Name: affinity precipitation of active rho-gefs using a gst-tagged mutant rho protein (gst-rhoa(g17a)) from epithelial cell lysates
Uploaded: 2012-03-31T13:00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af den canadiske Institute for Health Research (CIHR) (MOP-97.774) og Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC, tilskud nr: 480.619). KS er en modtager af en KRESCENT New Investigator Award (en fælles tildeling af Nyre Foundation of Canada, canadiske Nefrologisk Selskab og canadiske Institute of Health Research), og en tidlig Forsker Award fra Ontario Ministeriet for Forskning og Innovation. FW er understøttet af et Li Ka Shing stipendium.

1. Transformation af E. E. coli med pGEX-RhoA (G17A) Construct <ol><li> Fremstille LB-agar ved at opløse 2,5 g LB og 1,5 g agar i 100 ml dH2O O. Autoklave og kølige til en anslået 50-55 ° C, der som en tommelfingerregel, er, når flasken kan holdes komfortabelt. </li><li> Forbered Ampicillin (Amp) bestand ved at opløse 50 mg / ml i dH 2 O. Sprøjte filter og fryse ubrugte portioner. Tilsæt 100 pi Amp lager (endelig koncentration 50 ug / ml) til LB-agar fra 1,1. Hvirvel at blande og hæld i 10 cm bakterielle tallerkener (15-20 ml / skål). Tillader det at størkne (15-30 min.) Og opbevares ubrugte pladerne vendt ved 4 ° C i 2-3 uger. </li><li> At transformere E. Coli, hurtigt tø en portion af DH5a kompetente celler i et isbad. Tilsættes 1 ml af pGEXRhoA (G17A) DNA fortyndet til 25-50 ng / ul. Svirp røret til at blande og inkuberes på is i 30 minutter. Varmechok ved 42 ° C i 45 sekunder og anbringes igen på is i 2 minutter. Tilsæt 900 &amp; mu; L SOC medium og vokser i en time ved 37 ° C under omrystning. </li><li> Spredning 50-100 gl af de transformerede bakterier på en LB-agar-Amp plader under anvendelse af en bøjet steril Pasteur-pipette. Inkubér pladen rigtige side opad i en 37 ° C inkubator i 5 minutter og derefter vendes og vokse natten over. </li><li> En enkelt koloni vil blive opfanget af pladen til fremstilling af GST-taggede protein (trin 2.1). Til senere anvendelse, inverteret wrap og opbevar pladerne ved 4 ° C i omkring 3 uger. Derudover kan bakterielle lagre fremstilles til mere langvarig opbevaring ved dyrkning individuelle kolonier i 2 ml sterilt LB-Amp natten over ved 37 ° C under omrystning. Blandes en portion med steril 80% glycerol i et forhold på 1:1 og fryse ved -80 ° C. </li></ol> 2. Fremstillinq af GST-RhoA (G17A) Perler <ol><li> Forberede LB ved tilsætning af 25 g LB til en L dH 2 0 og autoklavering. Efter afkøling tilsættes 50 pi Amp fra lager til 50 ml LB (50 ug / ml slutkoncentration). Podes med et godt isoleret colony af transformerede bakterier og vokser natten over ved 37 ° C under omrøring. Når fuld densitet (OD 600&gt; 1,0) fortyndes med 450 ml LB-Amp og vokse i yderligere 30 minutter ved 37 ° C. </li><li> Fremstilling af en 100 mM stamopløsning af isopropyl BD-thiogalactopyranosid (IPTG) ved at opløse 0,238 g i 10 ml dH2O O. Opbevares i aliquoter ved -20 ° C. Inducere bakterier til at fremstille Rho-proteinet ved tilsætning af 500 pi 100 mM IPTG til 500 ml kultur (en slutkoncentration på 100 uM). Reducere temperaturen til 22-24 ° C og vokser i ~ 16 timer timer. </li><li> Spin kultur på 3600 g i 10 minutter ved 4 ° C. Om nødvendigt kan den 500 ml kultur opdeles i 50 ml rør til centrifugering. Fryse pellet (r) i mindst 1 time (eller fortrinsvis natten over) ved -80 ° C. </li><li> Fremstilling af 200 ml lysis-buffer indeholdende 20 mM HEPES (0,95 g) / pH 7,5, 150 mM NaCl (1,75 g), 5 mM MgCI2 (0,203 g), 1% TX-100 (2 ml). Forbered stamopløsninger af 1M DTT (1,542 g i 10 ml dH 2 O) Og 100 mM PMSF (0,174 g/10 ml EtOH). For at forberede lysebuffer +, supplerer 10 ml med 1 mM DTT (10 pi lager) og 1 mM PMSF (100 gl lager) og en komplet Mini Protease Inhibitor tablet. </li><li> Arbejde på is, tilsættes 10 ml lysisbuffer + til de pellets fra trin 2,3. Resuspendere omhyggeligt ved blid omhvirvling og pipettering. Undgå skumdannelse. Sonikeres på is i 1 minut ved indstilling 4 i 50% puls. Dreje sonikerede lysatet ved 15.000-20.000 g i 15 minutter ved 4 ° C, og fjerne den klarede sonikat (supernatant) til en steril hætte 15 ml rør. </li><li> Forberede glutathion Sepharose ved forsigtigt at blande det oprindelige rør indeholdende en 75% opslæmning og overførsel 335 ul i et 15 ml rør. Brug en lang boring tip til pipettering perler. Der tilsættes 10 ml koldt PBS, og spin 500 g i 5 minutter ved 4 ° C. Supernatanten fjernes, og der tilsættes 1 ml lysisbuffer + til perlerne og spinde som for tidligere vask. Supernatanten kasseres, og der tilsættes lysisbuffer + til at foretage en 50% opslæmning. </li><li> Tilsæt 250 pi Ligevægtstidibrated vulst opslæmning til supernatanten fra trin 2.5. Roterer ved 4 ° C i 45 minutter. </li><li> Fremstille 500 ml HBS indeholdende 20 mM HEPES (2,38 g) / pH 7,5 og 150 mM NaCl (4,38 g) i dH 2 O. Forbered stamopløsninger af 1M MgCI2 (0,952 g i 10 ml dH 2 O) og 1M DTT (1,542 g i 10 ml dH 2 O). Til fremstilling af HBS +, supplement 100 ml umiddelbart før anvendelse med 5 mM MgCl2 (50 pi fra stamopløsning) og 1 mM DTT (100 ul fra stamopløsning). </li><li> Spin perlerne fra trin 2,7 ved 500 g i 5 minutter ved 4 ° C. Supernatanten fjernes, og vask perler 2x med 10 ml lysisbuffer +, og 2x med 10 ml HBS +. Efter den sidste vask, at en 50% opslæmning ved resuspendering perlerne i HBS + suppleret med BD BaculoGold protease-inhibitor (20 ul 50x BD BaculoGold / ml). </li><li> Fortyndes 10 pi af den endelige perler præparat med 2x Laemmli-prøvebuffer indeholdende β-mercaptoethanol. Gøre bovint serumalbumin (BSA) standard. Anvender en 2 mg / ml stamopløsning (0,02 g BSA i en0 ml dH2O). Bland 10 gl lager med 10 gl Laemmlis (20 ug endelig), 5 gl lager med 5 gl dH 2 O og 10 pi Laemmlis (10 ug endelig), og 2,5 gl lager med 7,5 gl dH 2 O og 10 pi Laemmlis (5 ug endelig). Koge alle prøver (5 min). Dreje perleprøve og køre supernatanten med BSA-standarder og molekylvægtsmarkører på 10% SDS-polyacrylamidgel. </li><li> Klargør Comassie Blue-farvning (0,1 g i 10 ml eddikesyre, 40 ml methanol og 50 ml dH2O) og affarves opløsning (500 ml dH2O, 400 ml methanol og 100 ml eddikesyre). Opbevares ved stuetemperatur. Plette gel i 20-30 minutter, fjern farvestoffet (det kan genbruges flere gange) og skylles med affarves opløsning to gange. Fortsat affarves med forsigtig rystning i adskillige timer, indtil båndene er klart synlige. </li><li> Estimere koncentrationen af GST-RhoA (G17A) koblet til perlerne under anvendelse af BSA-standarder som en reference (figur 2). Aliquot en lige så stort volumen af ​​perler indeholdende ~ 10-15 ug protein i 1,5 ml mikro-centrifugerør. Detaljerede perler ved 4 ° C til brug inden for en dag. Fryser ved -80 ° C i HBS + / glycerol i forholdet 3:1 til brug inden for få dage. </li></ol> 3. GEF Pulldown Assay med nukleotid-fri RhoA (G17A) Perler <ol><li> Dyrke celler i 10 cm skåle til konfluens. Serum afskære i mindst 3 timer og behandles efter behov. </li><li> Forbered lysebuffer + som i trin 2,4. Forbered nok lysebuffer til 700 ul / parabol plus nogle ekstra beløb for at tillade pipettering fejl. Tilsæt proteaseinhibitorer lige før brug. </li><li> Arbejde på is, fjerne dyrkningsmedium fra de retter, og vask med iskold HBS. Fjern alle HBS og tilsæt 700 pi lysisbuffer + til hver skål. Swirl plader til at dække alle områder, skrab og indsamle lysater i nummererede 1,5 ml rør. Centrifugering ved 15.000 g i 1 min ved 4 ° C. Supernatanten vil blive anvendt til assayet. </li><li> Hvis dit celle nummer er ensartet i alleretter testes, kan du undlade at gøre et protein analyse, og flytte til trin 3,5. Ellers måle proteinkoncentrationen af ​​hver supernatant ved hjælp af Bio-Rad hurtig protein-assay og udligne supernatanten for volumen og koncentration. Mængden af ​​totalt protein afhænger af de celletyper, der anvendes (typisk 1-1,5 mg protein for LLC-PK1-celler). </li><li> Fjern 30 ul af hver supernatant og blandes med 30 gl 2x reducere Laemmli-prøvepuffer, kog og der er afsat for trin 3,7. Tilsæt resterende supernatanter til aliquoter af GST-RhoA (G17A) perler fra trin 2,12. Rotere i 45 minutter ved 4 ° C. </li><li> Spin perler ved 6800 g i 10 sekunder ved 4 ° C. Bortkast supernatanten og vask af perlerne 3x med lysisbuffer, spinding på samme måde mellem vaskninger. Fuldstændigt at fjerne den sidste vask ved anvendelse af en 1 ml sprøjte forsynet med en 30 G nål, og der tilsættes 20 ul 2x reducere Laemmli prøvebuffer. Kog i 5 minutter. Spin til pelletceller perler og enten køre supernatanten med det samme (at foretrække) eller gemme det til ent -80 ° C til senere analyse. </li><li> Kør 20 pi totale cellelysater og alle de udfældede protein prøver på passende procentdel SDS-polyacrylamid gel til størrelsen af ​​GEF du studerer. Detektere din GEF valg ved Western blotting under anvendelse af et specifikt antistof. </li></ol> 4. Repræsentative resultater Del 1 og 2 i protokollen beskriver fremstillingen af GST-RhoA (G17A) koblet til GSH-Sepharose-perler, og den test ved SDS-PAGE (se beskrivelse af protokollen på figur 1). En typisk Coomassie-farvet gel er vist på fig 2. Prøven med det eluerede protein bør indeholde et enkelt bånd ved ca 50 kDa (figur 2, bane 6). Koncentrationen af ​​protein kan vurderes ved anvendelse af BSA referenceprøver. I eksemplet på figur 2, er koncentrationen af RhoA (G17A) estimeret til at være 15 μg/10 ul. Således blev alikvoter på 10 ul / rør fremstillet. Den typiske Udbyttet<html> i vores hånd er 15-20 mikrogram protein fra 10 ml bakteriel lysering. Del 3 i protokollen beskriver affinitet nedbør analysen (se oversigt på figur 1). En vellykket GEF assay påvisning aktivering af udvekslingen faktor GEF-H1 er vist på fig 3. Den RhoA (G17A) protein fanget nogle GEF-H1 fra kontrol (ubehandlet) cellelysater, tyder på, at GEF-H1 har basal aktivitet. Mængden udfældede imidlertid stigninger i celler behandlet med den inflammatoriske cytokin tumornekrosefaktor-α (TNF-α), i overensstemmelse med ideen, at TNF-α aktiverer GEF-H1 5,7. Vigtigere, den totale cellelysater viser tilsvarende mængder af GEF-H1 i kontrol og behandlede prøve, hvilket antyder, at behandlingen ikke ændrer GEF-H1-niveauer og den indgang, som anvendes i assayet er lig. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig1.jpg" /> Figur 1. Oversigt over protokollen. ove_content &quot;&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig2.jpg" /> Figur 2. Repræsentativt resultat af vulsten præparatet protokol. En Coomassie-farvet gel med vellykket GST-RhoA (G17A) vulst præparat er vist. Perleprøve og BSA proteinstandarder blev separeret ved SDS-PAGE under anvendelse af en 10% acrylamidgel. At teste perlerne er 10 gl af den endelige kugle opslæmning indeholdende GST-RhoA (G17A) fortyndet 1:01 med reducerende Laemmli-prøvebuffer og kogt i 5 minutter. Perlerne blev centrifugeret kortvarigt, og supernatanten fyldt på gelen. De følgende prøver blev indlæst: Bane 1: molekylvægtmarkør (MW) (FroggaBio BLUeye forud farvede protein stige), bane 2-4: 5, 10 og 20 ug bovint serumalbumin (BSA), bane 5 er tom, bane 6: 10 pi af frisk fremstillet RhoA (G17A) perler. Efter adskillelse er afsluttet, bliver gelen farvet med Coomassie Blue og derefter affarvet for at afsløre proteiner. Molekylvægten af ​​GST-RhoA (G17A) proteinet er omtrent 50<html> kDa og løber rundt om niveauet af 48 kDa markøren. Koncentrationen af ​​GST-Rho-proteinet i denne prøve anslås til at være omkring 15 μg/10 pi opslæmning. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig3.jpg" /> Figur 3 Repræsentative GEF aktivering assay viser TNF-α-induceret aktivering af GEF-H1. Konfluente LLC-PK1-celler blev behandlet med 10 ng / ml TNF-α i 5 minutter. Efter behandling blev cellerne lyseret, og aktive GEFs blev indfanget ved hjælp af GST-RhoA (G17A) bundet perler. Tilstedeværelsen af ​​GEF-H1 i de udfældede proteiner (top-blot) og samlede cellelysat prøver (nederst blot) blev påvist under anvendelse af Western blotting med et anti-GEF-H1-antistof (Cell Signaling). Bemærk den øgede mængde af udfældet GEF-H1 i TNF-α-behandlede versus ubehandlede celler i forhold til de tilsvarende indgange, hvilket indikerer en vellykket resultat. 3932/3932fig4.jpg &quot;/&gt; Figur 4. Et &quot;dårligt resultat&quot;. Selv om GEF pulldown assayet er vist her resulteret i nogle GEF-H1 fanget af perlerne, beløb udfældes fra kontrol-og TNF-α-behandlede celler er den samme. Således TNF-α, var en kendt aktivator af GEF-H1 i dette tilfælde ikke medføre aktivering. I dette særlige eksperiment efterfølgende fejlfinding foreslået, at den anvendte TNF-α var ikke friske nok og sandsynligvis nedbrydes.

