Name: affinity precipitation of active rho-gefs using a gst-tagged mutant rho protein (gst-rhoa(g17a)) from epithelial cell lysates
Uploaded: 2012-03-31T13:00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato dal Canadian Institute for Health Research (CIHR) (MOP-97774) e le scienze naturali e ingegneria Research Council of Canada (NSERC, concessione nr: 480.619). KS è destinatario di un New Investigator Award KRESCENT (un riconoscimento comune della Kidney Foundation of Canada, Canadian Society Nefrologia e Canadian Institute of Health Research) e un premio ricercatore alle prime armi grazie al Ministero della ricerca e dell&#39;innovazione. FW è supportato da una borsa di studio Li Ka Shing.

1. Trasformazione di E. coli con il pGEX-RhoA (G17A) Construct <ol><li> Preparare LB-Agar sciogliendo 2,5 g LB Agar e 1,5 g in 100 ml dH 2 O. Autoclave e raffreddare a circa 50-55 ° C, che, come regola generale, è quando il pallone può essere tenuto comodamente. </li><li> Preparare Ampicillina (Amp) azioni sciogliendo 50 mg / ml in DH 2 O. Siringa filtro e congelare aliquote inutilizzati. Aggiungere 100 ul di stock Amp (concentrazione finale 50 pg / ml) al LB-Agar da 1,1. Agitare e versare in 10 cm piatti batteriche (15-20 ml / piatto). Lasciare solidificare (15-30 min.) E conservare le piastre utilizzate invertite a 4 ° C per 2-3 settimane. </li><li> Per trasformare E. Coli, scongelare rapidamente una aliquota di cellule competenti DH5a in un bagno di ghiaccio. Aggiungere 1 ml di pGEXRhoA (G17A) DNA diluito a 25-50 ng / pl. Flick la provetta per miscelare e incubare su ghiaccio per 30 minuti. Shock termico a 42 ° C per 45 secondi e rimetterlo in ghiaccio per 2 minuti. Aggiungere 900 &amp; mu; L mezzo SOC e crescere per un&#39;ora a 37 ° C con agitazione. </li><li> Diffusione 50-100 microlitri dei batteri trasformati su un LB-Agar-Amp piastra usando una pipetta Pasteur sterile piegata. Incubare la piastra di lato destro in un incubatore a 37 ° C per 5 minuti e poi invertire e crescere durante la notte. </li><li> Una singola colonia verranno prelevati dalla piastra per la preparazione della proteina GST-tag (passo 2.1). Per uso futuro, piastre avvolgere e conservare invertita a 4 ° C per circa 3 settimane. Inoltre, ceppi batterici possono essere preparate per la conservazione più prolungato da crescenti colonie individuali in 2 ml sterile LB-Amp notte a 37 ° C con agitazione. Mescolare un&#39;aliquota sterile con glicerolo 80% in rapporto 1:1 e congelare a -80 ° C. </li></ol> 2. Preparazione di GST-RhoA (G17A) Perle <ol><li> Preparare LB LB aggiungendo 25 g di L dH 1 2 0 e sterilizzazione in autoclave. Lasciar raffreddare, aggiungere 50 microlitri Amp da stock a 50 LB ml (50 mcg / ml concentrazione finale). Inoculare con un col ben isolataony di batteri trasformati e crescere durante la notte a 37 ° C con agitazione. Quando alla massima densità (OD 600&gt; 1.0) diluire con 450 ml di LB-Amp e crescere per altri 30 minuti a 37 ° C. </li><li> Preparare una soluzione stock 100 mM di Isopropyl BD-tiogalattopiranoside (IPTG) sciogliendo 0,238 g in 10 ml di dH 2 O. Conservare in aliquote a -20 ° C. Indurre batteri per produrre proteine ​​Rho aggiungendo 500 pl di 100 mM IPTG a 500 cultura ml (concentrazione finale di 100 pM). Ridurre la temperatura a 22-24 ° C e far crescere per ~ 16 ore h. </li><li> Spin coltura a 3600 g per 10 minuti a 4 ° C. Se necessario, la cultura 500 ml possono essere suddivisi in provette da 50 ml per centrifugazione. Fermo pellet (s) per almeno 1 ora (o preferibilmente durante la notte) a -80 ° C. </li><li> Preparare 200 ml di tampone di lisi contenente 20 mM HEPES (0,95 g) / pH 7,5, 150 mM NaCl (1,75 g), 5 mM MgCl 2 (0,203 g), 1% TX-100 (2 ml). Preparare soluzioni di 1M di DTT (1,542 g in 10 ml di dH 2 O) E 100 mM PMSF (0,174 g/10 ml EtOH). Per preparare tampone + lisi, supplemento del 10 ml con 1mM DTT (10 pl di stock) e 1 mM PMSF (100 pl di stock) e una completa tablet Mini inibitore della proteasi. </li><li> Lavorando su ghiaccio, aggiungere 10 ml di tampone di lisi + al tipo di pellet a partire dal punto 2.3. Risospendere accuratamente vortex dolce e pipettaggio. Evitare la formazione di schiuma. Sonicare su ghiaccio per 1 minuto a fissare 4 con 50% di impulsi. Centrifugare il lisato sonicato a 15.000-20.000 g per 15 minuti a 4 ° C, e rimuovere il sonicare chiarito (surnatante) in una provetta sterile limite massimo 15 ml. </li><li> Preparare la glutatione Sepharose mescolando delicatamente il tubo originale contenente uno slurry 75% e 335 microlitri di trasferimento in una provetta da 15 ml. Utilizzare una punta larga foro di dispensare perle. Aggiungere 10 ml di PBS freddo, e far girare 500 g per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante, aggiungere 1 ml di tampone di lisi + ai talloni, come girare per il lavaggio precedente. Eliminare il surnatante e aggiungere + tampone di lisi per fare un impasto al 50%. </li><li> Aggiungere 250 microlitri di equilibrated slurry tallone al supernatante dal passaggio 2,5. Ruota a 4 ° C per 45 minuti. </li><li> Preparare 500 ml HBS contenente HEPES 20 mM (2,38 g) / pH 7,5 150 mM e NaCl (4,38 g) in DH 2 O. Preparare soluzioni di 1M di MgCl 2 (0,952 g in 10 ml di dH 2 O) e 1M DTT (1,542 g in 10 ml di dH 2 O). Per preparare HBS +, integra 100 ml poco prima di usare con 5 mM MgCl 2 (50 microlitri dal magazzino) e 1 mM DTT (100 microlitri dal magazzino). </li><li> Centrifugare le microsfere dal passaggio 2,7 a 500 g per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare le perline supernatante e lavare 2x con 10 ml + tampone di lisi, e 2 volte con 10 ml HBS +. Dopo l&#39;ultimo lavaggio, una slurry 50% risospendendo le perle di HBS + supplementate con BD BaculoGold inibitore della proteasi (20 pl di 50x BD BaculoGold / ml). </li><li> Diluire 10 pl della preparazione finale perle con tampone Laemmli 2x campione contenente β-mercaptoetanolo. Fai albumina sierica bovina (BSA) standard. Utilizzare a 2 mg / ml stock (0,02 g di BSA in 10 ml dH 2 O). Mescolare 10 pl di magazzino con 10 microlitri Laemmli (20 mg finale), 5 pl di magazzino con 5 pl di DH 2 O e 10 microlitri Laemmli (10 mg finale), e 2,5 microlitri magazzino con 7,5 microlitri dH 2 O e 10 pl Laemmli (5 mg finale). Far bollire tutti i campioni (5 min). Spin il campione tallone ed eseguire surnatante con standard BSA e marcatori di peso molecolare su 10% SDS-gel di poliacrilammide. </li><li> Preparare la Comassie Blu macchia (0,1 g in 10 ml di acido acetico, 40 ml di metanolo e 50 ml dH 2 O) e la soluzione Decolorare (500 ml dH 2 O, 400 ml di metanolo e 100 ml di acido acetico). Conservare a temperatura ambiente. Colorare il gel per 20-30 minuti, togliere il colorante (che può essere riutilizzato più volte) e risciacquare con la soluzione Decolorare due volte. Continuare a Decolorare con agitazione delicata per diverse ore fino a quando le bande sono chiaramente visibili. </li><li> Stimare la concentrazione di GST-RhoA (G17A) accoppiato ai talloni secondo gli standard BSA come riferimento (Fig. 2). Aliquot un volume equivalente di perle contenenti ~ 10-15 pg di proteina in provette da 1,5 ml micro centrifuga. Perline Conservare a 4 ° C per utilizzare in un giorno. Congelare a -80 ° C in HBS + / glicerolo in un rapporto 3:1 di utilizzare entro pochi giorni. </li></ol> 3. GEF Assay Pulldown con Nucleotide-free RhoA (G17A) Perle <ol><li> Coltivare cellule in 10 piatti cm a confluenza. Serum privare per almeno 3 ore e trattare come richiesto. </li><li> Preparare tampone di lisi + come nel passaggio 2,4. Preparare abbastanza tampone di lisi per 700 pl / piatto più alcune quantità extra per consentire pipettaggio errori. Aggiungere gli inibitori della proteasi appena prima dell&#39;uso. </li><li> Lavorando su ghiaccio, togliere terreno di coltura dai piatti e lavare con gelida HBS. Rimuovere tutti i HBS e aggiungere 700 microlitri + tampone di lisi per ogni piatto. Swirl piastre per coprire tutte le aree, raschiare e raccogliere lisati numerati in provette da 1,5 ml. Spin a 15.000 g per 1 min a 4 ° C. Il supernatante viene usato per il saggio. </li><li> Se il vostro numero di cellulare è equivalente in tutti gliPiatti in fase di test, è possibile omettere facendo un saggio proteico e passare al punto 3.5. Altrimenti misurare la concentrazione proteica di ciascun supernatante utilizzando Bio-Rad saggio rapido proteine ​​e equalizzare il supernatante per il volume e la concentrazione. La quantità di proteina totale dipende dai tipi di cellule utilizzate (tipicamente 1-1,5 mg di proteina per cellule LLC-PK1). </li><li> Rimuovere 30 microlitri di ciascun supernatante e mescolare con 30 microlitri 2x riducendo campione Laemmli buffer, bollire e mettere da parte per il passaggio 3.7. Aggiungi surnatanti rimanenti aliquote delle GST-RhoA (G17A) perle a partire dal punto 2.12. Ruota per 45 minuti a 4 ° C. </li><li> Spin perline a 6800 g per 10 secondi a 4 ° C. Eliminare il supernatante e lavare le perline 3x con tampone di lisi, la filatura allo stesso modo tra un lavaggio. Rimuovere completamente il lavaggio finale con una siringa da 1 cc dotato di un ago da 30 G e aggiungere 20 microlitri 2x riducendo tampone campione Laemmli. Far bollire per 5 min. Gira per perline e pellet o eseguire il surnatante immediatamente (preferibile) o memorizzare unt -80 ° C per una successiva analisi. </li><li> Eseguire 20 pl lisati cellulari totali e tutti i campioni di proteine ​​precipitate sul appropriata percentuale di SDS-poliacrilammide gel per le dimensioni della GEF si stanno studiando. Rileva la tua GEF di scelta mediante Western blotting utilizzando un anticorpo specifico. </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Parte 1 e 2 del protocollo descrive preparazione di GST-RhoA (G17A) accoppiato a GSH-sepharose perline e la sua prova mediante SDS-PAGE (v. schema di protocollo figura 1). Un tipico gel colorato con Coomassie è mostrato in Figura 2. Il campione con la proteina eluita dovrebbe contenere una singola banda di circa 50 kDa (Fig. 2, corsia 6). La concentrazione della proteina può essere stimato utilizzando i campioni di riferimento BSA. Nell&#39;esempio di Fig. 2, la concentrazione di RhoA (G17A) è stimato essere μg/10 15 pl. Così, aliquote di 10 microlitri / provetta sono stati preparati. La resa tipica<html> in mano è 15-20 pg di proteina da 10 ml lisi batterica. Parte 3 del protocollo descrive il saggio precipitazioni affinità (vedi tabella in Fig. 1). Un saggio di successo GEF rilevare l&#39;attivazione del fattore di scambio GEF-H1 è mostrato in Figura 3. L&#39;(G17A) RhoA proteine ​​catturato alcuni GEF-H1 dal controllo (non trattato) lisati cellulari, suggerendo che GEF-H1 ha attività basale. L&#39;importo precipitato comunque aumenti di cellule trattate con il infiammatoria Tumor Necrosis Factor-α citochine (TNF-α), in linea con l&#39;idea che il TNF-α attiva GEF-H1 5,7. Cosa importante, i lisati cellulari totali mostrano quantità simili di GEF-H1 nel controllo e il campione trattato, suggerendo che il trattamento non alterava GEF-H1 livelli e l&#39;ingresso utilizzato nel saggio è uguale. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig1.jpg" /> Figura 1. Panoramica del protocollo. ove_content &quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig2.jpg" /> Figura 2. Risultato Rappresentante del protocollo di preparazione tallone. Un gel colorato con Coomassie successo GST-RhoA (G17A) preparazione di microsfere viene mostrato. Campione perlina e standard proteina BSA sono state separate per SDS-PAGE usando un gel di acrilammide 10%. Per testare le perline, 10 microlitri della sospensione finale tallone contenente GST-RhoA (G17A) viene diluito 1:1 con riduzione tampone campione Laemmli e bollito per 5 minuti. Le perle sono state filate brevemente e il supernatante caricato sul gel. Gli esempi seguenti sono stati caricati: corsia 1: marcatore di peso molecolare (MW) (FroggaBio Blueye prestained scala delle proteine); Lanes 2-4: mg 5, 10 e 20 sieroalbumina bovina (BSA), corsia 5 è vuota; corsia 6: 10 pl dei preparati al momento RhoA (G17A) perline. Dopo la separazione è completata, il gel viene colorato con Coomassie Blu e successivamente decolorato rivelare proteine. Il peso molecolare del GST-RhoA (G17A) proteina è approssimativamente 50<html> kDa e corre lungo il livello del marcatore 48 kDa. La concentrazione della proteina GST-Rho in questo esempio particolare è stimato a circa 15 microlitri μg/10 slurry. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig3.jpg" /> Figura 3. Rappresentativa GEF saggio attivazione mostra TNF-α-indotta attivazione di GEF-H1. Confluenti LLC-PK1 cellule sono state trattate con 10 ng / ml TNF-α per 5 minuti. Dopo il trattamento le cellule sono state lisate e GEFs attivi sono stati catturati utilizzando GST-RhoA (G17A) perle legate. La presenza di GEF-H1 nelle proteine ​​precipitate blot (superiore) e in totale campioni lisato cellulare (blot fondo) è stata rivelata utilizzando Western blotting con un anticorpo anti-GEF-H1 (Cell Signaling). Notare la maggiore quantità di precipitato GEF-H1 in TNF-α-trattate rispetto a cellule relativi agli ingressi equivalenti non trattati, che indica un risultato positivo. 3932/3932fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Un &quot;risultato negativo&quot;. Sebbene il dosaggio tendina GEF mostrato qui come risultato alcuni GEF-H1 catturato dalle perline, gli importi precipitato da controllo e TNF-α-cellule trattate sono uguali. Così TNF-α, un attivatore di conoscenze GEF-H1 in questo caso non ha indotto l&#39;attivazione. In questo particolare esperimento risoluzione dei problemi successivo suggerito che il TNF-α utilizzato non era abbastanza fresco e probabilmente degradato.

<ol>
	<li>Jaffe, A. B., Hall, A. R. h. o. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPases:+biochemistry+and+biology.">GTPases: biochemistry and biology.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 247-269 (2005).</li><li>Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEF+means+go:+turning+on+RHO+GTPases+with+guanine+nucleotide-exchange+factors.">GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 167-180 (2005).</li><li>Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPLN,+a+guanine+nucleotide+exchange+factor+for+RhoA+and+RhoB,+but+not+RhoC.">XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC.</a> J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).</li><li>Garcia-Mata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+activated+GAPs+and+GEFs+in+cell+lysates.">Analysis of activated GAPs and GEFs in cell lysates.</a> Methods Enzymol. 406, 425-437 (2006).</li><li>Kakiashvili, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEF-H1+Mediates+Tumor+Necrosis+Factor-{alpha}-induced+Rho+Activation+and+Myosin+Phosphorylation:+role+in+the+regulation+of+tubular+paracellular+permeability.">GEF-H1 Mediates Tumor Necrosis Factor-{alpha}-induced Rho Activation and Myosin Phosphorylation: role in the regulation of tubular paracellular permeability.</a> J. Biol. Chem. 284, 11454-11466 (2009).</li><li>Waheed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+signal+regulated+kinase+and+GEF-H1+mediate+depolarization-induced+Rho+activation+and+paracellular+permeability+increase.">Extracellular signal regulated kinase and GEF-H1 mediate depolarization-induced Rho activation and paracellular permeability increase.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. , (2010).</li><li>Kakiashvili, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermal+growth+factor+receptor+mediates+tumor+necrosis+factor-alpha-induced+activation+of+the+ERK/GEF-H1/RhoA+pathway+in+tubular+epithelium.">The epidermal growth factor receptor mediates tumor necrosis factor-alpha-induced activation of the ERK/GEF-H1/RhoA pathway in tubular epithelium.</a> J. Biol. Chem. 286, 9268-9279 (2011).</li><li>Garcia-Mata, R., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catching+a+GEF+by+its+tail.">Catching a GEF by its tail.</a> Trends Cell Biol. 17, 36-43 (2007).</li><li>Dubash, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+GTPase+RhoA+localizes+to+the+nucleus+and+is+activated+by+Net1+and+DNA+damage+signals.">The small GTPase RhoA localizes to the nucleus and is activated by Net1 and DNA damage signals.</a> PLoS One. 6, e17380-e17380 (2011).</li><li>Guilluy, G., Dubash, A. D., Garc&#237;a-Mata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RhoA+and+Rho+GEF+activity+in+whole+cells+and+the+cell+nucleus.">Analysis of RhoA and Rho GEF activity in whole cells and the cell nucleus.</a> Nature Protocols. , (2011).</li><li>Guilluy, C., Swaminathan, V., Garcia-Mata, R., O'Brien, E. T., Superfine, R., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+GEFs+LARG+and+GEF-H1+regulate+the+mechanical+response+to+force+on+integrins.">The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins.</a> Nature Cell Biology. 13, 722-727 (2011).</li><li>Dubash, A. D., Wennerberg, K., Garcia-Mata, R., Menold, M. M., Arthur, W. T., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Lsc/p115+RhoGEF+and+LARG+in+regulating+RhoA+activity+downstream+of+adhesion+to+fibronectin.">A novel role for Lsc/p115 RhoGEF and LARG in regulating RhoA activity downstream of adhesion to fibronectin.</a> J. Cell Sci. 120, 3989-3998 (2007).</li><li>Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPLN,+a+guanine+nucleotide+exchange+factor+for+RhoA+and+RhoB,+but+not+RhoC.">XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC.</a> J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo qui presentato è l&#39;unico disponibile non radioattivo test di attivazione per GEFs che possono seguire il pool attivo di GEFs nelle cellule. Il saggio è simile ai saggi utilizzati per precipitazione dopo l&#39;attivazione delle piccole GTPasi nonché GEFs contro Rac e Cdc42. Quei saggi utilizzare diversi GST-tagged proteine ​​e hanno lievi differenze da quella descritta qui, tuttavia i passaggi di base sono gli stessi. Così, questo protocollo può essere facilmente adattato per altre piccole GTPasi e saggi di attivazione GEF. Il saggio presentato GEF è stato recentemente modificato per l&#39;applicazione per le frazioni nucleari 9,10. Con ulteriori modifiche, il test di attivazione GEF in altri comparti subcellulari potrebbe anche essere possibile. Si utilizza il metodo descritto per studiare l&#39;attivazione di GEFs in linee cellulari epiteliali 5,6,7. Con un po &#39;ottimizzazione, questo test dovrebbe essere in grado di individuare GEFs da qualsiasi linea cellulare. Quando adapting a un tipo di cellula specifico, trovare il numero ottimale di cellule, il volume tampone di lisi, e metodo di rilevazione per GEF da testare (un anticorpo buona per Western blotting è importante). Per la configurazione iniziale del saggio è consigliabile utilizzare uno stimolo che è noto per attivare la GEF di interesse. Quando si utilizza uno stimolo sconosciuto, utilizzare sempre un controllo positivo per verificare che il test sta funzionando. Questa analisi può essere utilizzato per rilevare l&#39;attivazione di GEFs noti Western blotting. Tuttavia, è anche adeguati per individuare GEFs sconosciute. Per questo, GEFs catturati dal controllo e stimolati campioni dovrebbero essere analizzati su un Coomassie macchiato di gel. Bands che appaiono solo nei campioni stimolati potrebbe contenere GEFs attivati ​​e possono essere inviati per l&#39;identificazione mediante spettrometria di massa (ad esempio 5). Infine, una nota di cautela. Il saggio è basato sul presupposto che le modifiche post-traduzionali rendendo GEFs attivi vengano mantenute dopo lisi cellulare. In effetti, questo è chiaramente il case per una serie di GEFs, e poiché i suoi stabilimenti, questo test è stata utilizzata da vari gruppi per rilevare l&#39;attivazione di GEFs diverse, tra cui GEF-H1, p115RhoGEF e XPLN (ad esempio, 5,11,12,13). Conservazione dello stato attivo, tuttavia, non potrebbe accadere in caso di tutti GEFs, e quindi è ipotizzabile che questo test non funziona per tutti i GEFs. Si deve anche notare che molti GEFs esercitano un&#39;attività verso più di piccole GTPasi. Così, quando una specifica GEF si studia, si consiglia di completare questo test con analisi delle precipitazioni del GEF per altre piccole GTPasi, così come gli studi funzionali esame RhoA, Rac1 e Cdc42. Passaggi critici del protocollo: Le colonie di batteri trasformati devono essere prelevate da fresche, piatti adeguatamente preparati ad assicurarne la selezione adeguato da Amp, outgrowth buona e la resa. Condizioni di trasformazione per cellule competenti provenienti da altre fonti possono variare e dovrebbe essere consultato. </p&gt; Tutte le fasi del protocollo preparazione proteica (dal punto 2,3) e il saggio (dal punto 3.2) deve essere eseguita a 4 ° C con soluzioni raffreddate e centrifughe. Lisi batterica (passo 2,5) dovrebbe essere approfondita e completa per ottenere una sospensione omogenea. Quando la lisi, batteri vortice e pipettare il lisato alternativamente, pur mantenendo a 4 ° C e garantire sonicazione è fatto su ghiaccio per impedire la denaturazione proteica. Se si utilizza un diverso modello di ultrasuoni, le condizioni possono essere necessario un aggiustamento. L&#39;incubazione di ultrasuoni con le perle devono essere sempre fatto a 4 ° C su un agitatore per assicurare vincolante sufficiente, e occorre prestare attenzione a mantenere la tempistica coerente. GST-Rho mutanti sono un po &#39;instabile quando espressa in batteri, quindi è meglio usare perline preparati immediatamente o entro pochi giorni. Il saggio di precipitazioni (parte 3) è il tempo e sensibile alla temperatura, uns GEFs attivi possono essere facilmente perso dal lisato cellulare, così procedura deve essere eseguita più rapidamente possibile. La seguente sezione contiene alcuni suggerimenti sulla risoluzione dei problemi. Nessuna o quantità molto bassa di proteina mutante Rho nella preparazione finale tallone: ​​Questo può essere causato da induzione inefficiente, insufficiente lisi dei batteri, o una perdita della proteina durante il processo di preparazione o di stoccaggio. Per risolvere alcune di queste possibilità, campioni di batteri possono essere analizzati prima e dopo l&#39;induzione. Se vi è scarsa induzione della proteina ripetere il processo usando una colonia da una piastra appena striature o da re-trasformate cellule competenti. Concentrazioni di IPTG e tempi diversi induzione dovrebbe anche essere testato. Se la lisi è insufficiente (cioè la proteina rimane nel pellet invece del surnatante) variando le concentrazioni di sale e detersivo nel tampone di lisi può essere provato. Alternativi e tempi di sonicazioneimpostazioni dovrebbe essere considerato, e campioni prima e dopo sonicazione può essere controllato mediante microscopia per determinare l&#39;efficienza di lisi. No precipitato GEF, anche se la GST-proteina è presente sulle perle: Ciò può essere dovuto a problemi tecnici durante il saggio precipitazione, o da una reale assenza di attivazione del GEF studiata utilizzando lo stimolo applicato. Usare sempre uno stimolo conosciuto come un controllo positivo per verificare che il test funziona. Utilizzare le perline preparate in pochi giorni. Se il saggio precipitazione cattura quantità rilevabili di GEF studiati in tutte le condizioni, verificare che il GEF è presente ed è ben rilevabile nel supernatante dopo centrifugazione che deve essere usato per il saggio (passo 3.3). Assicurarsi che tutti i buffer e inibitori della proteasi sono freschi, ed eseguire tutti i passaggi su ghiaccio il più velocemente possibile. Aumentare la quantità di proteine ​​di input (ad esempio utilizzando lisati da 2 piastre / campione). Se il saggio di precipitazione mostra basale precipitazionezione del GEF, ma nessuna differenza si vede tra il controllo e dei campioni stimolati (Fig. 4), avviare la risoluzione dei problemi verificando che lo stimolo applicato lavorato con altri noti effetti (ad esempio rilevando l&#39;attivazione di altre vie di segnalazione). Si consiglia di modificare le condizioni di trattamento e / o concentrazioni. Si basano sui dati della letteratura di riferimento come il vostro stimolo attiva Rho o di segnalazione di altri per predire i tempi probabili e concentrazioni. Quando ottimizzando i tempi di trattamento, utilizzare entrambi i punti di tempo breve e lungo, come l&#39;attivazione GEF potrebbe essere meglio rilevabile in un punto temporale precedente a ben rilevabile l&#39;attivazione Rho. Infine, lo stesso stimolo potrebbe comportare un grado variabile di attivazione a causa di un cambiamento in risposta delle cellule causata dal numero di passaggio, cellule confluenza, ecc

