Name: affinity precipitation of active rho-gefs using a gst-tagged mutant rho protein (gst-rhoa(g17a)) from epithelial cell lysates
Uploaded: 2012-03-31T13:00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door de Canadese Instituut voor Gezondheidsonderzoek (CIHR) (MOP-97774) en de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC, subsidie ​​nr: 480619). KS is een ontvanger van een KRESCENT New Investigator Award (een gezamenlijke gunning van de Nierstichting van Canada, de Canadese Nefrologie Society en Canadese Institute of Health Research) en een vroege Onderzoeker Award van de Ontario ministerie van Onderzoek en Innovatie. FW wordt ondersteund door een Li Ka Shing beurs.

1. Transformatie van E. coli met pGEX-RhoA (G17a) Construct <ol><li> Bereid LB-agar door het oplossen van 2,5 g LB en 1,5 g agar-agar in 100 ml dH 2 O. Autoclaaf en afkoelen tot een geschatte 50-55 ° C, die een vuistregel wanneer de kolf kan gemakkelijk worden gehouden. </li><li> Bereid Ampicilline (Amp) voorraad door het oplossen van 50 mg / ml in dH 2 O. Spuit filter en bevriezen ongebruikte porties. Voeg 100 ul Amp voorraad (uiteindelijke concentratie 50 ng / ml) van de LB-Agar van 1.1. Swirl te mengen en giet het in 10 cm bacteriële gerechten (15-20 ml / gerecht). Laat het stollen (15-30 min.) En ongebruikte platen omgekeerd bij 4 ° C opgeslagen gedurende 2-3 weken. </li><li> E. transformeren Coli snel smelten een hoeveelheid DH5a competente cellen in een ijsbad. Voeg 1 pi pGEXRhoA (G17a) DNA verdund tot 25-50 ng / pl. Flick de buis te mengen en op ijs geïncubeerd gedurende 30 minuten. Hitteschok bij 42 ° C gedurende 45 seconden en weer plaatsen op ijs gedurende 2 minuten. Voeg 900 &amp; mu; L SOC medium en groeien gedurende een uur bij 37 ° C met schudden. </li><li> Spreiding 50-100 ul van de getransformeerde bacteriën op LB-amp-Agar plaat met een gebogen steriele Pasteur pipet. Incubeer de plaat goede kant naar boven in een 37 ° C incubator gedurende 5 minuten en dan omkeren en groeien &#39;s nachts. </li><li> Een enkele kolonie zal worden van de plaat geplukt voor de voorbereiding van het GST-gelabeld eiwit (stap 2.1). Voor toekomstig gebruik, wrap en op te slaan platen omgekeerd bij 4 ° C gedurende ongeveer 3 weken. Bovendien bacteriële voorraad worden bereid meer langdurige opslag bij toenemende afzonderlijke kolonies in 2 ml steriele LB-amp nacht bij 37 ° C met schudden. Meng een aliquot steriele 80% glycerol in een 1:1 verhouding en invriezen bij -80 ° C. </li></ol> 2. Voorbereiding van de GST-RhoA (G17a) Kralen <ol><li> Bereid LB door toevoeging van 25 g LB 1 L dH 2 0 en autoclaveren. Bij het afkoelen, voeg 50 ul Amp uit voorraad tot 50 ml LB (50 ug / ml uiteindelijke concentratie). Inoculeren met een goed geïsoleerd colony van getransformeerde bacterien en groeien nacht bij 37 ° C onder roeren. Toen volledige dichtheid (OD 600&gt; 1.0) verdund met 450 ml LB-amp en groeien gedurende 30 minuten bij 37 ° C. </li><li> Bereid een 100 mM voorraad oplossing van isopropyl BD-thiogalactopyranoside (IPTG) door het oplossen van 0,238 g in 10 ml dH 2 O. Bewaren in fracties bij -20 ° C. Induceren bacteriën Rho eiwit door toevoeging van 500 pi 100 mM IPTG aan 500 ml cultuur (een eindconcentratie van 100 uM). Verlaag de temperatuur tot 22-24 ° C en te groeien voor ~ 16 uur uur. </li><li> Spin cultuur bij 3600 g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Indien nodig kan de 500 ml cultuur worden verdeeld in 50 ml van centrifugatie. Freeze pellet (s) ten minste 1 uur (bij voorkeur nacht) bij -80 ° C. </li><li> Bereid 200 ml lysisbuffer die 20 mM HEPES (0,95 g) / pH 7,5, 150 mM NaCl (1,75 g), 5 mM MgCl2 (0,203 g), 1% TX-100 (2 ml). Bereid voorraadoplossingen van 1M DTT (1,542 g in 10 ml dH 2 O) En 100 mM PMSF (0,174 g/10 ml EtOH). Om lysisbuffer + voor te bereiden, aan te vullen met 10 ml 1 mM DTT (10 ul van voorraad) en 1 mM PMSF (100 pl voorraad) en een complete mini Proteaseremmer tablet. </li><li> Werken aan ijs, voeg 10 ml lysis buffer + om de pellets uit stap 2.3. Resuspendeer grondig door zachte vortexen en pipetteren. Schuimvorming te voorkomen. Bewerk met ultrasone trillingen op ijs gedurende 1 minuut op het vaststellen van 4 met 50% puls. Draai het gesoniceerde lysaat op 15,000-20,000 g gedurende 15 minuten bij 4 ° C, en verwijder de geklaarde ultrasone trillingen (supernatans) in een steriele afgedekt 15 ml buis. </li><li> Bereid de Glutathion Sepharose door voorzichtig mengen van de originele buis met een 75% slurry en overdracht 335 pl in een 15 ml buis. Gebruik een wijde boring tip om kralen pipet. Voeg 10 ml koud PBS en spin 500 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant, voeg 1 ml lysis buffer + aan de kralen en draaien als voor de vorige wasbeurt. Verwijder het supernatant en add lysisbuffer + om een ​​50% slurry te maken. </li><li> Voeg 250 pi equilibrated kraal slurry aan de supernatant uit stap 2.5. Roteren bij 4 ° C gedurende 45 minuten. </li><li> Bereid 500 ml HBS bevattende 20 mM HEPES (2,38 g) / pH 7,5 en 150 mM NaCl (4,38 g) in DH 2 O. Bereid voorraad oplossingen van 1M MgCl2 (0,952 g in 10 ml dH 2 O) en 1M DTT (1,542 g in 10 ml dH 2 O). Om HBS + bereiden, 100 ml vlak voor gebruik met 5 mM MgCl2 (50 pi uit voorraad) en 1 mM DTT (100 pi uit voorraad). </li><li> Draai de kralen van stap 2,7 bij 500 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en was kralen 2x met 10 ml lysis buffer +, en 2x met 10 ml HBS +. Na de laatste wassing, een 50% suspensie door de korrels te mengen in HBS + aangevuld met BD BaculoGold proteaseremmer (20 pi 50x BD BaculoGold / ml). </li><li> Verdun 10 ul van de uiteindelijke korrels preparaat met 2x Laemmli monsterbuffer met β-mercapto-ethanol. Maak Bovine serum albumine (BSA) normen. Gebruik 2 mg / ml voorraadoplossing (0,02 g BSA in 10 ml dH 2 O). Mix 10 ul op voorraad met 10 ul Laemmli (20 pg final), 5 pi op voorraad met 5 pi van dH 2 O en 10 ul Laemmli (10 ug final), en 2,5 pl voorraad met 7,5 ui dH 2 O en 10 ul Laemmli (5 pg def.) Kook alle monsters (5 min). Draai de kraal monster en laat supernatant met BSA normen molecuulgewichtsmerkers op een 10% SDS-polyacrylamidegel. </li><li> Bereid de Comassie Blue vlek (0,1 g in 10 ml azijnzuur, 40 ml methanol en 50 ml dH 2 O) en destain (500 ml dH 2 O 400 ml methanol en 100 ml azijnzuur). Bewaar bij kamertemperatuur. Vlekken op de gel voor 20-30 minuten, verwijder de kleurstof (het kan worden hergebruikt meerdere keren) en tweemaal spoelen met destain oplossing. Blijf destain onder voorzichtig schudden gedurende enkele uren tot banden zijn duidelijk zichtbaar. </li><li> Bereken de concentratie van GST-RhoA (G17a) gekoppeld met de korrels met de BSA normen als referentie (fig. 2). Aliquot een gelijk volume kralen die ~ 10-15 ug eiwit in 1,5 ml micro centrifugebuizen. Store kralen bij 4 ° C om te gebruiken binnen een dag. Bevries bij -80 ° C in HBS + / glycerol in een 3:1 verhouding te gebruiken binnen enkele dagen. </li></ol> 3. GEF Pulldown de muis met Nucleotide-free RhoA (G17a) Kralen <ol><li> Cellen groeien in 10 cm schaaltjes voor confluentie. Serum ontnemen tenminste 3 uur behandelen vereist. </li><li> Bereid lysis buffer + als in stap 2.4. Bereid genoeg lysis buffer voor 700 pl / schotel plus een aantal extra bedrag toe te staan ​​voor pipetteren fouten. Voeg de proteaseremmers vlak voor gebruik. </li><li> Werken op het ijs, verwijder kweekmedium van de gerechten en wassen met ijskoud HBS. Verwijder alle HBS en voeg 700 ul lysisbuffer + bij elk gerecht. Swirl platen tot alle gebieden, schrapen en het verzamelen van lysaten in genummerde 1,5 ml buizen. Spin bij 15.000 g gedurende 1 min bij 4 ° C. Het supernatant wordt gebruikt voor de test. </li><li> Als uw mobiele nummer is gelijk in allegerechten worden getest, kun je het weg doen van een eiwit-test, en ga naar stap 3.5. Anders meten eiwitconcentratie van elke supernatant met Bio-Rad proteïne assay snel en gelijk de supernatant voor volume en concentratie. De totale hoeveelheid eiwit afhankelijk van de cellen die worden gebruikt (gewoonlijk 1-1,5 mg eiwit LLC-PK1 cellen). </li><li> Verwijder 30 ul van elk supernatant en meng met 30 ul 2x het verminderen van Laemmli monsterbuffer, kook en laat de stap 3.7. Voeg de resterende supernatanten aan porties van de GST-RhoA (G17a) kralen uit stap 2.12. Draaien gedurende 45 minuten bij 4 ° C. </li><li> Spin kralen bij 6.800 g gedurende 10 seconden bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en was de korrels 3x met lysisbuffer, centrifugeren op dezelfde wijze wasjes. Volledig verwijderen van de laatste wasbeurt met een 1 cc injectiespuit voorzien van een 30 G naald en voeg 20 ul 2x het verminderen van Laemmli monsterbuffer. Kook gedurende 5 minuten. Draai om pellet kralen en ofwel onmiddellijk voer het supernatant (bij voorkeur) of plaatst u het eent -80 ° C voor latere analyse. </li><li> Run 20 pl totaal cellysaten en al van het neergeslagen eiwit monsters op de juiste percentage SDS-polyacrylamide gel voor de grootte van GEF je studeert. Detecteert uw GEF van een keuze door Western blotting met behulp van een specifiek antilichaam. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Deel 1 en 2 van het protocol beschreven bereiding van GST-RhoA (G17a) gekoppeld aan GSH-sefarosekorrels en testen door SDS-PAGE (zie omtrek van protocol in fig. 1). Een typische Coomassie gekleurde gel wordt op Figuur 2. Het monster met het geëlueerde eiwit moet een enkele band bij ongeveer 50 kDa (figuur 2, laan 6). De concentratie van het eiwit kunnen worden bepaald met behulp van de BSA referentiemonsters. In het voorbeeld van fig. 2, wordt de concentratie van RhoA (G17a) gelijk is aan 15 pi μg/10 zijn. Zo werden fracties van 10 pl / buis opgesteld. De typische opbrengst<html> in de hand 15-20 ug eiwit van 10 ml bacteriële lysis. Deel 3 van het protocol beschrijft de affiniteit neerslag assay (zie overzicht op Fig 1). Een succesvolle test GEF het opsporen van de activering van de uitwisseling factor GEF-H1 wordt weergegeven op Fig 3. De RhoA (G17a) eiwit gevangen sommige GEF-H1 van de controle (onbehandelde) cellysaten, wat suggereert dat GEF-H1 basale activiteit heeft. De hoeveelheid neergeslagen echter stijgingen van de cellen behandeld met het inflammatoir cytokine Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α), consistent met het idee dat TNF-α GEF-H1 5,7 activeert. Belangrijk is dat de totale cellysaten tonen overeenkomstige hoeveelheden GEF-H1 in de controle en het behandelde monster, wat suggereert dat de behandeling niet GEF-H1 niveau veranderen en de ingang in de test gelijk. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig1.jpg" /> Figuur 1. Overzicht van het protocol. ove_content &quot;&gt; <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig2.jpg" /> Figuur 2. Representatief resultaat van de kraal preparaat protocol. Een Coomassie gekleurde gel met succesvolle GST-RhoA (G17a) kraal voorbereiding wordt weergegeven. Kralen monster en BSA eiwit standaarden werden gescheiden door SDS-PAGE met een 10% acrylamide gel. Om de korrels te testen, wordt 10 ul van de uiteindelijke korrel slurry met GST-RhoA (G17a) 1:1 met reducerende Laemmli monsterbuffer en 5 minuten gekookt. De korrels werden kort gesponnen en het supernatant geladen op de gel. De volgende monsters werden geladen: Baan 1: moleculair gewicht marker (MW) (FroggaBio Blueye prestained eiwit ladder); Lanes 2-4: 5, 10 en 20 ug Bovine serum albumine (BSA), Lane 5 is leeg; Lane 6: 10 ul van de vers bereide RhoA (G17a) kralen. Na scheiding is voltooid, wordt de gel gekleurd met Coomassie Blue vervolgens ontkleurd met eiwitten te onthullen. Het molecuulgewicht van de GST-RhoA (G17a) eiwit ongeveer 50<html> kDa en loopt rond het niveau van de 48 kDa marker. De concentratie van het GST-Rho eiwit in dit monster wordt geschat op ongeveer 15 pi μg/10 slurry. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig3.jpg" /> Figuur 3. Representatieve GEF activering assay met TNF-α-geïnduceerde activatie van GEF-H1. Confluente LLC-PK1 cellen werden behandeld met 10 ng / ml TNF-α gedurende 5 minuten. Na de behandeling werden de cellen gelyseerd en actieve GEFs werden gevangen met behulp van GST-RhoA (G17a) gebonden kralen. De aanwezigheid van GEF-H1 in de neergeslagen eiwitten (boven blot) en totaal cellysaat monsters (onder blot) werd gedetecteerd met Western blotting met een anti-GEF-H1 antilichaam (Cell Signaling). Let op het verhoogde bedrag van de neergeslagen GEF-H1 in de TNF-α behandelde versus niet-behandelde cellen ten opzichte van het equivalente ingangen, wat wijst op een succesvol resultaat. 3932/3932fig4.jpg &quot;/&gt; Figuur 4. Een &quot;slecht resultaat&quot;. Hoewel de GEF pulldown assay hier tot enkele GEF-H1 opgenomen door de korrels bedragen neergeslagen uit controle-en TNF-α-behandelde cellen hetzelfde. Zo TNF-α, heeft een kennis activator van GEF-H1 in dit geval niet leiden tot activering. In dit experiment latere oplossen van problemen gesuggereerd dat de gebruikte TNF-α was niet vers genoeg en waarschijnlijk afgebroken.

<ol>
	<li>Jaffe, A. B., Hall, A. R. h. o. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPases:+biochemistry+and+biology.">GTPases: biochemistry and biology.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 247-269 (2005).</li><li>Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEF+means+go:+turning+on+RHO+GTPases+with+guanine+nucleotide-exchange+factors.">GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 167-180 (2005).</li><li>Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPLN,+a+guanine+nucleotide+exchange+factor+for+RhoA+and+RhoB,+but+not+RhoC.">XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC.</a> J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).</li><li>Garcia-Mata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+activated+GAPs+and+GEFs+in+cell+lysates.">Analysis of activated GAPs and GEFs in cell lysates.</a> Methods Enzymol. 406, 425-437 (2006).</li><li>Kakiashvili, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEF-H1+Mediates+Tumor+Necrosis+Factor-{alpha}-induced+Rho+Activation+and+Myosin+Phosphorylation:+role+in+the+regulation+of+tubular+paracellular+permeability.">GEF-H1 Mediates Tumor Necrosis Factor-{alpha}-induced Rho Activation and Myosin Phosphorylation: role in the regulation of tubular paracellular permeability.</a> J. Biol. Chem. 284, 11454-11466 (2009).</li><li>Waheed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+signal+regulated+kinase+and+GEF-H1+mediate+depolarization-induced+Rho+activation+and+paracellular+permeability+increase.">Extracellular signal regulated kinase and GEF-H1 mediate depolarization-induced Rho activation and paracellular permeability increase.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. , (2010).</li><li>Kakiashvili, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermal+growth+factor+receptor+mediates+tumor+necrosis+factor-alpha-induced+activation+of+the+ERK/GEF-H1/RhoA+pathway+in+tubular+epithelium.">The epidermal growth factor receptor mediates tumor necrosis factor-alpha-induced activation of the ERK/GEF-H1/RhoA pathway in tubular epithelium.</a> J. Biol. Chem. 286, 9268-9279 (2011).</li><li>Garcia-Mata, R., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catching+a+GEF+by+its+tail.">Catching a GEF by its tail.</a> Trends Cell Biol. 17, 36-43 (2007).</li><li>Dubash, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+GTPase+RhoA+localizes+to+the+nucleus+and+is+activated+by+Net1+and+DNA+damage+signals.">The small GTPase RhoA localizes to the nucleus and is activated by Net1 and DNA damage signals.</a> PLoS One. 6, e17380-e17380 (2011).</li><li>Guilluy, G., Dubash, A. D., Garc&#237;a-Mata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RhoA+and+Rho+GEF+activity+in+whole+cells+and+the+cell+nucleus.">Analysis of RhoA and Rho GEF activity in whole cells and the cell nucleus.</a> Nature Protocols. , (2011).</li><li>Guilluy, C., Swaminathan, V., Garcia-Mata, R., O'Brien, E. T., Superfine, R., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+GEFs+LARG+and+GEF-H1+regulate+the+mechanical+response+to+force+on+integrins.">The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins.</a> Nature Cell Biology. 13, 722-727 (2011).</li><li>Dubash, A. D., Wennerberg, K., Garcia-Mata, R., Menold, M. M., Arthur, W. T., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Lsc/p115+RhoGEF+and+LARG+in+regulating+RhoA+activity+downstream+of+adhesion+to+fibronectin.">A novel role for Lsc/p115 RhoGEF and LARG in regulating RhoA activity downstream of adhesion to fibronectin.</a> J. Cell Sci. 120, 3989-3998 (2007).</li><li>Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPLN,+a+guanine+nucleotide+exchange+factor+for+RhoA+and+RhoB,+but+not+RhoC.">XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC.</a> J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De methode die hier gepresenteerd is de enige beschikbare niet-radioactieve activatie test voor GEFs dat de actieve pool van GEFs in cellen kan volgen. De test is vergelijkbaar met de precipitatie assays voor na activering van kleine GTPases en GEFs tegen Rac en Cdc42. Deze verschillende assays GST-gemerkte eiwitten en hebben geringe afwijkingen van de hier beschreven, maar de basisstappen zijn hetzelfde. Zo kan dit protocol gemakkelijk worden aangepast voor andere kleine GTPase en GEF activatie assays. De gepresenteerde GEF-test werd onlangs aangepast voor toepassing voor nucleaire fracties 9,10. Met andere wijzigingen kunnen testen van GEF activatie andere subcellulaire compartimenten ook mogelijk. We maken gebruik van de gepresenteerde methode om de activering van GEFs in epitheliale cellijnen 5,6,7 te bestuderen. Bij sommige optimalisatie, moet deze test voldoende zijn om GEFs detecteren vanaf