Name: development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation
Uploaded: 2012-07-10T12:00:00
Duration: 10 min 1 s
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Finanzierungsquellen: Diese Arbeit gemäß National Institutes of Health Zuschüsse HL067177, HL096845 unterstützt, und P01AI084853 zu DSW

1. Donor Vorgehensweise <ol><li> Alle chirurgischen Eingriffe wurden durchgeführt unter Verwendung steriler Technik. Keine Antibiotika sind Spender und Empfänger Mäuse gegeben. </li><li> Die Induktion der Anästhesie der Donor-Maus wird mit 5% Isofluran eingeleitet. </li><li> Die Maus wird orotracheal mit einer 20-Gauge-intravenösen Katheter intubiert und dann auf einem Nagetier Beatmungsgerät angebracht, wobei 100% Sauerstoff bei einer Rate von 125 Atemzüge / Minute und etwa 0,5 ml Atemzugvolumen (2% ihres Körpergewichts). </li><li> Die Narkose wird mit inhalativen 1-2% Isofluran aufrechterhalten. </li><li> Der Spender Maus in Rückenlage gebracht wird, präpariert mit 70% Alkohol. </li><li> Laparosternotomy ist als kombiniertes Mittellinie und quere Inzision durchgeführt. </li><li> Heparin bei 100 U / kg in die Vena cava inferior (IVC) injiziert, von unmittelbar unter der Leber. </li><li> Die Membran ist auf der ventralen Rippen Anlage gegen die Wirbelsäule geschnitten und die Brusthöhle durch Schneiden auf beiden Seiten der Brust ausgesetztWand bis zum Hals. </li><li> Nach dem Einschneiden der IVC auf der Ebene der Membran wird die rechte Herzohr geschnitten und die Lunge gespült mit 2 ml gekühltem (4 ° C) Ringer-Lactat-Einspritzung und 0,1 ml Heparin über eine quere Inzision an der Wurzel der Lungenarterie ( PA) Kofferraum. </li><li> Verhaftung Belüftung bei zwei Drittel der endexspiratorischen Inflation wird die Herz-Lungen-Block herausgeschnitten und auf Eis gelagert (4 ° C). </li><li> Der Spender linke Lunge ist für den Empfänger durch die Anbringung von Manschetten hergestellt. Das Lig. pulmonale wird bis zu der Lungenvene (PV) eingeschnitten. Der Hilus wird durch das Entfernen der Speiseröhre und der Aorta gebracht. </li><li> Identifizieren Sie die PA, am meisten kranial des Hilus befindet, sowie die angeschlossenen Hauptbronchus (Br). Sorgfältig sezieren die PA aus den Bronchien. </li><li> PA Manschette wird von einer 24-Gauge intravenöse (IV)-Katheter gemacht und geschnitten, um 0,5 mm in der Länge mit einer Ausdehnung von 0,7 mm. </li><li> Die gesamte Oberfläche der Manschette wird dann abgeschliffen, um Anastomose zu erleichternMOSIS. </li><li> Die Manschette für den Bronchus von einer 20-Gauge-IV-Katheter abgeleitet und geschnitten in der Länge von 1,0 mm mit einer Ausdehnung von 0,7 mm. </li><li> Unter Verwendung der gleichen Materialien, variiert die PV Manschette mit dem Gewicht der Donor-Maus. Speziell für Mäuse von 24 bis 27 Gramm der Manschette ist 22-Gauge-, 0,7 mm in der Länge mit einer 0,7 mm-Erweiterung. Bei Mäusen mit einem Gewicht von 27-32 Gramm, verwendet die Studien eine 20-Gauge-Katheter, 0,7 mm in der Länge mit einer 0,7 mm-Erweiterung ist. </li><li> Die Manschetten sind in den distalen Enden der PA, PV-und Br eingesteckt und mit einem 9-0 Faden. </li><li> Der Spender Lunge gespült und gewaschen mit steriler Kochsalzlösung mit steriler Heparin vor der Lagerung. Der Spender Lunge wird dann mit steriler Gaze in steriler Kochsalzlösung getränkt auf Eis (4 ° C), die die Lunge sehr sauber und steril hält gewickelt. </li><li> Ein Mikrogefäßzellen Klemme an den Bronchus in der Lage, Ringer-Lactat-Eintrag in die Luftröhre zu verhindern. </li></ol> 2. Empfänger Vorgehensweise <ol><li> Die Induktion von AnesAnästhesie und Beatmung sind die gleichen wie für den Spender oben beschrieben. </li><li> Die linke Brustwand wird rasiert und desinfiziert mit 70% Alkohol und das OP-Feld wird drapiert. </li><li> Eine Thorakotomie Einschnitt wird in der linken dritten Interkostalraum vorgenommen, die sich dorsal den Einschnitt in der Nähe der Wirbelsäule und eine Mikrogefäßzellen Klammer auf der linken Lungengefäße und Bronchien neben dem Herzen platziert. Sie können PA am kranialen Aspekt sehen, PV am kaudalen Ende des Hilus und Br zwischen ihnen. </li><li> Mit leichten Zug auf die Gefäßklemme zu milde Spannung auf der PA-, Br und PV zu verursachen, wird die linke Lunge aus der Brusthöhle gezogen, während wobei die zentralen Hilusgebilde eingespannt. </li><li> Die PA, PV-und Br werden durch stumpfe Dissektion, indem Sie einen 9-0 Faden locker um den PA, PV-und Br positioniert gefolgt isoliert. </li><li> Nach der Zerlegung des PA völlig von seiner Adventitia Mantel, einem kleinen queren Schnitt von etwa einem Viertel des Umfangs des Schiffes istgemacht in die vordere Wand, so dass die Fortsetzung der dorsale Teil der Arterie intakt. </li><li> Der Spender Lunge, in der Kälte, Ringer-Lactat-Watte Gaze gehüllt und wie oben beschrieben hergestellt, wird dann in die Brusthöhle positioniert ist, und Manschetten in den Empfänger PA, PV und Br eingesetzt und mit 9-0 Nahtmaterial. </li><li> Der Hilus Kreuzklemme ist abnehmbar, was für die Reperfusion und Lüftung. </li><li> Nach der Positionierung der transplantierten Lunge zurück in den Empfänger Thorax wird die Thorakotomie Einschnitt verschlossen mit einem 5-0 Faden. </li><li> Die Maus ist berechtigt, von der Narkose erholen. Buprenorphin (0,05-0,15 mg / kg) wird unmittelbar nach der Operation verabreicht, und für alle 8 Stunden für 2-3 Tage nach der Operation. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse Unsere Erfahrung hat uns gelehrt, dass es mehrere Monate wiederholte Praxis, sich in der Maus-Lungen-Transplantation Modell beherrschen erfordert. Nach dem Kenntnisstand erreicht ist, wir einchieved einen 96% (96/100 aufeinander folgenden Operationen) perioperative Überlebensrate mit Eintritt des Todes innerhalb sieben Tage nach der Operation. Zwei Todesfälle waren auf Blutungen, die intraoperativ begonnen, und pneumothraces waren die Ursache des Todes in den beiden anderen Mäusen. Für alle Verfahren, war die warme Ischämiezeit 14,32 ± 3,14 Minuten, und kalte Ischämiezeit betrug 58,51 ± 18,06 Minuten. Drei orthotopen Lungentransplantation Gruppen untersucht: Isograft: C57BL / 6 → C57BL / 6, Allotransplantat: C57BL/10 → C57BL / 6 und C57BL / 6 → C57BL/10. Wir haben nur männliche Mäuse, aber unsere Technik kann auch für weibliche Mäuse aufgetragen werden, weil es keine signifikanten anatomischen Unterschiede zwischen den Geschlechtern. Grading der Ablehnung Pathologie wurde verblindet Verwendung von Standard-Kriterien für die klinische Lungentransplantation 7 (Tabelle 1) durchgeführt. Während wir milde oder gar keine Ablehnung beobachtet in Isograft (C57BL / 6 → C57BL / 6), beide Allograft-Kombinationen Unternehmen entwickeltrable akute oder chronische Abstoßung (1). Im Gegensatz dazu war OB signifikant häufiger in der C57BL/10 → C57BL / 6 als C57BL / 6 → C57BL/10 Gruppe von day28 (Tabelle 1). <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> C57BL / 6 → C57BL / 6 </td><td> C57BL/10 → C57BL / 6 </td><td> C57BL / 6 → C57BL/10 </td><td> P-Wert </td></tr><tr><td> Die Ablehnung Pathologie &quot;A&quot;-Scores an Tag 28 </td><td> 0,67 ± 0,89 </td><td> * 3,33 ± 0,82 </td><td> * 3,29 ± 0,76 </td><td> * P &lt;0,05 </td></tr><tr><td> OB / Total Mäusen am Tag 21 und 28 </td><td> 0/24 (0%) </td><td> ** 14/34 (42,1%) </td><td> ** 16.2 (12.5%) </td><td> ** P &lt;0,05 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Histologischen Werte der akuten Abstoßung und Prävalenz der Bronchiolitis obliterans nach der Transplantation. Scoring der akuten Abstoßung (&quot;A&quot; Scores) von Standard-CRIterien wie beschrieben in repräsentative Ergebnisse. Daten stellt den Mittelwert ± Standardabweichung von &quot;A&quot;-Scores bei Tage 28 nach der Transplantation. Daten stellt die Menge und den Prozentsatz der Mäuse in jeder Gruppe, OB an den Tagen 21 und 28 nach der Transplantation entwickelt. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3947/3947fig1.jpg" /> Abbildung 1. Makroskopischen Befunden und Histopathologie bei 28 Tage nach der Lungentransplantation. Einlage 1A stellen makroskopisch und H &amp; E gefärbten Isograft Lunge und der rechten Lunge naiv. Systemsteuerung 1B und 1C für H &amp; E und Masson-Trichrom gefärbten BL/10 Lunge Allotransplantat in BL / 6 Mäuse Empfänger, der OB und nicht OB entwickelt, jeweils transplantiert. Der weiße Pfeil in 1B identifiziert Läsionen der OB. Panel-1D zeigt BL / 6 Lunge Allograft in BL/10 Maus Empfänger transplantiert. Haupt Fehlersuche während des Verfahrens waren wie folgt. <ol><li> Der Blutfluss Störung: Flush Spenderlunge bisdie Farbe wird in der Farbe weiß. Verwendung von zu hohem Druck könnte induzieren Lungenödem. Aber nicht zu viel Push-to-Ödem nach der Transplantation zu verhindern. </li><li> Die Schwierigkeit der Manschette Einsetzen in den Spender: Gefäßsystem zu vergewissern, dass eine ausreichende Länge und kostenlos beiliegenden Fett-und Bindegewebe ist. </li><li> Blutungen an Anastomosenstelle: Mit Q-Tipps, um den Druck auf betroffene Stelle für etwa 5 Minuten anwenden. </li><li> Empfänger PA Obstruktion des Blutflusses: Hauptsächlich durch Torsion der Manschette während der Insertion verursacht. Wenn Luft in der PA beobachtet wird dann neu zu machen der Anastomose erforderlich ist. </li><li> Schwierige PV-Anastomose: Membran der PV ist sehr dünn und leicht Tränen. Wählen Sie geeignete Manschettengröße und stecken gerade an den Empfänger der PV sehr sanft. </li><li> Empfänger PV Obstruktion des Blutflusses: Achten Sie darauf, die Position und Richtung der Manschette. Lassen Sie den Druck aus dem Bronchialsystem Manschette. </li><li> Pneumothorax: Dies kann entweder durch Perforation bronchiale aufgrund manipulatio verursacht werdenn der Atemwege oder Perforation des Lungen Oberflächenbereichs durch Trauma mit dem Transplantat Verfahren verbunden sind. Ersteres wird mit chirurgischer Verschluss des Loches in der Wand der Atemwege behandelt, und das letztere wird durch Übernähung das Leck auf der Oberfläche der Lunge mit 10-0 Nylonfaden behandelt. </li></ol>

<ol>
	<li>Asimacopoulos, P. J., Molokhia, F. A., Pegg, C. A., Norman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+transplantation+in+the+rat.">Lung transplantation in the rat.</a> Transplant Proc. 3, 583-585 (1971).</li><li>Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+technique+of+experimental+lung+transplantation+in+rabbits.">Surgical technique of experimental lung transplantation in rabbits.</a> Ann. Thorac. Cardiovasc. Surg. 11, 7-11 (2005).</li><li>McDyer, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+murine+obliterative+bronchiolitis+in+transplant.">Human and murine obliterative bronchiolitis in transplant.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 4, 37-43 (2007).</li><li>Sato, M., Keshavjee, S., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+research:+animal+models+of+obliterative+bronchiolitis+after+lung+transplantation.">Translational research: animal models of obliterative bronchiolitis after lung transplantation.</a> Am. J. Transplant. 9, 1981-1987 (2009).</li><li>Okazaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+orthotopic+vascularized+aerated+lung+transplantation.">A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation.</a> Am. J. Transplant. 7, 1672-1679 (2007).</li><li>Fan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+IL-17+Prevents+Obliterative+Bronchiolitis+in+Murine+Orthotopic+Lung+Transplantation.">Neutralizing IL-17 Prevents Obliterative Bronchiolitis in Murine Orthotopic Lung Transplantation.</a> Am. J. Transplant. 11, 911-922 (2011).</li><li>Stewart, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revision+of+the+1996+working+formulation+for+the+standardization+of+nomenclature+in+the+diagnosis+of+lung+rejection.">Revision of the 1996 working formulation for the standardization of nomenclature in the diagnosis of lung rejection.</a> J. Heart Lung Transplant. 26, 1229-1242 (2007).</li><li>Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+rat+lung+transplantation+using+a+cuff+technique.">Simplified rat lung transplantation using a cuff technique.</a> J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 97, 578-581 (1989).</li><li>Jungraithmayr, W. M., Korom, S., Hillinger, S., Weder, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+orthotopic,+single-lung+transplantation.">A mouse model of orthotopic, single-lung transplantation.</a> J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 137, 486-491 (2009).</li><li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+vascularized+right+lung+transplantation+in+the+mouse.">Orthotopic vascularized right lung transplantation in the mouse.</a> J. Thorac. Cardiovasc. Surg. , (2010).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Orthotopen Lungentransplantation bei Mäusen ist eine Herausforderung aufgrund der mikrochirurgischen Anforderungen und extreme Empfindlichkeit der Gewebe. Einführung der Manschette Technik hat für den weit verbreiteten Einsatz der orthotopen Lungentransplantation bei Ratten 8 erlaubt. Dies wurde die Grundlage für die Entwicklung des orthotopen Lungentransplantation Modell bei Mäusen in unserem Labor. Bei Mäusen und Ratten, im Gegensatz zum Menschen sind in der linken Lunge nur einen Lappen und macht nur 25% der gesamten Lunge Masse. Dies macht linken einzigen Lungentransplantation möglich in dem Mausmodell ohne die Notwendigkeit einer Kreislaufunterstützungssystem. Unsere vorläufigen Praxen ergab, dass Ventilation und Perfusion des transplantierten Lunge stark abhängig von der Größe der PV-Anastomose war. Spezifische PV anastomotischen Manschettengröße wurden verwendet, um Spender und Empfänger übereinstimmen, wie berichtet, 9. Unangemessene Manschette Dimensionierung entweder in Atelektase des transplantierten Lunge oder Dehiszenz der PV ANAST führteomosis. Okazaki et al berichteten über die Verwendung von kombinierten Gefäßligation und Beschneiden des Bronchus 5. In der aktuellen Studie verwenden wir ein Aneurysma-Clip für alle Hilusgebilde, die wir empfehlen können warme Ischämie zu verkürzen. Eine Einschränkung des orthotopen linken Lungen-Transplantation im Mausmodell ist, dass Empfänger Tiere können nach alloimmuner-vermittelte Nekrose ihrer Allotransplantate 5 zu überleben. Daher sind Studien Überleben nicht möglich ist und Transplantat Einschätzung hängt die histologische Untersuchung des transplantierten Lunge 10. Mit dieser Technik haben wir eine präklinische Bronchiolitis obliterans-Modell bei Mäusen entwickelt. Insbesondere ist die Donor-Maus C57BL/10 und der Empfänger C57BL / 6. Dies legt nahe, die Rolle der kleinen und nicht großen, Histokompatibilitätsantigene in Bronchiolitis obliterans Pathogenese 6. Darüber hinaus haben wir berichteten neutralisieren IL-17 verhindert, Bronchiolitis obliterans im Mausmodell. