">XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC.</a> J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).</li><li>Garcia-Mata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+activated+GAPs+and+GEFs+in+cell+lysates.">Analysis of activated GAPs and GEFs in cell lysates.</a> Methods Enzymol. 406, 425-437 (2006).</li><li>Kakiashvili, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEF-H1+Mediates+Tumor+Necrosis+Factor-{alpha}-induced+Rho+Activation+and+Myosin+Phosphorylation:+role+in+the+regulation+of+tubular+paracellular+permeability.">GEF-H1 Mediates Tumor Necrosis Factor-{alpha}-induced Rho Activation and Myosin Phosphorylation: role in the regulation of tubular paracellular permeability.</a> J. Biol. Chem. 284, 11454-11466 (2009).</li><li>Waheed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+signal+regulated+kinase+and+GEF-H1+mediate+depolarization-induced+Rho+activation+and+paracellular+permeability+increase.">Extracellular signal regulated kinase and GEF-H1 mediate depolarization-induced Rho activation and paracellular permeability increase.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. , (2010).</li><li>Kakiashvili, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermal+growth+factor+receptor+mediates+tumor+necrosis+factor-alpha-induced+activation+of+the+ERK/GEF-H1/RhoA+pathway+in+tubular+epithelium.">The epidermal growth factor receptor mediates tumor necrosis factor-alpha-induced activation of the ERK/GEF-H1/RhoA pathway in tubular epithelium.</a> J. Biol. Chem. 286, 9268-9279 (2011).</li><li>Garcia-Mata, R., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catching+a+GEF+by+its+tail.">Catching a GEF by its tail.</a> Trends Cell Biol. 17, 36-43 (2007).</li><li>Dubash, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+GTPase+RhoA+localizes+to+the+nucleus+and+is+activated+by+Net1+and+DNA+damage+signals.">The small GTPase RhoA localizes to the nucleus and is activated by Net1 and DNA damage signals.</a> PLoS One. 6, e17380-e17380 (2011).</li><li>Guilluy, G., Dubash, A. D., Garc&#237;a-Mata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RhoA+and+Rho+GEF+activity+in+whole+cells+and+the+cell+nucleus.">Analysis of RhoA and Rho GEF activity in whole cells and the cell nucleus.</a> Nature Protocols. , (2011).</li><li>Guilluy, C., Swaminathan, V., Garcia-Mata, R., O'Brien, E. T., Superfine, R., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+GEFs+LARG+and+GEF-H1+regulate+the+mechanical+response+to+force+on+integrins.">The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins.</a> Nature Cell Biology. 13, 722-727 (2011).</li><li>Dubash, A. D., Wennerberg, K., Garcia-Mata, R., Menold, M. M., Arthur, W. T., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Lsc/p115+RhoGEF+and+LARG+in+regulating+RhoA+activity+downstream+of+adhesion+to+fibronectin.">A novel role for Lsc/p115 RhoGEF and LARG in regulating RhoA activity downstream of adhesion to fibronectin.</a> J. Cell Sci. 120, 3989-3998 (2007).</li><li>Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPLN,+a+guanine+nucleotide+exchange+factor+for+RhoA+and+RhoB,+but+not+RhoC.">XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC.</a> J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