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome di reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> pGEX-RhoA (G17A) </td><td> Addgene </td><td> Sarà presto disponibile </td><td> Generato nel laboratorio del Dr. Keith Burridge (University of North Carolina) (rif 3) </td></tr><tr><td> DH5a </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> Conservare -80 ° C </td></tr><tr><td> SOC media </td><td> Bioshop </td><td> SOC001.10 </td><td></td></tr><tr><td> LB </td><td> Bioshop </td><td> LBL407.1 </td><td> Tenere sterile </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Bioshop </td><td> GLY002.1 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td> Bioshop </td><td> AMP201.25 </td><td> Magazzino Conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> Agar </td><td> Bioshop </td><td> AGR001.500 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (Isopropil BD-thiogalacto-pyranoside) </td><td> Calbio-chem </td><td> 420322 </td><td> Conservare la soluzione di magazzino a -20 ° C </td></tr><tr><td> Glutatione Sepharose perline </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0756-01 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> SIGMA </td><td> D1408 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> SIGMA </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Bioshop </td><td> SOD001.10 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> SIGMA </td><td> M-9272 </td><td> Aggiungere poco prima dell&#39;uso </td></tr><tr><td> TX-100 </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> OmniPur EMD </td><td> 3860 </td><td> Aggiungere poco prima dell&#39;uso </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> SIGMA </td><td> P-7626 </td><td> Aggiungere poco prima dell&#39;uso </td></tr><tr><td> Inibitore della proteasi 50x </td><td> BD Baculo-Gold </td><td> 51-21426Z </td><td> Aggiungere poco prima dell&#39;uso </td></tr><tr&gt; <td> Complete Mini, EDTA-free 10x </td><td> Roche </td><td> 11 836 170 001 </td><td> Aggiungere poco prima dell&#39;uso </td></tr><tr><td> Laemmli Sample buffer 2x </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0737 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanolo </td><td> SIGMA </td><td> M7154 </td><td> Aggiungere poco prima dell&#39;uso </td></tr><tr><td> Coomassie Brilliant Blue </td><td> Bio-Rad </td><td> R-250 </td><td></td></tr><tr><td> Acido acetico </td><td> CALEDON </td><td> 1000-1 </td><td></td></tr><tr><td> Metanolo </td><td> CALEDON </td><td> 6701-7 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Rad Protein Assay </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0114 </td><td></td></tr><tr><td> Blueye ladder </td><td> FroggaBio </td><td> PM008-0500 </td><td></td></tr></tbody></table> Reagenti Tabella 1. Utilizzato. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome di apparecchiature </td><td> Azienda </td&gt; <td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> RC-5B centrifuga </td><td> Sorvall </td><td> SS-34 Rotor </td><td> Utilizzare a 4 ° C </td></tr><tr><td> Centrifuga </td><td> Sorvall-Thermo Scientific </td><td> ST-16R </td><td> Utilizzare a 4 ° C </td></tr><tr><td> Centrifuga Micro </td><td> Eppendorf </td><td> 5417R </td><td> Utilizzare a 4 ° C </td></tr><tr><td> Batterica shaker </td><td> INFORS HT Ecotron </td><td> AG CH-1403 Bottmingen </td><td> Utilizzare a 37 ° C oa 22 ° C </td></tr><tr><td> Sonicator </td><td> Branson </td><td> Sonifier-450 </td><td> Utilizzare a RT </td></tr><tr><td> Rotator </td><td> Glas-Col </td><td> 099A CR4012 </td><td> Utilizzare a 4 ° C </td></tr></tbody></table> Attrezzature Tabella 2. Utilizzato.

