Name: affinity precipitation of active rho-gefs using a gst-tagged mutant rho protein (gst-rhoa(g17a)) from epithelial cell lysates
Uploaded: 2012-03-31T13:00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av Canadian Institute for Health Research (CIHR) (MOP-97774) og Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC, tilskudd nr: 480619). KS er en mottaker av en KRESCENT New Investigator Award (en felles tildeling av Kidney Foundation of Canada, kanadisk Nefrologi Society og Canadian Institute of Health Research) og en tidlig Forsker Award fra Ontario Ministry of Research and Innovation. FW er støttet av en Li Ka Shing stipend.

1. Transformasjon av E. coli med pGEX-RhoA (G17A) Construct <ol><li> Forbered LB-agar ved oppløsning av 2,5 g LB og 1,5 g Agar i 100 ml dH 2 O. Autoklaven og kjølig til anslagsvis 50-55 ° C, som i en tommelfingerregel, er når kolben kan holdes komfortabelt. </li><li> Forbered Ampicillin (AMP) lager ved oppløsning av 50 mg / ml i dH 2 O. Sprøyte filter og fryse ubrukte alikvoter. Tilsett 100 mL av Amp lager (endelig konsentrasjon 50 mg / ml) til LB-Agar fra 1.1. Swirl å blande og helle i 10 cm bakterielle retter (15-20 ml / fat). La den stivne (15-30 min.) Og lagre ubrukte plater invertert ved 4 ° C i 2-3 uker. </li><li> For å transformere E. Coli, raskt tine en delmengde av DH5α kompetente celler i et isbad. Legg en mL av pGEXRhoA (G17A) DNA fortynnet til 25-50 ng / mL. Flick røret for å blande og inkuber på is i 30 minutter. Heat sjokk ved 42 ° C i 45 sekunder og legg tilbake på is i 2 minutter. Legg 900 &amp; mu; L SOC medium og vokse i en time ved 37 ° C med risting. </li><li> Spre 50-100 mL av de transformerte bakterier på en LB-agar-Amp plate ved hjelp av en bøyd steril Pasteur pipette. Inkuber platen høyre opp i en 37 ° C inkubator i 5 minutter, og deretter snu og vokse over natten. </li><li> En enkelt koloni vil bli hentet fra platen for utarbeidelse av GST-tagget protein (trinn 2,1). For fremtidig bruk, pakk og butikk plater invertert ved 4 ° C i ca 3 uker. I tillegg kan bakterielle aksjer være forberedt på mer langvarig lagring av voksende enkelte kolonier i 2 ml sterilt LB-Amp natten ved 37 ° C med risting. Bland en delmengde med steril 80% glycerol i forholdet 1:1 og fryse ved -80 ° C. </li></ol> 2. Utarbeidelse av GST-RhoA (G17A) Perler <ol><li> Forbered LB ved å legge 25 g LB til en L dH 2 0 og autoklavering. Når kjølig, tilsett 50 mL Amp fra lager til 50 ml LB (50 mikrogram / ml endelig konsentrasjon). Inokuler med en godt isolert colony av transformerte bakterier og vokse over natten ved 37 ° C med omrøring. Når full tetthet (OD 600&gt; 1,0) fortynnes med 450 ml LB-Amp og vokse ytterligere 30 minutter ved 37 ° C. </li><li> Forbered en 100 mm stamløsning av Isopropyl BD-thiogalactopyranoside (IPTG) ved å løse opp 0.238 g i 10 ml dH 2 O. Oppbevares i alikvoter ved -20 ° C. Fremkall bakterier til å produsere Rho protein ved å legge til 500 mL 100 mM IPTG til 500 ml kultur (en endelig konsentrasjon på 100 mM). Reduser temperaturen til 22-24 ° C og vokse for ~~~HEAD=NNS 16 h timer. </li><li> Spinn kultur ved 3600 gi 10 minutter ved 4 ° C. Ved behov kan 500 ml kulturen deles inn i 50 ml rør for sentrifugering. Freeze pellet (er) for minst 1 time (eller gjerne over natten) ved -80 ° C. </li><li> Forbered 200 ml lysis buffer inneholder 20 mm HEPES (0,95 g) / pH 7,5; 150 mM NaCl (1,75 g), 5 mm MgCl 2 (0.203 g), 1% TX-100 (2 ml). Forbered lager løsninger av 1M DTT (1,542 g i 10 ml dH 2 O) Og 100 mm PMSF (0.174 g/10 ml EtOH). For å forberede lyse buffer +, supplere 10 ml med 1mm DTT (10 mL på lager) og 1 mM PMSF (100 mL of stock) og ett Komplett Mini proteasehemmer tablett. </li><li> Arbeid på is, tilsett 10 ml lysis buffer + til pellets fra trinn 2,3. Resuspender grundig med mild virvling og pipettering. Unngå skumdannelse. Sonicate på is i 1 minutt ved å sette fire med 50% puls. Spinn sonicated lysate på 15.000-20.000 g i 15 minutter ved 4 ° C, og fjern avklart sonicate (supernatanten) til en steril avkortet 15 ml tube. </li><li> Klargjør Glutathione Sepharose ved forsiktig å blande den originale slangen med en 75% slurry og transfer 335 mL i en 15 ml tube. Bruk en bred kjedelig tips til pipetter perler. Tilsett 10 ml kald PBS, og spinne 500 g for 5 minutter ved 4 ° C. Kast supernatanten, tilsett 1 ml lysis buffer + til perlene og spinner som for forrige vask. Kast supernatanten og legg lysis buffer + å lage en 50% slurry. </li><li> Tilsett 250 mL av equilibrated perle slurry til supernatanten fra trinn 2,5. Roter ved 4 ° C i 45 minutter. </li><li> Forbered 500 ml HBS inneholder 20 mm HEPES (2,38 g) / pH 7,5 og 150 mM NaCl (4,38 g) i dH 2 O. Forbered lager løsninger av 1M MgCl 2 (0.952 g i 10 ml dH 2 O) og 1M DTT (1,542 g i 10 ml dH 2 O). For å forberede HBS +, supplere 100 ml like før bruk med 5 mM MgCl 2 (50 mL fra lager) og 1 mM DTT (100 mL fra lager). </li><li> Snurr perlene fra trinn 2,7 ved 500 gr i 5 minutter ved 4 ° C. Kast supernatanten og vask perler 2x med 10 ml lysis buffer +, og 2x med 10 ml HBS +. Etter den siste vask, lage en 50% slurry ved resuspending perlene i HBS + supplert med BD BaculoGold proteasehemmer (20 mL av 50x BD BaculoGold / ml). </li><li> Fortynn 10 mL av den endelige perler forberedelse med 2x Laemmli prøve buffer som inneholder β-mercaptoethanol. Gjør bovint serumalbumin (BSA) standarder. Bruk en 2 mg / ml lager (0,02 g av BSA i en0 ml dH 2 O). Bland 10 mL av lager med 10 mL Laemmli (20 mikrogram endelig); 5 mL av lager med 5 mL av dH 2 O og 10 mL Laemmli (10 mikrogram endelig), og 2,5 mL lager med 7,5 mL dH 2 O og 10 mL Laemmli (5 mikrogram endelig). Kok alle prøver (5 min). Spinn perle prøven og løpe supernatant med BSA standarder og molekylvekt markører på en 10% SDS-polyakrylamid gel. </li><li> Klargjør Comassie blå flekken (0,1 g i 10 ml eddiksyre, 40 ml metanol og 50 ml dH 2 O) og destain løsning (500 ml dH 2 O, 400 ml metanol og 100 ml eddiksyre). Oppbevares ved romtemperatur. Flekk gelen i 20-30 minutter, fjern fargestoff (det kan gjenbrukes flere ganger) og skyll med destain løsning to