een cellijn. Wanneer adapting op een bepaald celtype, de meest optimale aantal cellen lysisbuffer volume en de detectie werkwijze voor het GEF te testen (een goede antilichaam voor Western blotting is belangrijk). Voor de eerste configuratie van de test is het raadzaam het gebruik van een stimulus waarvan bekend is dat het GEF van belang te activeren. Bij gebruik van een onbekende stimulus, gebruik dan altijd een positieve controle te controleren of uw test werkt. Deze test kan worden geactiveerd bekende GEFs detecteren door Western blotting. Het is echter ook voldoende te identificeren onbekende GEFs. Daartoe moeten gevangen GEFs van controle en gestimuleerd monsters worden geanalyseerd op een Coomassie-gekleurde gel. Bands die alleen verschijnen in gestimuleerd monsters kunnen bevatten geactiveerd GEFs en kan worden gestuurd voor identificatie met behulp van massaspectrometrie (bijv. 5). Tot slot een kritische noot. De test is gebaseerd op de aanname dat de post-translationele modificaties waardoor GEFs actieve bewaard na cellyse. Inderdaad, dit is duidelijk de case een aantal GEFs, en omdat de inrichtingen is deze test gebruikt bij de diverse tot de activering van verschillende GEFs, zoals GEF-H1, p115RhoGEF en XPLN (bijvoorbeeld 5,11,12,13) ​​detecteren. Behoud van de actieve toestand echter kan niet gebeuren bij alle GEFs en daarom is het denkbaar dat deze test niet werken voor alle GEFs. Het heeft ook te worden opgemerkt, dat veel GEFs activiteit uit te oefenen naar meer dan een kleine GTPases. Dus, als een specifieke GEF wordt bestudeerd, is het aan te raden om deze test te vullen met GEF neerslag assays voor andere kleine GTPases, maar ook functionele studies onderzoeken RhoA, Rac1 en Cdc42. Kritische stappen in het protocol: Kolonies van getransformeerde bacteriën moeten worden opgehaald van verse, goed voorbereid platen om een ​​adequate selectie door Amp, een goede uitgroei en opbrengst te garanderen. Transformatie voorwaarden voor competente cellen verkregen uit andere bronnen kan variëren en moet worden geraadpleegd. </p&gt; Alle stappen van de eiwitpreparaat protocol (van stap 2.3) en de assay (van stap 3.2) worden uitgevoerd bij 4 ° C gekoeld met oplossingen centrifuges. Bacteriële lysis (stap 2.5) moet grondig en volledig om een ​​homogene suspensie te verkrijgen. Wanneer het lyseren van de bacteriën, vortex afwisselend pipetteren het lysaat met behoud het op 4 ° C en zorgen sonicatie gebeurt op ijs voorkomen denaturering van de proteïne. Als u een ander model van ultrasoonapparaat kunnen er voorwaarden moeten worden aangepast. Incubatie van ultrasone trillingen met de kralen moet altijd worden gedaan bij 4 ° C op een rotator om voldoende binding te waarborgen, en zorg moeten worden genomen om de timing consistent. GST-Rho mutanten zijn enigszins instabiel, uitgedrukt in bacteriën, dus het is het beste om voorbereid kralen te gebruiken direct of binnen een paar dagen. De neerslag assay (deel 3) is het tijd en temperatuur gevoelig is, eenactieve GEFs gemakkelijk verloren het cellysaat, moet dus stappen worden uitgevoerd zo snel mogelijk. De volgende sectie bevat enkele het oplossen van problemen tips. Geen of zeer kleine hoeveelheid mutant Rho eiwit in de uiteindelijke korrel preparaat: Dit kan worden veroorzaakt door inefficiënte inductie onvoldoende lysis van de bacteriën of een verlies van het eiwit tijdens het bereidingsproces of opslag. Om problemen enkele van deze mogelijkheden kunnen monsters bacteriën worden onderzocht voor en na inductie. Als er slechte inductie van het eiwit herhaal het proces met behulp van een kolonie van een vers strepen plaat of van re-getransformeerde competente cellen. Verschillende IPTG concentraties en inductie tijden moeten ook worden getest. Als de lysis onvoldoende is (dat wil zeggen het eiwit blijft in de pellet in plaats van de supernatant) wisselende zout en afwasmiddel concentraties in de lysis buffer kan worden geprobeerd. Alternatieve sonicatie tijden eninstellingen moeten worden onderzocht, en monsters voor en na sonicatie kan worden gecontroleerd door middel van microscopisch om de efficiëntie van lysis te bepalen. Nr. neergeslagen GEF, terwijl de GST-eiwit aanwezig op de korrels: Dit kan vanwege technische problemen tijdens de precipitatie assay of een echte afwezigheid van activering van de onderzochte GEF met toegepaste stimulus. Gebruik altijd een bekende stimulus als een positieve controle om te controleren of uw test werkt. Gebruik de voorbereide kralen binnen een paar dagen. Als de test neerslag vangt detecteerbare hoeveelheden van de GEF onderzocht onder alle omstandigheden, controleert de GEF aanwezig is en goed detecteerbaar in de supernatant na centrifugeren die worden gebruikt voor