Name: affinity precipitation of active rho-gefs using a gst-tagged mutant rho protein (gst-rhoa(g17a)) from epithelial cell lysates
Uploaded: 2012-03-31T13:00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates at JoVE.com

Detta arbete har finansierats av det kanadensiska institutet för hälsoforskning (CIHR) (MOP-97.774) och naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (NSERC bevilja nr: 480.619). KS är mottagare av en KRESCENT New Investigator Award (en gemensam upphandling av Kidney Foundation of Canada, Kanadas njurmedicin samhälle och kanadensiska Institute of Health Research) och en tidig forskare Award från Ontario ministeriet för forskning och innovation. FW stöds av en Li Ka Shing stipendium.

1. Transformation av E. coli med pGEX-RhoA (G17A) konstrukt <ol><li> Förbered LB-agar genom att lösa 2,5 g LB och 1,5 g agar i 100 ml dH 2 O. Autoklav och coolt att en uppskattad 50-55 ° C, vilket som en tumregel, är när kolven kan hållas bekvämt. </li><li> Förbered Ampicillin (Amp) bestånd genom att lösa 50 mg / ml i dH 2 O. Sprutfilter och frysa oanvända alikvoter. Tillsätt 100 pl av Amp lager (slutlig koncentration 50 | ig / ml) till LB-agar från 1,1. Snurra att blanda och häll i 10 cm bakteriella rätter (15-20 ml / skål). Låt den stelna (15-30 min.) Och lagra oanvända tallrikar inverterade vid 4 ° C under 2-3 veckor. </li><li> För att transformera E. Coli, snabbt tina en alikvot av DH5a-kompetenta celler i ett isbad. Tillsätt 1 pl pGEXRhoA (G17A) DNA späddes till 25-50 ng / | il. Flick röret för att blanda och inkubera på is under 30 minuter. Värmechock vid 42 ° C i 45 sekunder och placera tillbaka på is i 2 minuter. Lägg 900 &amp; mu; L SOC-medium och växa under en timme vid 37 ° C med skakning. </li><li> Sprida 50-100 pl av de transformerade bakterierna på ett LB-agar-Amp platta med användning av en böjd steril Pasteur-pipett. Inkubera plattan rätt sida upp i en 37 ° C inkubator under 5 min och sedan vända och växa över natten. </li><li> En enda koloni plockas från plattan för framställning av GST-märkt protein (steg 2.1). För framtida bruk, wrap och förvara tallrikar inverteras vid 4 ° C i ca 3 veckor. Dessutom kan bakteriell lagren framställas för mer långvarig lagring genom att odla individuella kolonier i 2 ml sterilt LB-Amp natten vid 37 ° C med skakning. Blanda en alikvot med steril 80% glycerol i ett förhållande 1:1 och frys vid -80 ° C. </li></ol> 2. Beredning av GST-RhoA (G17A) Pärlor <ol><li> Förbered LB genom att tillsätta 25 g LB till 1 L dH 2 0 och autoklavering. Låt svalna, tillsätt 50 | il Amp från lager till 50 ml LB (50 pg / ml slutlig koncentration). Inokulera med en väl isolerad colony av transformerade bakterier och växa över natten vid 37 ° C med omrörning. När full densitet (OD 600&gt; 1,0) späddes med 450 ml LB-Amp och växa under ytterligare 30 minuter vid 37 ° C. </li><li> Bered en 100 mM stamlösning av isopropyl BD-tiogalaktopyranosid (IPTG) genom att lösa 0,238 g i 10 ml dH 2 O. Lagra i alikvoter vid -20 ° C. Inducera bakterier för att producera Rho-proteinet genom tillsats av 500 | il 100 mM IPTG och 500 ml kultur (en slutkoncentration av 100 pM). Minska temperaturen till 22-24 ° C och växa under ca 16 h