ganger. Fortsett å destain med forsiktig risting i flere timer til band er klart synlig. </li><li> Beregn konsentrasjonen av GST-RhoA (G17A) koplet til perlene med BSA standardene som en referanse (Fig. 2). Aliquot et tilsvarende volum av perler som inneholder ~ 10-15 mikrogram protein inn 1,5 ml mikro sentrifugerør. Oppbevar perlene ved 4 ° C til bruk innen en dag. Frys ved -80 ° C i HBS + / glyserol i en 3:1 ratio til bruk innen få dager. </li></ol> 3. GEF pulldown Assay med Nukleotid-frie RhoA (G17A) Perler <ol><li> Grow celler i 10 cm retter til samløpet. Serum frata i minst 3 timer og behandle etter behov. </li><li> Forbered lyse buffer + som i trinn 2.4. Forbered nok lyse buffer for 700 mL / fatet pluss litt ekstra beløp for å tillate pipettering feil. Tilsett proteasehemmere like før bruk. </li><li> Arbeid på isen, fjerne kultur medium fra oppvasken og vaske med iskald HBS. Fjern alle HBS og legge 700 mL lysis buffer + til hver rett. Swirl plater for å dekke alle områder, skrape og samle lysates i nummererte 1,5 ml rør. Snurr på 15 000 g for 1 min ved 4 ° C. Supernatanten vil bli brukt til analysen. </li><li> Hvis celle nummer er tilsvarende i altretter som testes, kan du utelate gjør et protein analyse, og flytte til trinn 3.5. Ellers måle protein konsentrasjon av hver supernatant bruke Bio-Rad rask protein assay og utjevne supernatanten for volum og konsentrasjon. Mengden av totalt protein avhenger av celletypene som brukes (vanligvis 1 til 1,5 mg protein for LLC-PK1 celler). </li><li> Ta 30 mL av hver supernatanten og bland med 30 mL 2x redusere Laemmli prøve buffer, kok og satt til side for trinn 3.7. Tilsett resten supernatants til alikvoter av GST-RhoA (G17A) perler fra trinn 2.12. Roter i 45 minutter ved 4 ° C. </li><li> Spinn perler på 6800 g i 10 sekunder ved 4 ° C. Kast supernatanten og vask perlene 3x med lysis buffer, spinning på samme måte mellom hver vask. Helt fjerne den siste vask med en 1 cc sprøyte utstyrt med en 30 G nål og legg 20 mL 2x redusere Laemmli prøve buffer. Kok i 5 min. Spinn til pelletskaminer perler og enten kjøre supernatanten umiddelbart (fortrinnsvis) eller lagre det ent -80 ° C for senere analyser. </li><li> Kjør 20 mL totalt celle lysates og alle de utfelte proteiner prøver på den aktuelle prosentandelen SDS-polyakrylamid gel for størrelsen på GEF du studerer. Oppdage GEF av valget ved Western blotting med et spesifikt antistoff. </li></ol> 4. Representative Resultater Del 1 og 2 av protokollen beskriver utarbeidelse av GST-RhoA (G17A) koplet til GSH-Sepharose perler og sin testing av SDS-PAGE (se omrisset av protokollen på Fig 1). En typisk Coomassie beiset gel er vist på Fig. 2. Prøven med eluted protein bør inneholde en enkelt band på ca 50 kDa (2 Fig, 6 kjørefelt). Konsentrasjonen av proteinet kan beregnes ved hjelp av BSA referanseprøver. I eksempelet på Fig. 2, er konsentrasjonen av RhoA (G17A) anslås å være 15 μg/10 mL. Dermed var alikvoter av 10 mL / tube forberedt. Den typiske avkastning<html> i vår hånd er 15-20 mikrogram protein fra 