affinity precipitation of active rho-gefs using a gst-tagged mutant rho protein (gst-rhoa(g17a)) from epithelial cell lysates

Le proteine ​​della famiglia Rho delle piccole GTPasi sono regolatori centrali del citoscheletro, e controllare una grande varietà di processi cellulari, compresa la migrazione cellulare, l&#39;espressione genica, la progressione del ciclo cellulare e l&#39;adesione cellulare 1. Proteine ​​Rho sono interruttori molecolari che sono attivi in ​​GTP-bound e inattivo in termini di PIL-bound stato. La loro attivazione è mediata da una famiglia di guanina nucleotide cambio Factor (GEF) proteine. Rho-GEFs costituiscono una grande famiglia, con sovrapposizione di due specificità. Anche se molti progressi sono stati realizzati nella definizione delle GEFs attivati ​​da segnali specifici, ci sono ancora molte domande in sospeso inerenti al via la regolamentazione specifica di queste proteine. Il numero di Rho-GEFs supera 70, e ciascuna cellula esprime più di una proteina GEF. Inoltre, molte di queste proteine ​​Rho attivare non solo, ma altri membri della famiglia, contribuendo ulteriormente alla complessità delle reti di regolazione. È importante sottolineare che, esplorandocome sono regolati GEFs richiede un metodo per seguire la piscina attiva di GEFs singoli nelle cellule attivate da stimoli diversi. Qui noi forniamo un passo-passo protocollo per un metodo utilizzato per valutare e quantificare le attivi disponibili Rho-specifici GEFs utilizzando un saggio precipitazione affinità. Questo test è stato sviluppato alcuni anni fa nel laboratorio Burridge 3,4 e lo abbiamo utilizzato nelle linee di cellule tubulari renali 5,6,7. Il saggio si avvale di un &quot;nucleotide libero&quot; mutante RhoA, con una elevata affinità per GEFs attivi. La mutazione (G17A) rende la proteina in grado di legare PIL o GTP e questo stato imita lo stato intermedio, che è legato al GEF. Una versione GST-tag di questa proteina mutante è espressa e purificata da E. coli, legati al glutatione perline sepharose e utilizzato per far precipitare GEFs attivi da lisati di cellule non trattate e stimolata. Poiché la maggior parte GEFs vengono attivati ​​attraverso modifiche post-traduzionali o il rilascio di associazioni inibitorie, il loro stato attivoè conservato in lisati cellulari, e possono essere rilevate da questo saggio 8. Proteine ​​catturate possono essere sondato per GEFs noti dal rilevamento con anticorpi specifici utilizzando Western blotting, o analizzati mediante spettrometria di massa per identificare GEFs sconosciuti attivate da certi stimoli.