<ol>
	<li>Jaffe, A. B., Hall, A. R. h. o. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPases:+biochemistry+and+biology.">GTPases: biochemistry and biology.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 247-269 (2005).</li><li>Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEF+means+go:+turning+on+RHO+GTPases+with+guanine+nucleotide-exchange+factors.">GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 167-180 (2005).</li><li>Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPLN,+a+guanine+nucleotide+exchange+factor+for+RhoA+and+RhoB,+but+not+RhoC.">XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC.</a> J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).</li><li>Garcia-Mata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+activated+GAPs+and+GEFs+in+cell+lysates.">Analysis of activated GAPs and GEFs in cell lysates.</a> Methods Enzymol. 406, 425-437 (2006).</li><li>Kakiashvili, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEF-H1+Mediates+Tumor+Necrosis+Factor-{alpha}-induced+Rho+Activation+and+Myosin+Phosphorylation:+role+in+the+regulation+of+tubular+paracellular+permeability.">GEF-H1 Mediates Tumor Necrosis Factor-{alpha}-induced Rho Activation and Myosin Phosphorylation: role in the regulation of tubular paracellular permeability.</a> J. Biol. Chem. 284, 11454-11466 (2009).</li><li>Waheed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+signal+regulated+kinase+and+GEF-H1+mediate+depolarization-induced+Rho+activation+and+paracellular+permeability+increase.">Extracellular signal regulated kinase and GEF-H1 mediate depolarization-induced Rho activation and paracellular permeability increase.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. , (2010).</li><li>Kakiashvili, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermal+growth+factor+receptor+mediates+tumor+necrosis+factor-alpha-induced+activation+of+the+ERK/GEF-H1/RhoA+pathway+in+tubular+epithelium.">The epidermal growth factor receptor mediates tumor necrosis factor-alpha-induced activation of the ERK/GEF-H1/RhoA pathway in tubular epithelium.</a> J. Biol. Chem. 286, 9268-9279 (2011).</li><li>Garcia-Mata, R., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catching+a+GEF+by+its+tail.">Catching a GEF by its tail.</a> Trends Cell Biol. 17, 36-43 (2007).</li><li>Dubash, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+GTPase+RhoA+localizes+to+the+nucleus+and+is+activated+by+Net1+and+DNA+damage+signals.">The small GTPase RhoA localizes to the nucleus and is activated by Net1 and DNA damage signals.</a> PLoS One. 6, e17380-e17380 (2011).</li><li>Guilluy, G., Dubash, A. D., Garc&#237;a-Mata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RhoA+and+Rho+GEF+activity+in+whole+cells+and+the+cell+nucleus.">Analysis of RhoA and Rho GEF activity in whole cells and the cell nucleus.</a> Nature Protocols. , (2011).</li><li>Guilluy, C., Swaminathan, V., Garcia-Mata, R., O'Brien, E. T., Superfine, R., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+GEFs+LARG+and+GEF-H1+regulate+the+mechanical+response+to+force+on+integrins.">The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins.</a> Nature Cell Biology. 13, 722-727 (2011).</li><li>Dubash, A. D., Wennerberg, K., Garcia-Mata, R., Menold, M. M., Arthur, W. T., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Lsc/p115+RhoGEF+and+LARG+in+regulating+RhoA+activity+downstream+of+adhesion+to+fibronectin.">A novel role for Lsc/p115 RhoGEF and LARG in regulating RhoA activity downstream of adhesion to fibronectin.</a> J. Cell Sci. 120, 3989-3998 (2007).</li><li>Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPLN,+a+guanine+nucleotide+exchange+factor+for+RhoA+and+RhoB,+but+not+RhoC.">XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC.</a> J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Fremgangsmåden fremlagt her, er den eneste tilgængelige ikke-radioaktive aktivering assay for GEFs der kan følge den aktive pulje af GEFs i celler. Assayet er svarer til de udfældning assays anvendes til efter aktivering af små GTPaser samt GEFs mod Rac og Cdc42. Disse assays anvendes forskellige GST-mærkede proteiner, og har små forskelle fra den her beskrevne, men de grundlæggende trin er de samme. Således kan denne protokol let kan tilpasses til andre små GTPase og GEF aktivering assays. Den fremlagte GEF-analysen blev for nylig ændret til en ansøgning om nukleare fraktioner 9,10. Med yderligere modifikationer, kan testning af GEF aktivering med andre subcellulære rum også være mulig. Vi anvender den præsenterede metode til at studere