10 ml bakteriell lysis. Del 3 av protokollen beskriver affinitet nedbør analysen (se oversikt på Fig 1). En vellykket GEF analysen å påvise aktivering av utveksling faktoren GEF-H1 er vist på Fig 3. Den RhoA (G17A) protein fanget noen GEF-H1 fra kontrollen (ubehandlet) celle lysates, noe som tyder på at GEF-H1 har basal aktivitet. Beløpet fremskyndet imidlertid økninger i celler behandlet med inflammatorisk cytokin tumor nekrose faktor-α (TNF-α), i samsvar med forestillingen om at TNF-α aktiverer GEF-H1 5,7. Viktigere, den totale cellen lysates viser lignende mengder GEF-H1 i kontroll og det behandlede prøven, noe som tyder på at behandlingen ikke endret GEF-H1 nivåer og inngangen som er brukt i analysen er lik. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig1.jpg" /> Figur 1. Oversikt over protokollen. ove_content &quot;&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig2.jpg" /> Figur 2. Representant resultat av perlen forberedelse protokollen. En Coomassie beiset gel med vellykket GST-RhoA (G17A) bead forberedelse vises. Bead prøve og BSA protein standarder ble separert av SDS-PAGE med en 10% akrylamid gel. For å teste perlene, er 10 mL av den endelige perlen slurry inneholder GST-RhoA (G17A) fortynnet 1:1 med å redusere Laemmli prøve buffer og kokt i 5 minutter. Perlene ble skilt kort og supernatanten lastet på gel. Følgende prøver ble lastet: Lane 1: molekylvekt markør (MW) (FroggaBio BLUeye prestained protein stige); Lanes 2-4: 5, 10 og 20 mikrogram Bovine serum albumin (BSA), Lane 5 er tom; Lane 6: 10 mL av nylagde RhoA (G17A) perler. Etter separasjon er fullført, blir gelen farges ved hjelp Coomassie Blue og senere destained å avdekke proteiner. Den molekylære vekten av GST-RhoA (G17A) protein er omtrent 50<html> kDa og løper rundt nivået på 48 kDa markør. Konsentrasjonen av GST-Rho protein i denne prøven er anslått å være rundt 15 μg/10 mL slurry. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig3.jpg" /> Figur 3. Representant GEF aktivering analysen viser TNF-α-indusert aktivering av GEF-H1. Konfluent LLC-PK1 celler ble behandlet med 10 ng / ml TNF-α i 5 minutter. Etter behandling cellene ble lysert og aktive GEFs ble fanget ved hjelp av GST-RhoA (G17A) bundet perler. Tilstedeværelsen av GEF-H1 i utfelte proteiner (øverste blot) og total celle lysate prøver (nederst blot) ble oppdaget ved hjelp av Western blotting med en anti-GEF-H1 antistoff (cellesignalisering). Vær oppmerksom på den økte mengden av utfelt GEF-H1 i TNF-α-behandling versus ikke-behandlede celler i forhold til tilsvarende innganger, noe som indikerer en vellykket resultat. 3932/3932fig4.jpg &quot;/&gt; Figur 4. En &quot;dårlig resultat&quot;. Selv om GEF pulldown analysen vist her resultert i noen GEF-H1 tatt av perlene, utfelt beløpene fra kontroll-og TNF-α-behandlede celler er de samme. Dermed TNF-α, har en kjent aktivator av GEF-H1 i dette tilfellet ikke brekning aktivering. I dette eksperimentet påfølgende feilsøking antydet at TNF-α brukte var ikke frisk nok og sannsynligvis degradert.