de assay (stap 3.3). Zorg ervoor dat alle buffers en proteaseremmers vers zijn, en het uitvoeren van alle stappen op ijs zo snel mogelijk. Verhoog de hoeveelheid van de input-eiwit (bijvoorbeeld door gebruik te maken lysaten van 2 platen / monster). Als het neerslaan assay geeft basale neerslaguitvoering van de GEF, maar geen verschil wordt gezien tussen de controle en gestimuleerd monsters (afb. 4), start het oplossen van problemen door te controleren of de toegepaste prikkel gewerkt met behulp van andere bekende effecten (bijvoorbeeld door het detecteren van activatie van andere signaalwegen). Denk aan het veranderen van de behandeling voorwaarden en / of concentraties. Vertrouw op gegevens uit de literatuur rapportage hoe uw prikkel Rho of andere signalen activeert om te voorspellen waarschijnlijk tijden en concentraties. Bij het optimaliseren van de behandeling de tijd, gebruik maken van zowel korte als lange tijd punten, zoals GEF activering kan het best waarneembaar zijn op een tijdstip voorafgaand aan goed waarneembaar Rho activering. Tenslotte kan dezelfde stimulus tot een variabele mate van geactiveerd door een verandering in cel reactiviteit door passage nummer cel confluentie, etc.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> pGEX-RhoA (G17a) </td><td> Addgene </td><td> Zal binnenkort beschikbaar zijn </td><td> Gegenereerd in het lab van Dr Keith Burridge (University of North Carolina) (ref 3) </td></tr><tr><td> DH5a </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> Store -80 ° C </td></tr><tr><td> SOC medium </td><td> BioShop </td><td> SOC001.10 </td><td></td></tr><tr><td> LB </td><td> BioShop </td><td> LBL407.1 </td><td> Houd steriel </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> BioShop </td><td> GLY002.1 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicilline </td><td> BioShop </td><td> AMP201.25 </td><td> Store voorraad bij -20 ° C </td></tr><tr><td> Agar-agar </td><td> BioShop </td><td> AGR001.500 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (Isopropyl BD-thiogalacto-pyranoside) </td><td> Calbio-chem </td><td> 420322 </td><td> Store voorraad oplossing bij -20 ° C </td></tr><tr><td> Glutathion Sepharose kralen </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0756-01 </td><td></td></tr><tr><td> PBS 10x </td><td> SIGMA </td><td> D1408 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> SIGMA </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BioShop </td><td> SOD001.10 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> SIGMA </td><td> M-9272 </td><td> Voeg vlak voor gebruik </td></tr><tr><td> TX-100 </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> OmniPur EMD </td><td> 3860 </td><td> Voeg vlak voor gebruik </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> SIGMA </td><td> P-7626 </td><td> Voeg vlak voor gebruik </td></tr><tr><td> Protease Inhibitor 50x </td><td> BD Baculo-Gold </td><td> 51 21426Z </td><td> Voeg vlak voor gebruik </td></tr><tr&gt; <td> Compleet Mini, EDTA-free 10x </td><td> Roche </td><td> 11 836 170 001 </td><td> Voeg vlak voor gebruik </td></tr><tr><td> Laemmli monsterbuffer 2x </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0737 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercapto </td><td> SIGMA </td><td> M7154 </td><td> Voeg vlak voor gebruik </td></tr><tr><td> Coomassie Brilliant Blue </td><td> Bio-Rad </td><td> R-250 </td><td></td></tr><tr><td> Azijnzuur </td><td> Caledon </td><td> 1000-1 </td><td></td></tr><tr><td> Methanol </td><td> Caledon </td><td> 6701-7 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Rad Protein Assay </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0114 </td><td></td></tr><tr><td> Blueye ladder </td><td> FroggaBio </td><td> PM008-0500 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1. Reagentia gebruikt. <table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de apparatuur </td><td> Vennootschap </td&gt; <td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> RC-5B centrifuge </td><td> Sorvall </td><td> SS-34 rotor </td><td> Gebruik bij 4 ° C </td></tr><tr><td> Centrifugeer </td><td> Sorvall-Thermo Scientific </td><td> ST-16R </td><td> Gebruik bij 4 ° C </td></tr><tr><td> Micro centrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 5417R </td><td> Gebruik bij 4 ° C </td></tr><tr><td> Bacteriële shaker </td><td> INFORS HT Ecotron </td><td> AG CH-1403 Bottmingen </td><td> Gebruik bij 37 ° C of 22 ° C </td></tr><tr><td> Ultrasoonapparaat </td><td> Branson </td><td> Sonifier-450 </td><td> Gebruik bij RT </td></tr><tr><td> Rotator </td><td> Glas-Col </td><td> 099A CR4012 </td><td> Gebruik bij 4 ° C </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Gebruikte specifieke apparatuur.

affinity precipitation of active rho-gefs using a gst-tagged mutant rho protein (gst-rhoa(g17a)) from epithelial cell lysates

Eiwitten van de Rho familie van kleine GTPases staan ​​centraal regulatoren van het cytoskelet, en controle een grote verscheidenheid van cellulaire processen, waaronder cel-migratie, genexpressie, voortgang van de celcyclus en celadhesie 1. Rho eiwitten zijn moleculaire schakelaars die actief zijn in GTP-gebonden en inactief in het BBP-gebonden toestand. Hun activatie wordt gemedieerd door een familie van guanine-nucleotide Exchange Factor (GEF) eiwitten. Rho-GEFs vormen een grote familie, met overlappende specifieke kenmerken 2. Hoewel er veel vooruitgang is geboekt bij het identificeren van de GEFs geactiveerd door specifieke signalen, zijn er nog veel vragen bestaan ​​rond de route-specifieke regulatie van deze eiwitten. Het aantal van Rho-GEFs hoger is dan 70, en elke cel drukt meer dan een GEF eiwit. Bovendien zijn veel van deze eiwitten te activeren niet alleen Rho, maar andere leden van de familie, bij te dragen naar aanleiding van de complexiteit van de regelgeving netwerken. Belangrijk is dat het verkennen vanhoe GEFs worden geregeld is een methode om de actieve pool van individuele GEFs volgen cellen geactiveerd door verschillende stimuli. Hier zorgen wij voor een stap-voor-stap protocol voor een methode die wordt gebruikt om te beoordelen en kwantificeren van de beschikbare actieve Rho-specifieke GEFs met behulp van een affiniteit neerslag test. Deze test werd een paar jaar geleden ontwikkeld in de Burridge lab 3,4 en we hebben gebruikt in de nier tubulaire cellijnen 5,6,7. De assay maakt gebruik van een &quot;nucleotide vrij&quot; mutant RhoA met een hoge affiniteit voor actieve GEFs. De mutatie (G17a) maakt het eiwit niet in staat om te binden het BBP of GTP en deze staat bootst de tussenliggende staat die is gebonden aan het GEF. Een GST-gelabeld versie van deze mutant eiwit tot expressie en gezuiverd uit E. coli, gebonden aan glutathion sefarosekorrels en gebruikt voor het neerslaan actieve GEFs van lysaten van onbehandelde en gestimuleerde cellen. Aangezien de meeste GEFs worden geactiveerd via posttranslationele modificaties of ontheffing van remmende banden, hun actieve toestandbewaard in cellysaten en kunnen worden gedetecteerd door deze test 8. Gevangen eiwitten kunnen worden gezocht heeft naar bekende GEFs door detectie met specifieke antilichamen met behulp van Western blotting, of geanalyseerd met behulp van massaspectrometrie voor onbekende GEFs geactiveerd door bepaalde stimuli te identificeren.