timmar. </li><li> Snurra odling vid 3600 g under 10 minuter vid 4 ° C. Vid behov kan den 500 ml kultur delas upp i 50 ml rör för centrifugering. Frysning pelleten (er) under minst 1 timme (eller företrädesvis över natten) vid -80 ° C. </li><li> Framställ 200-buffert ml lys innehållande 20 mM HEPES (0,95 g) / pH 7,5; 150 mM NaCl (1,75 g); 5 mM MgCl2 (0,203 g); 1% TX-100 (2 ml). Framställa stamlösningar av 1 M DTT (1,542 g i 10 ml dHaO 2 O) Och 100 mM PMSF (0,174 g/10 ml EtOH). För att förbereda + lysisbuffert, komplettera 10 ml med 1 mM DTT (10 pl lager) och 1 mM PMSF (100 pl materiel) och en hel Mini Protease Inhibitor tablett. </li><li> Arbeta på is, tillsätt 10 bufferten ml lys + till pellets från steg 2,3. Resuspendera noggrant genom försiktig skakning och pipettering. Undvik skumbildning. Sonikera på is under 1 minut vid inställning 4 med 50% puls. Snurra sonikerade lysatet vid 15.000-20.000 g under 15 minuter vid 4 ° C och avlägsna den klarnade sonikatet (supernatanten) för att en steril tillslöts 15 ml-rör. </li><li> Förbered Glutation Sepharose genom att försiktigt blanda den ursprungliga rör som innehåller ett 75% slam och överföring 335 ul i ett 15 ml rör. Använd en bred hål tips till pipettera pärlor. Tillsätt 10 ml kall PBS och centrifugera 500 g under 5 minuter vid 4 ° C. Kasta bort supernatanten och tillsätt 1 ml + lysbuffert till pärlorna och snurra som för föregående tvättning. Kasta bort supernatanten och tillsätt + lys-buffert för att göra en 50% uppslamning. </li><li> Tillsätt 250 pl av Jämviktstidibrated vulst uppslamning till supernatanten från steg 2,5. Rotera vid 4 ° C under 45 minuter. </li><li> Framställ 500 ml HBS innehållande 20 mM HEPES (2,38 g) / pH 7,5 och 150 mM NaCl (4,38 g) i dH 2 O. Framställa förrådslösningar av 1 M MgCl2 (0,952 g i 10 ml dHaO 2 O) och 1 M DTT (1,542 g i 10 ml dHaO 2 O). För att förbereda HBS +, komplettera 100 ml strax före användning med 5 mM MgCl 2 (50 pl från lager) och 1 mM DTT (100 ul från lager). </li><li> Snurra pärlorna från steg 2,7 vid 500 g under 5 minuter vid 4 ° C. Kasta supernatanten och tvätta pärlorna 2x med 10 ml lysbuffert + och 2 gånger med 10 ml HBS +. Efter den slutliga tvätten, gör en 50% uppslamning genom återsuspendering av pärlorna i HBS + kompletterad med BD BaculoGold proteas-inhibitor (20 | il av 50x BD BaculoGold / ml). </li><li> Späd 10 pl av den slutliga pärlorna beredningen med 2x Laemmli provbuffert innehållande β-merkaptoetanol. Göra bovint serumalbumin (BSA) som standard. Använda en 2 mg / ml förrådslösning (0,02 g BSA i 10 ml dHaO 2 O). Blanda 10 ^ il av lager med 10 | il Laemmli (20 | ig slutlig); 5 pl lager med 5 pl av dH 2 O och 10 | il Laemmli (10 | ig slutlig) och 2,5 pl lager med 7,5 | il dHaO 2 O och 10 | il Laemmli (5 pg slutlig). Koka alla prover (5 min). Snurra pärlprov och kördes supernatanten med BSA-standarder och molekylviktsmarkörer på en 10% SDS-polyakrylamidgel. </li><li> Framställa Comassie Blue färg (0,1 g i 10 ml ättiksyra, 40 ml metanol och 50 ml dHaO 2 O) och avfärgning lösning (500 ml dHaO 2 O 400 ml metanol och 100 ml ättiksyra). Lagra vid rumstemperatur. Fläck gelen i 20-30 minuter, ta bort färgen (den kan återanvändas flera gånger) och skölj