aktivering af GEFs i epiteliale cellelinjer 5,6,7. Med nogle optimering, bør dette assay være tilstrækkelig til at detektere GEFs fra enhver cellelinie. Når adapting til en specifik celletype, finde den optimale celleantal, lyseringsbuffer volumen og påvisningsmetode for GEF skal testes (et godt antistof til Western blotting er vigtig). For første opsætning af analysen er det tilrådeligt at bruge en stimulus, der er kendt for at aktivere GEF af interesse. Når du bruger en ukendt stimulus, altid bruge en positiv kontrol at bekræfte, at analysen arbejder. Dette assay kan anvendes til at detektere aktivering af kendte GEFs ved Western blotting. Det er imidlertid også tilstrækkelig til at identificere ukendte GEFs. Til dette bør tilfangetagne GEFs fra kontrol-og stimulerede prøverne analyseret på en Coomassie-farvet gel. Bands, der kun vises i stimulerede prøver kan indeholde aktiveret GEFs og kan sendes til identifikation af massespektrometri (fx 5). Endelig lidt malurt i bægeret. Assayet er baseret på den antagelse, at posttranslationelle modifikationer gør GEFs aktive bevares efter cellelyse. Faktisk er det klart caSE for en række GEFs, og da dens anlæg, er dette assay blevet anvendt af forskellige grupper til at detektere aktivering af forskellige GEFs, herunder GEF-H1, p115RhoGEF og XPLN (f.eks 5,11,12,13). Bevarelse af den aktive tilstand dog måske ikke ske i tilfælde af alle GEFs, og derfor er det tænkeligt, at denne analyse ikke vil arbejde for alle GEFs. Det skal også bemærkes, at mange GEFs udøver aktivitet mod mere end et lille GTPaser. Når således en specifik GEF undersøgt, anbefales det at supplere dette assay med GEF udfældning assays for andre små GTPaser, såvel som funktionelle undersøgelser undersøge RhoA, Rac1 og Cdc42. Kritiske trin i protokollen: Kolonier af transformerede bakterier skal plukkes fra friske, ordentligt forberedt plader for at sikre tilstrækkelig selektion af AMP, god udvækst og udbytte. Transformation betingelser for kompetente celler fra andre kilder kan variere og bør høres. </p&gt; Alle trin af proteinet præparat protokol (fra trin 2.3) og assay (fra trin 3.2) bør udføres ved 4 ° C med afkølede opløsninger og centrifuger. Bakteriel lyse (trin 2.5) bør være grundig og fuldstændig for at opnå en homogen suspension. Når lysering af bakterier, vortex og pipetteres lysatet skiftevis under opretholdelse den ved 4 ° C og sikre lydbehandling udføres på is for at forhindre denaturering af proteinet. Hvis du bruger en anden model af sonikator, kan betingelser skal justeres. Inkubation af sonikatet med perlerne skal altid udføres ved 4 ° C på en rotator at sikre tilstrækkelig binding, og der skal sørges for at holde timing ensartet. GST-Rho mutanter er noget ustabile, når de udtrykkes i bakterier, så det er bedst at anvende fremstillede perler med det samme eller inden for nogle få dage. Udfældningen assay (del 3) er tids-og temperaturfølsom, ens aktive GEFs let kan gå tabt fra cellelysatet, så bør trin udføres så hurtigt som muligt. Følgende afsnit indeholder nogle tip til fejlfinding. Ingen eller meget lav mængde af mutant Rho-protein i den endelige kugle præparatet: Dette kan skyldes ineffektiv induktion, utilstrækkelig lysis af bakterierne, eller et tab af proteinet under fremstillingsprocessen eller opbevaring. Til fejlfinding nogle af disse muligheder, kan prøver af bakterier analyseres før og efter induktion. Hvis der er ringe induktion af proteinet gentages ved anvendelse af en koloni fra en frisk udstrøget plade eller re-transformerede kompetente celler. Forskellige IPTG koncentrationer og induktions-tider skal også testes. Hvis lysis er utilstrækkelig (dvs. protein forbliver i pelleten i stedet for supernatant) varierende salt-og detergent-koncentrationer i lyseringspuffer kan forsøges. Alternative sonikering gange ogindstillinger bør overvejes, og prøver før og efter sonikering kan kontrolleres ved mikroskopi for at bestemme effektiviteten af ​​lyse. Nr. præcipiteret GEF, selvom GST-protein er til stede på perlerne: Dette kan skyldes tekniske problemer under udfældningen assay eller ved en virkelig fravær af aktivering af den undersøgte GEF hjælp af anvendte stimulus. Brug altid en kendt stimulus som en positiv kontrol at bekræfte, at analysen fungerer. Brug de forberedte perler inden for få dage. Hvis nedbør analysen indfanger ikke målbart mængder af GEF undersøgt i alle forhold, kontrollere, at din GEF er til stede og er godt påvises i supernatanten efter centrifugering, der skal anvendes til analysen (trin 3,3). Sørg for at alle buffere og proteasehæmmere er