الطريقة المعروضة هنا هو متاح فقط فحص التنشيط غير المشعة لGEFs التي يمكن أن تتبع تجمع نشط من GEFs في الخلايا. الفحص مشابه لفحوصات هطول الأمطار تستخدم لتنشيط التالية من GTPases الصغيرة وكذلك GEFs ضد طلب وCdc42. هذه المقايسات استخدام مختلف ضريبة السلع والخدمات الموسومة البروتينات وبيننا اختلاف طفيف من واحد وصفها هنا، ولكن الخطوات الأساسية هي نفسها. وبالتالي، يمكن بسهولة هذا البروتوكول يمكن تكييفها لGTPase الصغيرة الأخرى والمقايسات تفعيل مرفق البيئة العالمية. تعديل لمرفق البيئة العالمية مؤخرا الفحص المقدمة للتطبيق للكسور النووية 9،10. مع مزيد من التعديلات، قد اختبار تفعيل مرفق البيئة العالمية في مقصورات التحت خلوية أخرى يكون من الممكن أيضا. نحن نستخدم طريقة عرض لدراسة تفعيل GEFs في خطوط الخلايا الظهارية 5،6،7. مع بعض التحسين، وهذا ينبغي أن تكون كافية لفحص الكشف عن GEFs من أي خط الخلية. عندما adaptiنانوغرام إلى نوع من الخلايا المحددة، والعثور على عدد الخلايا الأمثل، وتحلل حجم العازلة، وطريقة الكشف عن مرفق البيئة العالمية لفحصها (الأجسام المضادة جيدة للغرب النشاف هو المهم). من أجل الإعداد الأولي للفحص فإنه من المستحسن استخدام التحفيز ما هو معروف لتفعيل مرفق البيئة العالمية من اهتمام. عند استخدام الحوافز غير معروف، ودائما استخدام عنصر تحكم إيجابي للتحقق من أن الفحص الخاص بك يعمل. ويمكن استخدام هذا الفحص للكشف عن تفعيل GEFs معروفة من قبل النشاف الغربية. ومع ذلك، فإنه هو أيضا مناسبة للتعرف على GEFs غير معروف. لهذا، ينبغي تحليل GEFs تم الاستيلاء عليها من مراقبة وعينات حفز على مادة هلامية Coomassie الملطخة. قد العصابات التي تظهر فقط في عينات تحتوي على حفز GEFs تفعيلها، ويمكن أن ترسل لتحديد الهوية بواسطة الطيف الكتلي (على سبيل المثال 5). وأخيرا، هناك ملاحظة تحذيرية. ويستند الفحص على افتراض أن يتم الاحتفاظ التعديلات posttranslational تقديم GEFs نشط بعد تحلل الخلية. في الواقع، وهذا هو واضح في كاليفورنياسراج الدين لعدد من GEFs، ومنذ إنشائها، وقد استخدم هذا الاختبار من قبل مختلف المجموعات للكشف عن تفعيل GEFs مختلفة، بما في ذلك مرفق البيئة العالمية-H1، p115RhoGEF وXPLN (على سبيل المثال 5،11،12،13). المحافظة على حالة نشطة لكن قد لا يحدث في حالة جميع GEFs، وبالتالي فإنه من الممكن تصور أن هذا الاختبار لن تعمل لجميع GEFs. كما أن لديها الجدير بالذكر، أن العديد من GEFs بذل نشاط نحو أكثر من واحد GTPases الصغيرة. وبالتالي، عندما يتم درس مرفق معين، فمن المستحسن لاستكمال هذا الاختبار مع المقايسات هطول الأمطار مرفق البيئة العالمية للGTPases الصغيرة الأخرى، فضلا عن الدراسات الفنية بدراسة RhoA، Rac1 وCdc42. خطوات حاسمة في البروتوكول: وينبغي أن ينتبه مستعمرات من البكتيريا تحول من لوحات، طازجة أعدت بشكل صحيح لضمان الاختيار الملائم من قبل أمبير، ثمرة جيدة والعائد. قد تحول الظروف للخلايا المختصة التي تم الحصول عليها من مصادر أخرى تختلف وينبغي استشارة. </p&gt; يجب أن يتم تنفيذ كل الخطوات من البروتين إعداد بروتوكول (من الخطوة 2.3) وفحص و(من الخطوة 3.2) في 4 درجات مئوية مع حلول تبريد وأجهزة الطرد المركزي. وينبغي أن تحلل الجرثومي (الخطوة 2.5) تكون شاملة وكاملة من أجل الحصول على تعليق متجانسة. عندما lysing للبكتيريا، ودوامة ماصة للالمحللة بالتناوب، مع الحفاظ عليه في درجة مئوية (4) وضمان ان يتم صوتنة على الجليد لمنع تبديل طبيعة البروتين. إذا باستخدام نموذج مختلف من sonicator، قد الظروف هناك حاجة الى تعديلها. وينبغي دائما حضانة يصوتن مع حبات ينبغي القيام به في 4 درجات مئوية على محور دوار لضمان ملزم كاف، وينبغي توخي الحذر للحفاظ على توقيت ثابت. ضريبة السلع والخدمات، رو المسوخ غير مستقرة إلى حد ما عندما أعرب في البكتيريا، ولذلك فمن الأفضل استخدام الخرز معدة على الفور أو في غضون بضعة أيام. الفحص هطول الأمطار (الجزء 3) هو وقت حساس ودرجة الحرارة، وهوويمكن S GEFs نشط خسر بسهولة من المحللة خلية، ينبغي القيام بالخطوات ذلك في أسرع وقت ممكن. المقطع التالي يحتوي على بعض النصائح حل المشاكل. لا أو كمية قليلة جدا من البروتين رو متحولة في إعداد حبة النهائي: قد يكون سبب هذا الاستقراء غير فعال، تحلل كافية من البكتيريا، أو فقدان للبروتين أثناء عملية الإعداد أو التخزين. للمساعدة في استكشاف بعض من هذه الاحتمالات، يمكن تحليل عينات من البكتيريا قبل وبعد الاستقراء. إذا كان هناك تحريض الفقراء من البروتين تكرار هذه العملية باستخدام مستعمرة من لوحة يشوبه طازجة أو من إعادة تحويل خلايا المختصة. وينبغي أيضا تركيزات IPTG وأوقات مختلفة الاستقراء يتم اختبارها. ويمكن إذا ما تحلل ليست كافية (أي البروتين يبقى في بيليه بدلا من طاف) متفاوتة الملح والمنظفات تركيزات في المخزن المؤقت تحلل يحاكم. مرات صوتنة المناوبين ووينبغي النظر في الضبط، ويمكن التحقق من العينات قبل وبعد صوتنة بواسطة الفحص المجهري لتحديد كفاءة تحلل. عجل لا مرفق البيئة العالمية، على الرغم من أن ضريبة السلع والخدمات من البروتين موجود على حبات: قد يكون هذا بسبب مشاكل تقنية خلال فحص هطول الأمطار، أو من خلال غياب حقيقي لتفعيل مرفق البيئة العالمية درست باستخدام التحفيز تطبيقها. استخدم دائما حافزا يعرف باسم مراقبة إيجابية للتحقق من أن الفحص الخاص بك يعمل. استخدام الخرز المعدة في غضون بضعة أيام. إذا كان فحص ترسيب يلتقط كميات