med avfärgning-lösning två gånger. Fortsätt att Avfärga med varsam skakning i flera timmar tills band är klart synliga. </li><li> Uppskatta koncentrationen av GST-RhoA (G17A) kopplad till pärlorna med användning av BSA-standarder som referens (fig. 2). Aliquot en lika stor volym av pärlor innehållande ~ 10-15 | ig protein i 1,5 ml mikro-centrifugrör. Lagra pärlor vid 4 ° C för att användas inom en dag. Frysa vid -80 ° C i HBS + / glycerol i ett förhållande 3:1 för att använda inom några dagar. </li></ol> 3. GEF filmdetektering Analys med Nukleotid-fria RhoA (G17A) Pärlor <ol><li> Odla celler i 10 cm skålar till konfluens. Serum beröva minst 3 timmar och behandla vid behov. </li><li> Förbered lyseringsbuffert + som i steg 2,4. Förbered tillräckligt lyseringsbuffert för 700 pl / skål plus lite extra mycket för att tillåta pipettering fel. Tillsätt proteasinhibitorer strax före användning. </li><li> Arbetar på is, avlägsna odlingsmedium från skålarna och tvätta med iskall HBS. Avlägsna all HBS och tillsätt 700 | il + lysbuffert till varje skål. Virvlar runt plattor för att täcka alla områden, skrapa och samla lysaten i numrerade 1,5 ml rör. Snurra vid 15.000 g under 1 min vid 4 ° C. Supernatanten används för analysen. </li><li> Om din cell nummer är likvärdig i allarätter som testas, kan du utelämna gör ett protein analys, och gå till steg 3,5. Annars mäta proteinkoncentration av varje supernatant med användning av Bio-Rad snabb proteinanalys och utjämna den överstående för volym och koncentration. Den mängd av totalt protein beror på de celltyper som används (typiskt 1-1,5 mg protein för LLC-PK1-celler). </li><li> Ta bort 30 il av varje supernatant och blanda med 30 pl 2x minska Laemmli provbuffert, koka och ställ åt sidan för steg 3,7. Tillsätt återstående supernatanterna till alikvoter av GST-RhoA (G17A) pärlorna från steg 2,12. Rotera under 45 minuter vid 4 ° C. </li><li> Snurra pärlor vid 6800 g under 10 sekunder vid 4 ° C. Kasta bort supernatanten och tvätta pärlorna 3 gånger med lysbuffert, spinning på samma sätt mellan tvättarna. Fullständigt avlägsna den slutliga tvättningen med användning av en 1 cc spruta med en 30 G nål och tillsätt 20 | il 2x reducerande Laemmli-provbuffert. Koka under 5 min. Spin för att pellets pärlor och antingen köra supernatanten omedelbart (helst) eller lagra den ent -80 ° C för senare analys. </li><li> Kör 20 xl totalcellysat och alla de utfällda protein proverna på lämplig procentandel SDS-polyakrylamidgel för storleken på GEF du studerar. Detektera en GEF av valet genom Western blotting med användning av en specifik antikropp. </li></ol> 4. Representativa resultat Del 1 och 2 i protokollet beskriver framställning av GST-RhoA (G17A) kopplad till GSH-Sepharosekulor och dess tester med SDS-PAGE (se konturerna av protokollet om figur 1). En typisk Coomassie-färgad gel visas i fig 2. Provet med det eluerade proteinet bör innehålla ett enda band vid ungefär 50 kDa (fig 2, spår 6). Koncentrationen av proteinet kan uppskattas med användning av BSA-referensproverna. I exemplet i figur 2, är koncentrationen av RhoA (G17A) uppskattas till 15 μg/10 il. Således var alikvoter av 10 ^ il / rör bereddes. Det typiska utbytet<html> i