Name: detection of rare genomic variants from pooled sequencing using splinter
Uploaded: 2012-06-23T14:00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Barnens Discovery Institute bidrag MC-II-2006-1 (RDM och TED), NIH Epigenetik färdplanen bidrag [1R01DA025744-01 och 3R01DA025744-02S1] (RDM och FLMV), U01AG023746 (SC), den Saigh Foundation (FLMV och TED), 1K08CA140720-01A1 och Alex Lemonade Stand &quot;A&quot; Award stöd (TED). Vi tackar Genome Center Technology Access i institutionen för genetik vid Washington University School of Medicine för att få hjälp med genomisk analys. Centret är delvis stöds av NCI Cancer Support Grant # P30 CA91842 till Siteman Cancer Center och IKT / CTSA Grant # UL1RR024992 från NationalCenter för forskning Resources (NCRR), en del av National Institutes of Health (NIH) och NIH Roadmap för medicinsk forskning. Denna publikation är endast ansvar författarnas egna och inte nödvändigtvis den officiella syn på NCRR och NIH.

<ol>
	<li>Vallania, F. L. M., Druley, T. E., Ramos, E., Wang, J., Borecki, I., Province, M., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+discovery+of+rare+insertions+and+deletions+in+large+cohorts.">High-throughput discovery of rare insertions and deletions in large cohorts.</a> Genome Research. 20, 1391-1397 (2010).</li><li>Shendure, J., Mitra, R., Varma, C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+Sequencing+Technologies:+Methods+and+Goals.">Advanced Sequencing Technologies: Methods and Goals.</a> Nature Reviews of Genetics. 5, 335-344 (2004).</li><li>The 1000 Genomes Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+map+of+human+genome+variation+from+population-scale+sequencing.">A map of human genome variation from population-scale sequencing.</a> Nature. 467, 1061-1073 (2010).</li><li>Manolio, T. A., Collins, F. S., Cox, N. J., Goldstein, D. B., Hindorff, L. A., Hunter, D. J., McCarthy, M. I., Ramos, E. M., Cardon, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+missing+heritability+of+complex+diseases.">Finding the missing heritability of complex diseases.</a> Nature. 461, 747-753 (2009).</li><li>Reich, D. E., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+allelic+spectrum+of+human+disease.">On the allelic spectrum of human disease.</a> Trends Genet. 17, 502-510 (2001).</li><li>Cohen, J. C., Kiss, R. S., Pertsemlidis, A., Marcel, Y. L., McPherson, R., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+rare+alleles+contribute+to+low+plasma+levels+of+HDL+cholesterol.">Multiple rare alleles contribute to low plasma levels of HDL cholesterol.</a> Science. 305, 869-872 (2004).</li><li>Ji, W., Foo, J. N., O'Roak, B. J., Zhao, H., Larson, M. G., Simon, D. B., Newton-Cheh, C., State, M. W., Levy, D., Lifton, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+independent+mutations+in+renal+salt+handling+genes+contribute+to+blood+pressure+variation.">Rare independent mutations in renal salt handling genes contribute to blood pressure variation.</a> Nat. Genet. 40, 592-599 (2008).</li><li>Ahituv, N., Kavaslar, N., Schackwitz, W., Ustaszewska, A., Martin, J., Hebert, S., Doelle, H., Ersoy, B., Kryukov, G., Schmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+sequencing+at+the+extremes+of+human+body+mass.">Medical sequencing at the extremes of human body mass.</a> Am. J. Hum. Genet. 80, 779-791 (2007).</li><li>Druley, T. E., Vallania, F. L., Wegner, D. J., Varley, K. E., Knowles, O. L., Bonds, J. A., Robison, S. W., Doniger, S. W., Hamvas, A., Cole, F. S., Fay, J. C., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+rare+allelic+variants+from+pooled+genomic+DNA.">Quantification of rare allelic variants from pooled genomic DNA.</a> Nat. Methods. 6, 263-265 (2009).</li><li>Mitra, R. D., Butty, V., Shendure, J., Housman, D., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Genotyping+and+Haplotyping+with+Polymerase+Colonies.">Digital Genotyping and Haplotyping with Polymerase Colonies.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 5926-5931 (2003).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