<ol>
	<li>Jaffe, A. B., Hall, A. R. h. o. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPases:+biochemistry+and+biology.">GTPases: biochemistry and biology.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 247-269 (2005).</li><li>Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEF+means+go:+turning+on+RHO+GTPases+with+guanine+nucleotide-exchange+factors.">GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 167-180 (2005).</li><li>Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPLN,+a+guanine+nucleotide+exchange+factor+for+RhoA+and+RhoB,+but+not+RhoC.">XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC.</a> J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).</li><li>Garcia-Mata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+activated+GAPs+and+GEFs+in+cell+lysates.">Analysis of activated GAPs and GEFs in cell lysates.</a> Methods Enzymol. 406, 425-437 (2006).</li><li>Kakiashvili, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEF-H1+Mediates+Tumor+Necrosis+Factor-{alpha}-induced+Rho+Activation+and+Myosin+Phosphorylation:+role+in+the+regulation+of+tubular+paracellular+permeability.">GEF-H1 Mediates Tumor Necrosis Factor-{alpha}-induced Rho Activation and Myosin Phosphorylation: role in the regulation of tubular paracellular permeability.</a> J. Biol. Chem. 284, 11454-11466 (2009).</li><li>Waheed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+signal+regulated+kinase+and+GEF-H1+mediate+depolarization-induced+Rho+activation+and+paracellular+permeability+increase.">Extracellular signal regulated kinase and GEF-H1 mediate depolarization-induced Rho activation and paracellular permeability increase.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. , (2010).</li><li>Kakiashvili, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermal+growth+factor+receptor+mediates+tumor+necrosis+factor-alpha-induced+activation+of+the+ERK/GEF-H1/RhoA+pathway+in+tubular+epithelium.">The epidermal growth factor receptor mediates tumor necrosis factor-alpha-induced activation of the ERK/GEF-H1/RhoA pathway in tubular epithelium.</a> J. Biol. Chem. 286, 9268-9279 (2011).</li><li>Garcia-Mata, R., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catching+a+GEF+by+its+tail.">Catching a GEF by its tail.</a> Trends Cell Biol. 17, 36-43 (2007).</li><li>Dubash, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+GTPase+RhoA+localizes+to+the+nucleus+and+is+activated+by+Net1+and+DNA+damage+signals.">The small GTPase RhoA localizes to the nucleus and is activated by Net1 and DNA damage signals.</a> PLoS One. 6, e17380-e17380 (2011).</li><li>Guilluy, G., Dubash, A. D., Garc&#237;a-Mata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RhoA+and+Rho+GEF+activity+in+whole+cells+and+the+cell+nucleus.">Analysis of RhoA and Rho GEF activity in whole cells and the cell nucleus.</a> Nature Protocols. , (2011).</li><li>Guilluy, C., Swaminathan, V., Garcia-Mata, R., O'Brien, E. T., Superfine, R., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+GEFs+LARG+and+GEF-H1+regulate+the+mechanical+response+to+force+on+integrins.">The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins.</a> Nature Cell Biology. 13, 722-727 (2011).</li><li>Dubash, A. D., Wennerberg, K., Garcia-Mata, R., Menold, M. M., Arthur, W. T., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Lsc/p115+RhoGEF+and+LARG+in+regulating+RhoA+activity+downstream+of+adhesion+to+fibronectin.">A novel role for Lsc/p115 RhoGEF and LARG in regulating RhoA activity downstream of adhesion to fibronectin.</a> J. Cell Sci. 120, 3989-3998 (2007).</li><li>Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPLN,+a+guanine+nucleotide+exchange+factor+for+RhoA+and+RhoB,+but+not+RhoC.">XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC.</a> J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).</li></ol>