vår hand är 15-20 g protein från 10 ml bakteriell lys. Del 3 i protokollet beskriver analysen affinitet nederbörd (se översikten i figur 1). En framgångsrik GEF analys att detektera aktivering av utbytet faktorn GEF-H1 visas figur 3. Den RhoA (G17A) protein fångade något GEF-H1 från kontrollen (obehandlade) cellysat, vilket tyder på att GEF-H1 har basal aktivitet. Det belopp som fälls dock ökar i celler som behandlats med det inflammatoriska cytokinet tumörnekrosfaktor-α (TNF-α), i överensstämmelse med uppfattningen att TNF-α aktiverar GEF-H1 5,7. Viktigare är att de totala cellysat visar liknande mängder av GEF-H1 i kontrollen och det behandlade provet, vilket tyder på att behandlingen inte påverkade GEF-H1 nivåer och den ingång som använts i analysen är lika. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig1.jpg" /> Figur 1. Översikt av protokollet. ove_content &quot;&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig2.jpg" /> Figur 2. Representativa resultat av vulsten beredningen-protokollet. En Coomassie färgad gel med framgångsrika GST-RhoA (G17A) sträng förberedelser visas. Pärlprov och BSA-standarder protein separerades med SDS-PAGE med användning av en 10% akrylamidgel. För att testa pärlorna är 10 | il av den slutliga kulan uppslamning innehållande GST-RhoA (G17A) utspädd 1:1 med reducerande Laemmli-provbuffert och kokades under 5 minuter. Pärlorna centrifugerades kortvarigt och supernatanten laddades på gelén. Följande prover laddades: spår 1: molekylviktsmarkör (MW) (FroggaBio BLUeye förfärgade proteinet stege); Banorna 2-4: 5, 10 och 20 | ig bovint serumalbumin (BSA), spalt 5 är tom, spår 6: 10 il av de nylagade RhoA (G17A) pärlor. Efter separation är fullbordad, färgades gelén med användning av Coomassie Blue och avfärgades därefter för att avslöja proteiner. Molekylvikten av GST-RhoA (G17A) proteinet är ungefär 50<html> kDa och löper runt nivån för 48 kDa-markören. Koncentrationen av GST-Rho-proteinet i detta speciella prov uppskattas vara omkring 15 | il μg/10 uppslamning. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig3.jpg" /> Figur 3. Representativa GEF aktiveringsanalys visar TNF-α-inducerad aktivering av GEF-H1. Konfluenta LLC-PK1-celler behandlades med 10 ng / ml TNF-α under 5 minuter. Efter behandling lyserades cellerna och aktiva GEFs fångades med GST-RhoA (G17A) bundna pärlor. Närvaron av GEF-H 1 i de utfällda proteinerna (topp-blot) och totalt cell-prover lysat (botten blöt) detekterades med användning av Western blotting med en anti-GEF-H1-antikropp (Cell Signaling). Observera den ökade mängden utfälld GEF-H1 i TNF-α-behandlade jämfört med icke-behandlade cellerna i förhållande till motsvarande ingångar, vilket tyder på ett lyckat resultat. 3932/3932fig4.jpg &quot;/&gt; Figur 4. En &quot;dåligt resultat&quot;. Fastän GEF neddragningskrets analysen visas här resulterat i en viss GEF-H 1 infångas av pärlorna, utfälldes mängderna från kontroll-och TNF-α-behandlade celler är desamma. Således TNF-α, var en känd aktivator av GEF-H1 i detta fall framkalla ej aktivering. I detta speciella experiment efterföljande felsökning föreslagits att den TNF-α användes var inte tillräckligt frisk och förmodligen försämras.

<ol>
	<li>Jaffe, A. B., Hall, A. R. h. o. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPases:+biochemistry+and+biology.">GTPases: biochemistry and biology.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 247-269 (2005).</li><li>Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEF+means+go:+turning+on+RHO+GTPases+with+guanine+nucleotide-exchange+factors.">GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 167-180 (2005).</li><li>Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPLN,+a+guanine+nucleotide+exchange+factor+for+RhoA+and+RhoB,+but+not+RhoC.">XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC.</a> J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).</li><li>Garcia-Mata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+activated+GAPs+and+GEFs+in+cell+lysates.">Analysis of activated GAPs and GEFs in cell lysates.</a> Methods Enzymol. 406, 425-437 (2006).</li><li>Kakiashvili, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEF-H1+Mediates+Tumor+Necrosis+Factor-{alpha}-induced+Rho+Activation+and+Myosin+Phosphorylation:+role+in+the+regulation+of+tubular+paracellular+permeability.">GEF-H1 Mediates Tumor Necrosis Factor-{alpha}-induced Rho Activation and Myosin Phosphorylation: role in the regulation of tubular paracellular permeability.</a> J. Biol. Chem. 284, 11454-11466 (2009).</li><li>Waheed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+signal+regulated+kinase+and+GEF-H1+mediate+depolarization-induced+Rho+activation+and+paracellular+permeability+increase.">Extracellular signal regulated kinase and GEF-H1 mediate depolarization-induced Rho activation and paracellular permeability increase.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. , (2010).</li><li>Kakiashvili, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermal+growth+factor+receptor+mediates+tumor+necrosis+factor-alpha-induced+activation+of+the+ERK/GEF-H1/RhoA+pathway+in+tubular+epithelium.">The epidermal growth factor receptor mediates tumor necrosis factor-alpha-induced activation of the ERK/GEF-H1/RhoA pathway in tubular epithelium.</a> J. Biol. Chem. 286, 9268-9279 (2011).</li><li>Garcia-Mata, R., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catching+a+GEF+by+its+tail.">Catching a GEF by its tail.</a> Trends Cell Biol. 17, 36-43 (2007).</li><li>Dubash, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+GTPase+RhoA+localizes+to+the+nucleus+and+is+activated+by+Net1+and+DNA+damage+signals.">The small GTPase RhoA localizes to the nucleus and is activated by Net1 and DNA damage signals.</a> PLoS One. 6, e17380-e17380 (2011).</li><li>Guilluy, G., Dubash, A. D., Garc&#237;a-Mata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RhoA+and+Rho+GEF+activity+in+whole+cells+and+the+cell+nucleus.">Analysis of RhoA and Rho GEF activity in whole cells and the cell nucleus.</a> Nature Protocols. , (2011).</li><li>Guilluy, C., Swaminathan, V., Garcia-Mata, R., O'Brien, E. T., Superfine, R., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+GEFs+LARG+and+GEF-H1+regulate+the+mechanical+response+to+force+on+integrins.">The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins.</a> Nature Cell Biology. 13, 722-727 (2011).</li><li>Dubash, A. D., Wennerberg, K., Garcia-Mata, R., Menold, M. M., Arthur, W. T., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Lsc/p115+RhoGEF+and+LARG+in+regulating+RhoA+activity+downstream+of+adhesion+to+fibronectin.">A novel role for Lsc/p115 RhoGEF and LARG in regulating RhoA activity downstream of adhesion to fibronectin.</a> J. Cell Sci. 120, 3989-3998 (2007).</li><li>Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPLN,+a+guanine+nucleotide+exchange+factor+for+RhoA+and+RhoB,+but+not+RhoC.">XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC.</a> J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).</li></ol>

Författarna har ingenting att lämna ut.

Den metod som presenteras här är den enda tillgängliga icke-radioaktiva aktivering analys för GEFs som kan följa den aktiva poolen av GEFs i celler. Analysen liknar de utfällnings analyser som användes för efter aktivering av små GTPaser, liksom GEFs mot Rac och Cdc42. De analyser använder olika GST-märkta proteiner och har små skillnader från det som beskrivs här, men de grundläggande stegen är desamma. Således kan detta protokoll enkelt anpassas för andra små GTPas och GEF analyser aktivering. Den presenterade GEF Analysen har nyligen ändrats för ansökan om nukleära fraktioner 9,10. Med ytterligare modifieringar kan testning av GEF aktivering i andra subcellulära fack även vara möjligt. Vi använder den presenterade metoden för att studera aktivering av GEFs i epiteliala cellinjer 5,6,7. Med viss optimering bör denna analys är tillräcklig för att detektera GEFs från någon cell-linje. När adapting till en viss celltyp, hitta den optimala antalet celler, lysbuffert volym och detektion metod för GEF som skall testas (en bra antikropp för Western blotting är viktigt). Den inledande installationen av analysen är det lämpligt att använda en stimulans som är känd för att aktivera GEF av intresse. Vid användning av en okänd stimulus, använd alltid en positiv kontroll för att verifiera att din analys fungerar. Denna analys kan användas för att detektera aktivering av kända GEFs med Western blotting. Det är emellertid också lämplig för att identifiera okända GEFs. För detta bör infångade GEFs från kontroll-och stimulerade proverna analyseras en Coomassie-färgad gel. Band som bara visas i stimulerade proverna kan innehålla aktiverade GEFs och kan skickas för identifiering med hjälp av masspektrometri (t.ex. 5). Slutligen, ett varnande anmärkning. Analysen är baserad på antagandet att de post-translationella modifieringar som gör GEFs aktiva bevaras efter cellys. Det är detta tydligt CAoch för sig för en rad GEFs, och eftersom dess anläggningar, har denna analys har använts av olika grupper för att detektera aktivering av olika GEFs, inklusive GEF-H1, p115RhoGEF och XPLN (t.ex. 5,11,12,13). Bevarande av det aktiva tillståndet dock inte kan hända i fråga om alla GEFs, och därför är det tänkbart att denna analys inte fungerar för alla GEFs. Det bör också noteras att många GEFs utövar aktivitet mot mer än en mindre GTPases. Så när en viss GEF studeras, är det rekommenderat att komplettera denna analys med GEF nederbörd analyser för andra små GTPases samt funktionella studier undersöka RhoA, RAC1 och Cdc42. Kritiska steg i protokollet: Kolonier av transformerade bakterier bör plockas från färska, väl beredda plattor för att säkerställa tillräcklig valet genom Amp, bra utväxt och avkastning. Transformationsbetingelser för behöriga celler erhållna från andra källor kan variera och bör konsulteras. </p&gt; Alla stegen i proteinberedningen protokollet (från steg 2.3) och analysen (från steg 3,2) bör utföras vid 4 ° C med kylda lösningarna och centrifuger. Bakteriell lys (steg 2.5) bör vara grundlig och fullständig för att erhålla en homogen suspension. När lysera bakterier, virvel och pipettera lysatet växelvis, medan den hålls vid 4 ° C och säkerställa sonikering görs på is för att förhindra denaturering av proteinet. Om du använder en annan modell av sonikator, får villkor behöva justeras. Inkubation av sonikat med pärlorna ska alltid göras vid 4 ° C på en rotator för att säkerställa tillräcklig bindning och försiktighet bör vidtas för att hålla timing konsekvent. GST-Rho mutanter är något instabila när de uttrycks i bakterier, så det är bäst att använda förberedda pärlor direkt eller inom några dagar. Nederbörden analys (del 3) är tid och temperatur känslig, enaktiva GEFs lätt kan förloras från cellysatet, och därför bör steg utföras så snabbt som möjligt. Följande avsnitt innehåller en del felsökningstips. Ingen eller mycket liten mängd av mutant Rho-protein i den slutliga pärlan beredningen: detta kan vara orsakad av ineffektiv induktion, otillräcklig lys av bakterierna, eller en förlust av proteinet under framställningen process eller lagring. För att hjälpa felsöka några av dessa möjligheter, kan prover av bakterier analyseras före och efter induktion. Om det är dålig induktion av proteinet upprepa processen med användning av en koloni från en färskt strimmigt platta eller från att åter-transformerade kompetenta celler. Olika IPTG koncentrationer och tider induktion bör också testas. Om lys är otillräcklig (dvs proteinet förblir i pelleten istället för supernatanten) varierar salt och tvättmedel koncentrationerna i lyseringsbuffert kan prövas. Alternativa sonikering tider ochInställningarna bör övervägas, och prover före och efter ultraljudsbehandling kan kontrolleras genom mikroskopi för att bestämma effektiviteten i lys. Nej fälls GEF, trots att GST-proteinet finns på pärlorna: Detta kan bero på tekniska problem under utfällningen analysen, eller genom en verklig brist på aktivering av den studerade GEF med stimulans tillämpas. Använd alltid en känd stimulans som en positiv kontroll för att verifiera att din analys fungerar. Använda de preparerade pärlorna inom några dagar. Om nederbörden analysen fångar omätbara mängder av GEF studerade under alla förhållanden, kontrollera att din GEF finns och är väl detekteras i supernatanten efter centrifugering som ska användas för analysen (steg 3,3). Se till att alla buffertar och proteashämmare är fräscha och utföra alla steg på is så fort som möjligt. Öka mängden ingående protein (t.ex. genom användning av lysat från 2 plattor / prov). Om utfällning analysen visar basala utfälldförandet av din GEF, men ingen skillnad ses mellan kontroll-och stimulerade prover (figur 4), börja felsökning genom att kontrollera att tillämpas stimulans arbetat med andra kända effekter (t.ex. genom att detektera aktivering av andra signalvägar). Överväga att ändra behandlingen arbetsförhållanden eller koncentrationer. Lita på data från litteraturen rapporteringen hur stimulans aktiverar Rho eller andra signalering att förutsäga sannolika tider och koncentrationer. När du optimerar behandlingstid, använda både korta och långa tidpunkter, som GEF aktivering kan vara bäst upptäckas vid en tidpunkt före väl detekterbart Rho aktivering. Slutligen kan samma stimulus resultera i en varierande grad av aktivering på grund av en förändring i cellskänslighet orsakad av passage-antal, cell konfluens, etc