Det finns ökande bevis för att incidensen och terapeutiska svaret av gemensamma, komplexa fenotyper och sjukdomar såsom fetma 8, hyperkolesterolemi 4, hypertoni 7 och andra kan modereras av personliga profiler av sällsynta variation. Identifiera gener och vägar där dessa varianter samlade i drabbade befolkningen kommer att få djupgående diagnostiska och terapeutiska konsekvenser, men att analysera drabbade individer var för sig kan vara tid och kostar oöverkomliga. Populationsbaserade analys erbjuder en mer effektiv metod för mätning genetisk variation vid multipla loci. Vi presenterar en ny poolad-DNA-sekvensering protokoll ihop med SPLINTER mjukvarupaket för att identifiera den här typen av genetisk variation mellan populationer. Vi visar riktigheten av denna metod för att identifiera och kvantifiera mindre alleler i en poolad stor population av 947 individer, inklusive sällsynta varianter som varkallas de novo från poolade sekvensering och validerats av enskilda Pyrosequencing. Vår strategi skiljer sig främst från andra protokoll genom införlivandet av en positiv och en negativ kontroll inom varje experiment. Detta gör SPLINTER att nå mycket högre precision och kraft jämfört med andra metoder 1. Den optimala täckningen av 25-faldig per allelen fastställs oberoende av storleken på poolen, vilket gör analys av stora pooler möjligt eftersom detta krav endast skalor linjärt med pool storlek. Vårt tillvägagångssätt är mycket flexibel och kan tillämpas på alla fenotyp av intresse utan också prover som av naturen är heterogena, såsom blandade cellpopulationer och tumörbiopsier. Med tanke på den ständigt ökande intresset för poolade sekvensering av stora målområden som exome eller genom, är vårt bibliotek prep och splittras analys kompatibel med specialanpassade avskiljning och hel-exome sekvensering, men inriktningen nytta i SPLINTER paketet inte konstruerade för storreferenser sekvenser. Därför har vi använt framgångsrikt dynamisk programmering Aligner, Novoalign för genomet hela inriktningar följt av variant ringer från samlingsprov (Ramos et al., Inlämnad). Således kan vi samman sekvenseringsstrategi skala framgångsrikt till större pooler med ökande mängder av målsekvensen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens Namn </td><td> Företaget </td><td> Katalognr </td><td> § </td></tr><tr><td> PfuUltra High-Fidelity </td><td> Agilent </td><td> 600.384 </td><td> 1,4 </td></tr><tr><td> Betain </td><td> SIGMA </td><td> B2629 </td><td> 1,4 </td></tr><tr><td> M13mp18 ssDNA-vektorn </td><td> NEB </td><td> N4040S </td><td> 1,5 </td></tr><tr><td> pGEM-T Easy </td><td> Promega </td><td> A1360 </td><td> 1,5 </td></tr><tr><td> T4 polynukleotidkinas </td><td> NEB </td><td> M0201S </td><td> 2,2 </td></tr><tr><td> T4-ligas </td><td> NEB </td><td> M0202S </td><td> 2,2 </td></tr><tr><td> Polyetylenglykol 8000 MW </td><td> SIGMA </td><td> P5413 </td><td> 2,2 </td></tr><tr><td> Bioruptor sonikator </td><td> Diagenode </td><td> UCD-200-TS</td><td> 2,3 </td></tr></tbody></table>

detection of rare genomic variants from pooled sequencing using splinter

Såsom DNA-sekvensering Tekniken har markant framåt under senare år 2, har det blivit alltmer uppenbart att mängden av genetisk variation mellan två individer är större än man tidigare trott 3. Däremot har array-baserad genotypning misslyckades med att identifiera en betydande bidrag gemensamma sekvensvarianter till fenotypiska variabiliteten för vanlig sjukdom 4,5. Sammantaget har dessa observationer lett till utvecklingen av den gemensamma Sjukdom / Sällsynta Variant hypotesen tyder på att majoriteten av den &quot;felande ärftlighet&quot; i gemensamma och komplexa fenotyper beror snarare på en individs personliga profil för sällsynta eller privata DNA-varianter 6-8 . Men karakterisera hur sällsynt variation påverkar komplexa fenotyper kräver analys av många drabbade individer på många genomiska loci, och är idealiskt jämfört med en liknande undersökning i en opåverkad kohort. Trots sekvensering kraften som erbjuds av dagens plattformar, enbefolkningsbaserad undersökning av många genomiska loci och den efterföljande beräkningsmässiga analysen krävs fortfarande oöverkomliga för många forskare. För att möta detta behov har vi utvecklat en poolad sekvensering synsätt 1,9 och ett nytt programpaket 1 för mycket noggrann sällsynta varianten upptäckt från de resulterande data. Förmågan att samla genomen från hela populationer av drabbade individer och kartlägga graden av genetisk variation på flera utvalda regioner i en enda sekvensering bibliotek erbjuder utmärkta kostnads-och tidsbesparingar till traditionell enda prov sekvensering metod. Med en genomsnittlig sekvensering täckning per allel av 25-faldig, använder våra kunder algoritm splittras, en intern variant kallar strategi för att ringa infogningar, borttagningar och ersättningar upp till fyra baspar i längd med hög känslighet och specificitet från pooler på upp till 1 mutantallelen i 500 individer. Här beskriver vi den metod för framställning av poolade sequencing biblioteket följt av steg-för-steg instruktioner om hur du använder SPLINTER paketet för poolad sekvensering analys ( <a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a> ). Vi visar en jämförelse mellan poolad sekvensering av 947 individer, genomgick alla som också genom-brett utbud på över 20KB av sekvensering per person. Överensstämmelse mellan genotypning av taggade och varianter nya kallas i det poolade provet var utmärkta. Denna metod kan lätt skalas upp till vilket som helst antal av genomiska locus och varje rad individer. Genom att införliva de inre positiva och negativa amplicon kontroller vid förhållanden som efterliknar befolkningen som studeras kan algoritmen kalibreras för optimal prestanda. Denna strategi kan även modifieras för användning med hybridisering fånga eller individ-specifika streckkoder och kan tillämpas på sekvensering av naturligt heterogena prover, såsom tumör-DNA.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER at JoVE.com

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

Poolad DNA-sekvensering är en snabb och kostnadseffektiv strategi för att upptäcka sällsynta varianter som är förknippade med komplexa fenotyper i stora kohorter. Här beskriver vi beräkningsmässig analys av poolade, nästa generations sekvensering av 32 cancer-relaterade gener med användning av paketet SPLINTER mjukvara. Denna metod är skalbar och tillämplig på alla fenotyp av intresse.

Detektering av sällsynta genomiska varianter från poolad sekvensering med SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolering av genomisk DNA från mus Tails

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Utvinning av hög molekylvikt Genomiskt DNA från mark och sediment

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

Konkurrenskraftiga Genomic skärmar av streckkodade Jäst bibliotek

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Selektiv fångst av 5-hydroxymethylcytosine från genomisk DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array jämförande genomik hybridisering (Array CGH) för detektion av genomiska Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Isolera förstärkas Hsp104 Varianter Använda Jäst Proteinopathy modeller

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

TRAP-rc, Översättning Ribosom Affinity Purification från sällsynta cellpopulationer av<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryon

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Förstärkning, Nästa generations sekvensering, och Genomic DNA Kartläggning av retroviral integration webbplatser

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

Riktade RNA Sequencing analys för att karaktärisera Gene Expression och Genomic Ändringar

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

Genomteknik för primära mänskliga B-celler med CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...