Watch this Scientific Journal Video about Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates at JoVE.com

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates

Il metodo qui presentato descrive un saggio per seguire l&#39;attivazione di specifici RhoA PIL / GTP Fattori di cambio (GEFs) in cellule coltivate facendo uso di una proteina di fusione GST RhoA mutante che ha un&#39;elevata affinità per GEFs attivati. GEFs vengono precipitati da lisati cellulari, rilevati da Western blotting e quantificato mediante densitometria.

Affinità Precipitazioni di Active Rho-GEFs Utilizzo di un GST-tagged Mutant proteina Rho (GST-RhoA (G17A)) da lisati di cellule epiteliali

Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell ...

Research

JoVE Journal

Biology

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolamento di Labile Multi-proteina complessi da In vivo Controllato Cellular Cross-Linking e Immuno-magnetica Cromatografia di affinità

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Ricerca

Biologia

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Biomolecolare fluorescenza complementazione (BiFC) Assay per interazione proteina-proteina nelle cellule Cipolla Utilizzando la Helios Gun Gene

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Blu nativi poliacrilammide gel elettroforesi (BN-PAGE) per l&#39;analisi di complessi multiproteici da lisati cellulari

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Vescicole lipidiche-mediata Cromatografia di affinità mediante Magnetic separazione delle cellule attivate (LIMACS): un nuovo metodo per l&#39;analisi delle interazioni proteina-lipide

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Purificazione cromatografica dei ribosomi di lievito Highly Active

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Purificazione delle proteine ​​ortogonali Facilitato da una piastrina Affinity Bispecific

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Individuazione di partner proteine ​​interagenti mediante Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

Un liquido fase di cattura test affinità utilizzando biglie magnetiche per studiare interazioni proteina-proteina: il poliovirus-Nanobody Esempio

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Un protocollo per Phage Display e affinità selezione con esche proteina ricombinante

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

Transgenici Roditore Assay per quantificare Maschio cellule germinali Mutant Frequenza

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...