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (valfri) </td></tr><tr><td> pGEX-RhoA (G17A) </td><td> Addgene </td><td> Kommer snart </td><td> Genereras i labbet av Dr Keith Burridge (University of North Carolina) (ref 3) </td></tr><tr><td> DH5a </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> Lagra -80 ° C </td></tr><tr><td> SOC-medium </td><td> BioShop </td><td> SOC001.10 </td><td></td></tr><tr><td> LB </td><td> BioShop </td><td> LBL407.1 </td><td> Hålla steril </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> BioShop </td><td> GLY002.1 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td> BioShop </td><td> AMP201.25 </td><td> Betesdjur vid -20 ° C </td></tr><tr><td> Agar </td><td> BioShop </td><td> AGR001.500 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (isopropyl BD-tiogalakto-pyranosid) </td><td> Calbio-chem </td><td> 420.322 </td><td> Lagra förrådslösning vid -20 ° C </td></tr><tr><td> Glutation Sepharose-pärlor </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0756-01 </td><td></td></tr><tr><td> PBS 10x </td><td> SIGMA </td><td> D1408 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> SIGMA </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BioShop </td><td> SOD001.10 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl2- </td><td> SIGMA </td><td> M-9272 </td><td> Tillsätt precis innan användning </td></tr><tr><td> TX-100 </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> OmniPur EMD </td><td> 3860 </td><td> Tillsätt precis innan användning </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> SIGMA </td><td> P-7626 </td><td> Tillsätt precis innan användning </td></tr><tr><td> Protease Inhibitor 50x </td><td> BD Baculo-Guld </td><td> 51-21426Z </td><td> Tillsätt precis innan användning </td></tr><tr&gt; <td> Komplett Mini, EDTA-fritt 10x </td><td> Roche </td><td> 11 836 170 001 </td><td> Tillsätt precis innan användning </td></tr><tr><td> Laemmli provbuffert 2x </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0737 </td><td></td></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> SIGMA </td><td> M7154 </td><td> Tillsätt precis innan användning </td></tr><tr><td> Coomassie Brilliant Blue </td><td> Bio-Rad </td><td> R-250 </td><td></td></tr><tr><td> Ättiksyra </td><td> Caledon </td><td> 1000-1 </td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Caledon </td><td> 6701-7 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Rad Protein Assay </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0114 </td><td></td></tr><tr><td> BLUeye stege </td><td> FroggaBio </td><td> PM008-0500 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 1. Reagens som används. <table border="1"><tbody><tr><td> Namn utrustning </td><td> Företaget </td&gt; <td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (valfri) </td></tr><tr><td> RC-5B centrifug </td><td> Sorvall </td><td> SS-34 rötor </td><td> Använda vid 4 ° C </td></tr><tr><td> Centrifugera </td><td> Sorvall-Thermo Scientific </td><td> ST-16R </td><td> Använda vid 4 ° C </td></tr><tr><td> Mikro-centrifug </td><td> Eppendorf </td><td> 5417R </td><td> Använda vid 4 ° C </td></tr><tr><td> Bakteriell skakapparat </td><td> INFORS HT Ecotron </td><td> AG CH-1403 Bottmingen </td><td> Använda vid 37 ° C eller vid 22 ° C </td></tr><tr><td> Sonikator </td><td> Branson </td><td> Sonifier-450 </td><td> Använd vid RT </td></tr><tr><td> Rotator </td><td> Glas-Col </td><td> 099A CR4012 </td><td> Använda vid 4 ° C </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Särskilda begagnade utrustningar.