friske, og udføre alle trin på isen så hurtigt som muligt. Forøg mængden af ​​input protein (fx ved hjælp af lysater fra 2 plader / prøve). Hvis udfældning assayet viser basal udfældningførelsen af din GEF, men ingen forskel ses mellem kontrol og stimulerede prøver (figur 4), skal du starte fejlfinding ved at kontrollere, at den anvendte stimulus arbejdede anvendelse af andre kendte virkninger (f.eks ved at opdage aktivering af andre signalveje). Overvej ændre behandlingen betingelser og / eller koncentrationer. Stol på data fra litteraturen rapportering, hvordan din stimulus aktiverer Rho eller andre signalering at forudsige sandsynlige tidspunkter og koncentrationer. Når optimere behandlingen tid, bruge både korte og lange tidspunkter, som GEF aktivering kan være bedst påvises på et tidspunkt forud for godt påvises Rho aktivering. Endelig kunne den samme stimulus resultere i en varierende grad af aktivering som følge af en ændring i cellens reaktion forårsaget af passage nummer, cellekonfluens, etc.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn reagens </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td><td> Kommentarer (valgfri) </td></tr><tr><td> pGEX-RhoA (G17A) </td><td> Addgene </td><td> Vil snart være tilgængelige </td><td> Dannet i laboratoriet af Dr. Keith Burridge (University of North Carolina) (ref 3) </td></tr><tr><td> DH5a </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> Store -80 ° C </td></tr><tr><td> SOC medium </td><td> BioShop </td><td> SOC001.10 </td><td></td></tr><tr><td> LB </td><td> BioShop </td><td> LBL407.1 </td><td> Hold steril </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> BioShop </td><td> GLY002.1 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td> BioShop </td><td> AMP201.25 </td><td> Opbevar lager ved -20 ° C </td></tr><tr><td> Agar </td><td> BioShop </td><td> AGR001.500 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (Isopropyl BD-thiogalacto-pyranosid) </td><td> Calbio-chem </td><td> 420322 </td><td> Store stamopløsning ved -20 ° C </td></tr><tr><td> Glutathion Sepharose-perler </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0756-01 </td><td></td></tr><tr><td> PBS 10x </td><td> SIGMA </td><td> D1408 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> SIGMA </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BioShop </td><td> SOD001.10 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> SIGMA </td><td> M-9272 </td><td> Tilsættes lige før brug </td></tr><tr><td> TX-100 </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> OmniPur EMD </td><td> 3860 </td><td> Tilsættes lige før brug </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> SIGMA </td><td> P-7626 </td><td> Tilsættes lige før brug </td></tr><tr><td> Proteaseinhibitor 50x </td><td> BD Baculo-Gold </td><td> 51-21426Z </td><td> Tilsættes lige før brug </td></tr><tr&gt; <td> Komplet Mini EDTA-fri 10x </td><td> Roche </td><td> 11 836 170 001 </td><td> Tilsættes lige før brug </td></tr><tr><td> Laemmli-prøvebuffer 2x </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0737 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoethanol </td><td> SIGMA </td><td> M7154 </td><td> Tilsættes lige før brug </td></tr><tr><td> Coomassie Brilliant Blue </td><td> Bio-Rad </td><td> R-250 </td><td></td></tr><tr><td> Eddikesyre </td><td> Caledon </td><td> 1000-1 </td><td></td></tr><tr><td> Methanol </td><td> Caledon </td><td> 6701-7 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Rad Protein Assay </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0114 </td><td></td></tr><tr><td> BLUeye stigen </td><td> FroggaBio </td><td> PM008-0500 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1. Reagenser anvendt. <table border="1"><tbody><tr><td> Navn udstyr </td><td> Firma </td&gt; <td> Katalog nummer </td><td> Kommentarer (valgfri) </td></tr><tr><td> RC-5B centrifuge </td><td> Sorvall </td><td> SS-34 rotor </td><td> Brug ved 4 ° C </td></tr><tr><td> Centrifuger </td><td> Sorvall-Thermo Scientific </td><td> ST-16R </td><td> Brug ved 4 ° C </td></tr><tr><td> Micro centrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 5417R </td><td> Brug ved 4 ° C </td></tr><tr><td> Bakteriel shaker </td><td> INFORS HT Ecotron </td><td> AG CH-1403 Bottmingen </td><td> Anvendes ved 37 ° C eller ved 22 ° C </td></tr><tr><td> Sonikator </td><td> Branson </td><td> Sonifier-450 </td><td> Brug på RT </td></tr><tr><td> Rotator </td><td> Glas-Col </td><td> 099A CR4012 </td><td> Brug ved 4 ° C </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Specifikke anvendte udstyr.

affinity precipitation of active rho-gefs using a gst-tagged mutant rho protein (gst-rhoa(g17a)) from epithelial cell lysates

Proteiner af Rho familie af små GTPaser er centrale regulatorer af cytoskelettet, og styre en lang række af cellulære processer, herunder cellemigrering, genekspression, cellecyklusprogression og celleadhæsion 1. Rho proteiner er molekylære kontakter, der er aktive i GTP-bundet og inaktive i BNP-bundne tilstand. Deres aktivering er medieret af en familie af guanin-nukleotid Exchange faktor (GEF) proteiner. Rho-GEFs udgør en stor familie, med overlappende specificiteter 2. Selv om en masse der er gjort fremskridt med at identificere de GEFs aktiveres af bestemte signaler, der er stadig mange spørgsmål tilbage om vej-specifik regulering af disse proteiner. Antallet af Rho-GEFs overstiger 70, og hver celle udtrykker mere end én GEF protein. Hertil kommer, aktivere mange af disse proteiner ikke blot Rho, men andre medlemmer af familien, bidrager yderligere til kompleksiteten af ​​de regulatoriske netværk. Vigtigt, at udforskehvor GEFs reguleres kræver en fremgangsmåde til at følge den aktive pulje af individuelle GEFs i celler aktiveret med forskellige stimuli. Her giver vi en trin-for-trin protokol for en metode, der anvendes til at vurdere og kvantificere de tilgængelige aktive Rho-specifikke GEFs ved hjælp af en affinitet nedbør analyse. Denne analyse blev udviklet for et par år siden i Burridge laboratoriet 3,4, og vi har brugt det i nyre rørformede cellelinjer 5,6,7. Assayet udnytter en &quot;nukleotidsekvens fri&quot; mutant RhoA, med en høj affinitet for aktive GEFs. Mutationen (G17A) gør proteinet ude af stand til at binde BNP eller GTP og denne tilstand efterligner den mellemliggende tilstand, der er bundet til GEF. En GST-mærket version af denne mutant protein udtrykkes og oprenses fra E. coli, der er bundet til glutathion sepharoseperler og anvendes til at udfælde aktiv GEFs fra lysater af ubehandlede og stimulerede celler. Da de fleste GEFs aktiveres via posttranslationelle modifikationer eller frigørelse fra hæmmende bindinger, deres aktive tilstandbevares i cellelysater, og de ​​kan detekteres ved denne assay 8. Indfangede proteiner kan probes for kendte GEFs ved påvisning med specifikke antistoffer under anvendelse af Western blotting, eller analyseres ved massespektrometri til at identificere ukendte GEFs aktiveres af visse stimuli.

Watch this Scientific Journal Video about Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates at JoVE.com

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates

Fremgangsmåden præsenteres her beskriver et assay til at følge aktivering af RhoA specifikke BNP / GTP Exchange faktorer (GEFs) i dyrkede celler ved anvendelse af en mutant RhoA GST-fusionsprotein, der har høj affinitet for aktiverede GEFs. GEFs udfældes fra cellelysater, detekteret ved Western blotting og kvantificeret ved densitometri.

Affinity udfældning af aktivt Rho-GEFs Brug en GST-mærket Mutant Rho Protein (GST-RhoA (G17A)) fra Epiteliale Cellelysaterne

Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell ...

Research

JoVE Journal

Biology

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Chromatografisk Rensning af højaktiv Gær ribosomer

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Ortogonale Proteinoprensning Faciliteret af en lille Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Identifikation af Protein Interagerende Partners Brug Tandem Affinitetsrensning

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

En væskefase affinitetsindfangning under anvendelse af magnetiske perler til at studere protein-protein interaktion: poliovirus-Nanobody Eksempel

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

En protokol for fagvisning og Affinity Selection Brug rekombinant protein Lokkemad

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

Transgene gnaver Assay til Quantifying Mand Kimcelle mutanthyppighed

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...