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Metoden som presenteres her er den bare tilgjengelig ikke-radioaktive aktivering analysen for GEFs som kan følge den aktive pool av GEFs i cellene. Den analysen er lik nedbøren analyser brukes til følgende aktivering av små GTPases samt GEFs mot Rac og Cdc42. Bruke disse analysene forskjellige GST-merkede proteiner og ha små forskjeller fra det som er beskrevet her, men de grunnleggende trinnene er de samme. Dermed kan denne protokollen enkelt tilpasses andre små GTPase og GEF aktivering analyser. Den presenterte GEF analysen ble nylig endret for søknad om kjernefysiske fraksjoner 9,10. Med ytterligere modifikasjoner, kan testing av GEF aktivering i andre subcellulære avdelinger også være mulig. Vi bruker presenterte metoden for å studere aktivering av GEFs i epiteliale cellelinjer 5,6,7. Med litt optimalisering, bør denne analysen være tilstrekkelig å påvise GEFs fra hvilken som helst celle linje. Når adapting til en bestemt celletype, finne det optimale celle nummer, lysis buffer volum, og påvisning metode for GEF som skal testes (en god antistoff for Western blotting er viktig). For førstegangs oppsett av analysen er det tilrådelig å bruke en stimulus som er kjent for å aktivere GEF av interesse. Når du bruker en ukjent stimulus, bruk alltid en positiv kontroll for å kontrollere at analysen fungerer. Denne analysen kan brukes til å oppdage aktivering av kjente GEFs ved Western blotting. Men det er også tilstrekkelig til å identifisere ukjente GEFs. For dette bør fanges GEFs fra kontroll og stimuleres prøvene analyseres på en Coomassie-farget gel. Band som bare vises i stimulert prøver kan inneholde aktiverte GEFs og kan sendes til identifisering av massespektrometri (f.eks 5). Endelig en advarende notat. Den analysen er basert på antagelsen om at posttranslational modifikasjoner rendering GEFs aktive blir bevart etter cellelyse. Faktisk er dette den klart caSE for en rekke GEFs, og siden dets virksomheter, har denne analysen blitt brukt av ulike grupper for å oppdage aktivering av ulike GEFs, inkludert GEF-H1, p115RhoGEF og XPLN (f.eks 5,11,12,13). Bevaring av den aktive staten imidlertid ikke kan skje i tilfelle av alle GEFs, og det er derfor tenkes at denne analysen ikke vil fungere for alle GEFs. Det må også bemerkes at mange GEFs øve aktiviteten mot mer enn ett lite GTPases. Så når en spesifikk GEF er studert, anbefales det å supplere denne analysen med GEF nedbøren analyser for andre små GTPases, samt funksjonelle studier undersøker RhoA, Rac1 og Cdc42. Kritiske trinn i protokollen: Kolonier av transformerte bakterier bør bli hentet fra ferske skikkelig forberedt plater for å sikre tilstrekkelig utvalg av Amp, god utvekst og avkastning. Transformation vilkår for kompetente celler hentet fra andre kilder kan variere og bør konsulteres. </p&gt; Alle trinnene i protein forberedelse protokollen (fra trinn 2,3) og analysen (fra trinn 3.2) bør utføres ved 4 ° C med avkjølte løsninger og sentrifuger. Bakteriell lyse (trinn 2,5) bør være grundig og fullstendig for å oppnå en homogen suspensjon. Når Lysing bakterien, vortex og pipetter den lysate vekselvis, samtidig som den ved 4 ° C og sikre sonikator er gjort på isen for å hindre denaturering av protein. Hvis du bruker en annen modell av sonicator, kan forholdene må justeres. Inkubasjon av sonicate med perlene bør alltid gjøres ved 4 ° C på en rotator for å sikre tilstrekkelig bindende, og forsiktighet bør utvises for å holde timingen konsekvent. GST-Rho mutanter er noe ustabil når det uttrykkes i bakterier, så det er best å bruke preparerte perler med en gang eller innen noen få dager. Nedbøren analysen (del 3) er tid og temperatur sensitive, ens aktive GEFs kan lett gå tapt fra cellen lysate, så skal skritt utføres så raskt som mulig. Den følgende delen inneholder noen feilsøkingstipsene. Ingen eller svært lav mengde mutert Rho protein i finalen perle forberedelse: Dette kan være forårsaket av ineffektiv induksjon, utilstrekkelig lysis av bakterien, eller tap av proteinet under forberedelse prosessen eller lagring. For å hjelpe feilsøke noen av disse mulighetene, kan prøver av bakterier bli analysert før og etter induksjon. Hvis det er dårlig induksjon av proteinet gjenta prosessen med en koloni fra en fersk stripete plate eller fra re-transformerte kompetente celler. Ulike IPTG konsentrasjoner og induksjon ganger bør også testes. Dersom lyse er utilstrekkelig (dvs. proteinet forblir i pellet istedenfor supernatanten) varierende salt og oppvaskmiddel konsentrasjoner i lysis buffer kan prøves. Alternative sonikator ganger oginnstillinger bør vurderes, og prøver før og etter sonikator kan kontrolleres ved mikroskopi for å fastslå effektiviteten av lysis. Ingen fremskyndet GEF, selv om GST-protein er til stede på perlene: Dette kan skyldes tekniske problemer under nedbør analysen, eller ved en reell fravær av aktivering av det studerte GEF hjelp av stimulus anvendt. Bruk alltid en kjent stimulus som en positiv kontroll for å kontrollere at analysen fungerer. Bruk preparerte perlene i løpet av få dager. Dersom nedbøren analysen fanger ikke målbare mengder av GEF studert i alle forhold, kontrollerer du at GEF er tilstede og er godt synlig i supernatanten etter sentrifugering som skal brukes til analysen (trinn 3,3). Sørg for at alle buffere og proteasehemmere er friske, og utføre alle trinnene på isen så fort som mulig. Øk mengden av innspill protein (f.eks ved hjelp av lysates fra 2 plater / sample). Dersom nedbøren analysen viser basal precipitering av GEF, men ingen forskjell blir sett mellom kontroll og stimuleres prøver (fig 4), starte feilsøkingen ved å bekrefte at den anvendte stimulus jobbet med andre kjente effekter (f.eks ved å oppdage aktivering av andre signalveier). Vurdere å endre behandling forhold og / eller konsentrasjoner. Stole på data fra litteraturen rapportering hvordan stimulus aktiverer Rho eller andre signaler å forutsi sannsynlige tider og konsentrasjoner. Når optimalisere behandling tid, bruker både korte og lange tidspunkter, som GEF aktivering kanskje være best påvises gangen punkt før godt synlig Rho aktivering. Til slutt kunne den samme stimulus resultere i en varierende grad av aktivering på grunn av en endring i celle respons forårsaket av passasje nummer, celle confluency, etc.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (valgfritt) </td></tr><tr><td> pGEX-RhoA (G17A) </td><td> Addgene </td><td> Vil snart være tilgjengelig </td><td> Generert i laboratoriet av Dr. Keith Burridge (University of North Carolina) (ref 3) </td></tr><tr><td> DH5α </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> Oppbevares -80 ° C </td></tr><tr><td> SOC medium </td><td> BioShop </td><td> SOC001.10 </td><td></td></tr><tr><td> LB </td><td> BioShop </td><td> LBL407.1 </td><td> Hold sterile </td></tr><tr><td> Glyserol </td><td> BioShop </td><td> GLY002.1 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td> BioShop </td><td> AMP201.25 </td><td> Oppbevares lager ved -20 ° C </td></tr><tr><td> Agar </td><td> BioShop </td><td> AGR001.500 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (Isopropyl BD-thiogalacto-pyranoside) </td><td> Calbio zoo </td><td> 420322 </td><td> Oppbevares stamløsning ved -20 ° C </td></tr><tr><td> Glutation Sepharose perler </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0756-01 </td><td></td></tr><tr><td> PBS 10x </td><td> SIGMA </td><td> D1408 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> SIGMA </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BioShop </td><td> SOD001.10 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> SIGMA </td><td> M-9272 </td><td> Legg like før bruk </td></tr><tr><td> TX-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> OmniPur EMD </td><td> 3860 </td><td> Legg like før bruk </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> SIGMA </td><td> P-7626 </td><td> Legg like før bruk </td></tr><tr><td> Proteasehemmer 50x </td><td> BD Baculo-gull </td><td> 51-21426Z </td><td> Legg like før bruk </td></tr><tr&gt; <td> Komplett Mini, EDTA-free 10x </td><td> Roche </td><td> 11 836 170 001 </td><td> Legg like før bruk </td></tr><tr><td> Laemmli Eksempel Buffer 2x </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0737 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoethanol </td><td> SIGMA </td><td> M7154 </td><td> Legg like før bruk </td></tr><tr><td> Coomassie Brilliant Blue </td><td> Bio-Rad </td><td> R-250 </td><td></td></tr><tr><td> Eddiksyre </td><td> Caledon </td><td> 1000-1 </td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Caledon </td><td> 6701-7 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Rad Protein Assay </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0114 </td><td></td></tr><tr><td> BLUeye stige </td><td> FroggaBio </td><td> PM008-0500 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 1. Reagenser brukt. <table border="1"><tbody><tr><td> Navn på utstyr </td><td> Firma </td&gt; <td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (valgfritt) </td></tr><tr><td> RC-5B sentrifuge </td><td> Sorvall </td><td> SS-34 Rotor </td><td> Bruk ved 4 ° C </td></tr><tr><td> Sentrifuger </td><td> Sorvall-Thermo Scientific </td><td> ST-16R </td><td> Bruk ved 4 ° C </td></tr><tr><td> Micro sentrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 5417R </td><td> Bruk ved 4 ° C </td></tr><tr><td> Bakteriell shaker </td><td> INFORS HT Ecotron </td><td> AG CH-1403 Bottmingen </td><td> Bruk ved 37 ° C eller ved 22 ° C </td></tr><tr><td> Sonicator </td><td> Branson </td><td> Sonifier-450 </td><td> Bruk ved RT </td></tr><tr><td> Rotator </td><td> Glas-Col </td><td> 099A CR4012 </td><td> Bruk ved 4 ° C </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Spesifikke utstyr som brukes.