affinity precipitation of active rho-gefs using a gst-tagged mutant rho protein (gst-rhoa(g17a)) from epithelial cell lysates

Proteiner i Rho familj av små GTPases är centrala regulatorer av cytoskelettet, och styra ett stort utbud av cellulära processer, inklusive cell migration, genuttryck, cellcykelprogression och celladhesion 1. Rho proteiner är molekylära switchar som är aktiva i GTP-bunden och inaktiv i BNP-bundet tillstånd. Deras aktivering medieras av en familj av guanin-nukleotid (GEF) Exchange Faktor proteiner. Rho-GEFs utgör en stor familj, med överlappande särdrag 2. Även om en hel del framsteg har gjorts för att identifiera de GEFs aktiveras av specifika signaler, finns det fortfarande många frågor återstår om vägen-regleringen av dessa proteiner. Antalet Rho-GEFs överstiger 70, och varje cell uttrycker mer än en GEF proteinet. Dessutom är många av dessa proteiner aktiveras inte bara Rho, men andra medlemmar av familjen, bidrar ytterligare till komplexiteten i de regulatoriska nätverk. Viktigt att utforskahur GEFs regleras kräver en metod för att följa den aktiva poolen av individuella GEFs i celler som aktiveras av olika stimuli. Här erbjuder vi en steg-för-steg protokoll för en metod som används för att bedöma och kvantifiera de tillgängliga aktiva Rho-specifika GEFs med en analys affinitet nederbörd. Denna analys utvecklades för några år sedan i Burridge labbet 3,4 och vi har använt det i njure tubulära cellinjer 5,6,7. Analysen utnyttjar ett &quot;nukleotid fri&quot;-mutant RhoA, med en hög affinitet för aktiva GEFs. Mutationen (G17A) gör proteinet oförmöget att binda BNP eller GTP och detta tillstånd härmar det mellanliggande läget som är bunden till GEF. En GST-märkt version av denna mutant protein uttrycks och renas från E. coli, som är bundna till glutation Sepharose-pärlor och användes för att fälla aktiva GEFs från lysat av obehandlade och stimulerade celler. Eftersom de flesta GEFs aktiveras via post-translationella modifieringar eller utsläpp från hämmande bindningar, deras aktiva statligabevaras i cellysat, och de kan detekteras genom denna analys 8. Infångade proteinerna kan sonderas för kända GEFs genom detektion med specifika antikroppar med användning av Western blotting, eller analyseras genom masspektrometri för att identifiera okända GEFs aktiveras av vissa stimuli.

Watch this Scientific Journal Video about Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates at JoVE.com

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates

Den metod som presenteras här beskriver en analys för att följa aktivering av RhoA specifika GDP / GTP Exchange Faktorer (GEFs) i odlade celler genom att använda en mutant RhoA GST-fusionsprotein som har hög affinitet för aktiverade GEFs. GEFs fälls ut från cellysat, påvisades med Western blotting och kvantifieras genom densitometri.

Affinity Utfällning av aktiva Rho-GEFs Använda en GST-märkt Mutant Rho Protein (GST-RhoA (G17A)) från epitelceller Lysaten

Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell ...

Research

JoVE Journal

Biology

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolering av labil Multi-proteinkomplex av In vivo Kontrollerad Cellular tvärbindning och Immuno-magnetiska affinitetskromatografi

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescens komplement (BiFC) analys av protein-protein interaktion i lök celler med Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Blå Native polyakrylamidgelelektrofores (BN-PAGE) för analys av Multiproteinkomplex från Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Blås-medierad affinitetskromatografi med magnetkamera Aktivt cellsortering (LIMACS): en ny metod för att analysera protein-lipid Interaktion

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Kromatografiska Rening av högaktiv Jäst Ribosomer

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Ortogonal proteinrening underlättas av en liten Bispecific Affinity Tagg

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Identifiering av Protein Samverkande Partners Använda Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

En vätskefas affinitetsinfångning Analys med användning av magnetiska pärlor för att studera protein-proteininteraktion: polioviruset-Nanobody Exempel

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Ett protokoll för Fag Display och Affinity val med rekombinanta protein Beten

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

Transgena Gnagare analys för att kvantifiera Man Germ Cell Mutant Frekvens

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...