لا يمكن اكتشافها من مرفق البيئة العالمية دراسة في جميع الأحوال، تحقق من أن مرفق البيئة العالمي الخاص موجودا وقابلا للاكتشاف بئر في طاف بعد الطرد المركزي التي يتم استخدامها لفحص (الخطوة 3.3). تأكد من أن جميع المخازن ومثبطات الأنزيم البروتيني هي جديدة، وتنفيذ كافة الخطوات على الجليد في أسرع وقت ممكن. زيادة كمية البروتين المدخلات (على سبيل المثال من خلال استخدام لوحات lysates في الفترة من 2 / عينة). إذا كان فحص ترسيب يظهر precipi القاعديةإتباع ذلك مرفق البيئة العالمية، ولكن ينظر لا فرق بين الرقابة وعينات حفز (الشكل 4)، وبدء استكشاف الأخطاء وإصلاحها من خلال التحقق من أن تطبيق حافز يعمل باستخدام غيرها من الآثار المعروفة (على سبيل المثال عن طريق الكشف عن تنشيط المسارات الأخرى مما يشير). النظر في تغيير شروط العلاج و / أو تجمعات. تعتمد على بيانات من التقارير الأدب كيفية التحفيز الخاص ينشط رو أو إشارات أخرى للتنبؤ مرات على الأرجح وتركيزات. عندما تحسين وقت العلاج، واستخدام كل نقاط زمنية قصيرة وطويلة، ومرفق البيئة العالمية التنشيط قد يكون أفضل للكشف في وقت لوقت قبل تفعيل رو اكتشاف جيد. أخيرا، يمكن أن يؤدي إلى تحفيز نفسه درجة مختلفة من التنشيط بسبب تغيير في استجابة الخلية الناجمة عن عدد مرور، خلية confluency، الخ.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليق (اختياري) </td></tr><tr><td> pGEX-RhoA (G17A) </td><td> Addgene </td><td> وسوف تكون متاحة قريبا </td><td> ولدت في مختبر الدكتور كيث بوريدج (جامعة ولاية كارولينا الشمالية) (المرجع 3) </td></tr><tr><td> DH5α </td><td> إينفيتروجن </td><td> 18258-012 </td><td> تخزين -80 درجة مئوية </td></tr><tr><td> SOC المتوسطة </td><td> BioShop </td><td> SOC001.10 </td><td></td></tr><tr><td> LB </td><td> BioShop </td><td> LBL407.1 </td><td> تبقى عقيمة </td></tr><tr><td> الغليسيرول </td><td> BioShop </td><td> GLY002.1 </td><td></td></tr><tr><td> أمبيسيلين </td><td> BioShop </td><td> AMP201.25 </td><td> الأوراق المالية في مخزن -20 درجة مئوية </td></tr><tr><td> أجار </td><td> BioShop </td><td> AGR001.500 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (إيزوبروبيل BD-thiogalacto-pyranoside) </td><td> Calbio الكيميائي </td><td> 420322 </td><td> مخزن حل الأوراق المالية في -20 درجة مئوية </td></tr><tr><td> الجلوتاثيون sepharose و الخرز </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> 17-0756-01 </td><td></td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> SIGMA </td><td> D1408 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> SIGMA </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> BioShop </td><td> SOD001.10 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> SIGMA </td><td> M-9272 </td><td> إضافة فقط قبل استخدام </td></tr><tr><td> TX-100 </td><td> SIGMA الدريخ </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> OmniPur EMD </td><td> 3860 </td><td> إضافة فقط قبل استخدام </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> SIGMA </td><td> P-7626 </td><td> إضافة فقط قبل استخدام </td></tr><tr><td> البروتيني مانع 50X </td><td> دينار بحريني Baculo الذهب </td><td> 51-21426Z </td><td> إضافة فقط قبل استخدام </td></tr><tr&gt; <td> كاملة البسيطة، EDTA خالية 10X </td><td> روش </td><td> 11 836 170 001 </td><td> إضافة فقط قبل استخدام </td></tr><tr><td> Laemmli عينة الواق 2X </td><td> الحيوي راد </td><td> 161-0737 </td><td></td></tr><tr><td> β-المركابتويثانول </td><td> SIGMA </td><td> M7154 </td><td> إضافة فقط قبل استخدام </td></tr><tr><td> Coomassie بريليانت الأزرق </td><td> الحيوي راد </td><td> R-250 </td><td></td></tr><tr><td> حمض الخليك </td><td> كاليدون </td><td> 1000-1 </td><td></td></tr><tr><td> الميثانول </td><td> كاليدون </td><td> 6701-7 </td><td></td></tr><tr><td> الحيوي راد البروتين الفحص </td><td> الحيوي راد </td><td> 500-0114 </td><td></td></tr><tr><td> BLUeye سلم </td><td> FroggaBio </td><td> PM008-0500 </td><td></td></tr></tbody></table> الجدول رقم 1. الكواشف المستخدمة. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم المعدات </td><td> شركة </td&gt; <td> فهرس العدد </td><td> تعليق (اختياري) </td></tr><tr><td> RC-5B أجهزة الطرد المركزي </td><td> Sorvall </td><td> SS-34 الدوار </td><td> استخدم في 4 درجات مئوية </td></tr><tr><td> نبذ </td><td> Sorvall-الحرارية العلمية </td><td> ST-16R </td><td> استخدم في 4 درجات مئوية </td></tr><tr><td> الجزئي الطرد المركزي </td><td> إيبندورف </td><td> 5417R </td><td> استخدم في 4 درجات مئوية </td></tr><tr><td> البكتيرية شاكر </td><td> INFORS HT Ecotron </td><td> AG CH-1403 Bottmingen </td><td> استخدم في 37 درجة مئوية أو حتى 22 درجة مئوية </td></tr><tr><td> Sonicator </td><td> برانسون </td><td> Sonifier-450 </td><td> استخدم في RT </td></tr><tr><td> محور دوار </td><td> الزجاج كولونيل </td><td> 099A CR4012 </td><td> استخدم في 4 درجات مئوية </td></tr></tbody></table> الجدول 2. التجهيزات المحددة المستخدمة.