Watch this Scientific Journal Video about Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates at JoVE.com

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates

De hier gepresenteerde methode beschrijft een assay voor activering van RhoA specifieke GDP / GTP uitruilfactoren (GEFs) in gekweekte cellen volgen door gebruik te maken van een gemuteerde RhoA GST fusieproteïne dat een hoge affiniteit voor geactiveerd GEFs heeft. GEFs worden neergeslagen uit cellysaten, gedetecteerd door Western blotting en gekwantificeerd door densitometrie.

Affiniteit Neerslag van Active Rho-GEFs Met behulp van een GST-gelabeld Mutant Rho Protein (GST-RhoA (G17a)) van epitheelcellen Lysaten

Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell ...

Research

JoVE Journal

Biology

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolatie van labiele Multi-eiwit-complexen door In vivo Gecontroleerde Cellulaire Cross-Linking and Immuno-magnetische affiniteitschromatografie

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) test voor eiwit-eiwit interactie in Onion cellen met behulp van de Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Blauwe Inheemse polyacrylamidegelelektroforese (BN-PAGE) voor de Analyse van multiprotein complexen van Cellular Lysaten

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipide bolletjes-gemedieerde affiniteitschromatografie met behulp van Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): een nieuwe methode om eiwit-lipide Interactie Analyze

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Chromatografische zuivering van sterk actieve gist Ribosomen

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Orthogonale Protein Purification Gesteund door een Small Bispecifieke Affiniteit Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Identificatie van eiwit Interactie partners met behulp van Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

Een vloeibare fase Affiniteit Capture test met behulp van magnetische korrels aan eiwit-eiwit interactie te bestuderen: het poliovirus-Nanobody Voorbeeld

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Een protocol voor faag display en Affiniteit selectie met recombinant eiwit Baits

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

Transgene knaagdieren Assay voor het kwantificeren van Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...