affinity precipitation of active rho-gefs using a gst-tagged mutant rho protein (gst-rhoa(g17a)) from epithelial cell lysates

Proteinene i Rho familien av små GTPases er sentrale regulatorer av cytoskjelettet, og kontrollerer et stort utvalg av cellulære prosesser, herunder celle migrasjon, genekspresjon, cellesyklusprogresjon og celle adhesjon en. Rho proteiner er molekylære brytere som er aktive i GTP-bundet og inaktive i BNP-bundet tilstand. Deres aktiveringen er mediert av en familie av Guanine-nukleotid Exchange-faktor (GEF) proteiner. Rho-GEFs utgjør en stor familie, med overlappende spesifisiteter to. Selv om mye har vært gjort fremskritt i å identifisere de GEFs aktiveres av spesielle signaler, er det fortsatt mange spørsmål som gjenstår når det gjelder vei-spesifikk regulering av disse proteinene. Antallet Rho-GEFs overstiger 70, og hver celle uttrykker mer enn en GEF protein. I tillegg er mange av disse proteinene aktiverer ikke bare Rho, men andre medlemmer av familien, bidrar ytterligere til kompleksiteten i de regulatoriske nettverk. Viktigere, utforskehvordan GEFs er regulert krever en metode for å følge den aktive pool av individuelle GEFs i celler aktiveres av ulike stimuli. Her tilbyr vi en steg-for-steg protokoll for en metode som brukes til å vurdere og kvantifisere de tilgjengelige aktive Rho-spesifikke GEFs med en affinitet nedbør analysen. Denne analysen ble utviklet for noen år siden i Burridge lab 3,4 og vi har brukt det i nyre rørformede cellelinjer 5,6,7. Analysen tar fordel av en &quot;nukleotid gratis&quot; mutant RhoA, med en høy affinitet for aktive GEFs. Mutasjonen (G17A) gjengir protein klarer å binde BNP eller GTP og denne tilstanden etterligner mellomliggende tilstand som er bundet til GEF. En GST-merket versjon av dette mutant protein uttrykkes og renset fra E. coli, bundet til glutation Sepharose perler og brukes til å fremskynde aktive GEFs fra lysates av ubehandlet og stimulert celler. Som de fleste GEFs aktiveres via posttranslational endringer eller utslipp fra hemmende bindinger, deres aktive statligeer bevart i celle lysates, og de ​​kan bli oppdaget av denne analysen åtte. Fangede proteiner kan probed for kjente GEFs ved påvisning med spesifikke antistoffer ved hjelp av Western blotting, eller analysert av massespektrometri å identifisere ukjente GEFs aktiveres ved visse stimuli.

Watch this Scientific Journal Video about Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates at JoVE.com

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates

Metoden som presenteres her beskriver en analyse for å følge aktivering av RhoA spesifikke BNP / GTP Utveksle Factors (GEFs) i dyrkede celler ved å gjøre bruk av en mutant RhoA GST fusion protein som har høy affinitet for aktivert GEFs. GEFs er fremskyndet fra celle lysates oppdaget ved Western blotting og kvantifisert ved densitometry.

Affinity Nedbør av Active Rho-GEFs Bruke en GST-merket Mutant Rho Protein (GST-RhoA (G17A)) fra Epiteliale Cell lysates

Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell ...

Research

JoVE Journal

Biology

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Kromatografiske Rensing av Highly Active gjær ribosomer

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Ortogonale Protein Purification Tilrettelagt av en Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Identifisering av Protein Samspill Partners Bruke Tandem Affinity Rensing

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

En væskefase Affinity Capture Assay hjelp av magnetiske perler å studere protein-Protein Interaction: Den poliovirus-Nanobody Eksempel

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

En protokoll for Fag Display og Affinitetsutvelgelse Bruke rekombinante protein agn

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

Transgen Gnagere analyse for Kvantifisering Mann Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...