affinity precipitation of active rho-gefs using a gst-tagged mutant rho protein (gst-rhoa(g17a)) from epithelial cell lysates

البروتينات للأسرة رو من GTPases الصغيرة هي المنظمين المركزية للالهيكل الخلوي، ومراقبة مجموعة كبيرة ومتنوعة من العمليات الخلوية، بما في ذلك الهجرة الخلية، والتعبير الجيني، وتقدم دورة الخلية والتصاق الخلية 1. البروتينات رو هي مفاتيح الجزيئية التي تنشط في GTP محدد وغير نشطة في الناتج المحلي الإجمالي متجهة دولة. ويتمثل الوسيط في تنشيط من قبل عائلة من البروتينات تبادل جوانين-النوكليوتيدات (GEF) عامل. رو، GEFs تشكل عائلة كبيرة، مع تداخل الخصوصيات 2. رغم إحراز الكثير من التقدم في تحديد GEFs تفعيلها من خلال اشارات معينة، لا يزال هناك العديد من الأسئلة المتبقية بشأن تنظيم مسار محدد من هذه البروتينات. عدد رو-GEFs يتجاوز 70 سنة، ويعبر عن كل خلية أكثر من مرفق البيئة العالمية من البروتين. وبالإضافة إلى ذلك، فإن العديد من هذه البروتينات بتنشيط ليس فقط رو، ولكن أعضاء آخرين في الأسرة، ويسهم في زيادة تعقيد شبكات تنظيمية. الأهم من ذلك، واستكشافكيف يتم تنظيم GEFs يتطلب طريقة لمتابعة تجمع نشط من GEFs الفردية في الخلايا تفعيلها من خلال محفزات مختلفة. هنا نقدم بروتوكول خطوة بخطوة عن الطريقة المستخدمة لتقييم وتحديد ما هو متاح نشط رو محددة GEFs باستخدام فحص الهطول تقارب. وقد تم تطوير هذا الفحص قبل بضع سنوات في المختبر بوريدج 3،4 وليس لدينا استخدامها في خطوط الكلى خلية أنبوبي 5،6،7. الفحص يستفيد من &quot;النوكليوتيدات الحرة&quot; RhoA متحولة، مع قابلية عالية للGEFs نشط. الطفرة (G17A) يجعل بروتين قادر على الربط الناتج المحلي الإجمالي أو GTP والدولة هذا يقلد الدولة الوسيطة التي لا بد أن مرفق البيئة العالمية. وأعرب عن نسخة ضريبة السلع والخدمات الموسومة هذا البروتين الطافر وتنقيته من E. كولاي، منضما إلى حبات sepharose و الجلوتاثيون واستخدامها ليعجل GEFs نشط من lysates من الخلايا غير المعالجة، وحفز. كما يتم تنشيط معظم GEFs عبر تعديلات posttranslational أو إطلاق سراح من الارتباطات المثبطة، دولتهم نشطيتم الاحتفاظ في lysates الخلية، ويمكن الكشف عنها بواسطة هذا الاختبار 8. ويمكن القبض على البروتينات وبحث عن GEFs معروفة من قبل اكتشاف أجسام مضادة محددة مع استخدام النشاف الغربية، أو تحليلها بواسطة الطيف الكتلي لتحديد GEFs غير معروف تفعيلها من خلال مثيرات معينة.

Watch this Scientific Journal Video about Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates at JoVE.com

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates

الطريقة المعروضة هنا يصف فحص لمتابعة تفعيل العوامل الخاصة بكل RhoA تبادل الناتج المحلي الإجمالي / GTP (GEFs) في الخلايا المزروعة، عن طريق الاستفادة من البروتين RhoA متحولة الانصهار ضريبة السلع والخدمات التي لديها قابلية عالية للGEFs تفعيلها. وعجلت GEFs من lysates الخلية، الكشف عنها بواسطة النشاف الغربية وكميا عن طريق قياس كثافة.

تقارب الأمطار من GEFs-رو بالموقع باستخدام ضريبة السلع والخدمات الموسومة البروتين رو المسخ (GST-RhoA (G17A)) من Lysates الخلايا الظهارية

Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell ...

Research

JoVE Journal

Biology

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

عزل بروتين المجمعات المتعددة التي كتبها عطوب في الجسم الحي الشواهد الخلوية عبر ربط والمناعة المغناطيسي اللوني التقارب

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

ثنائي الجزيء الإسفار التكملة (BiFC) الفحص عن البروتين البروتين في خلايا البصل التفاعل باستخدام مدفع الجينات هيليوس

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

زرقاء هلام بولي أكريلاميد الأصلية الكهربائي (BN - PAGE) للتحليل من المجمعات Multiprotein Lysates الخليوي

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

الكروماتوجراف الدهون تقارب الحويصلة بوساطة الفرز المغناطيسي باستخدام خلية المنشط (LIMACS) : طريقة جديدة لتحليل البروتين الدهني التفاعل

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

الكروماتوغرافي تنقية ريبوسوم الخميرة نشطة للغاية

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

متعامد تنقية البروتين الميسر عن طريق بطاقات تقارب Bispecific الصغيرة

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

تحديد الشركاء البروتين عن طريق التفاعل جنبا الى جنب الانجذاب تنقية

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

تقارب المرحلة السائلة الفحص التقاطها باستخدام الخرز المغناطيسي لدراسة البروتين البروتين التفاعل: المثال فيروس شلل الأطفال، Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

بروتوكول لفج العرض وتقارب اختيار طريق الطعوم البروتين المؤتلف

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

المعدلة وراثيا القوارض الفحص لقياس ذكر جرثومة خلية متحولة التردد

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...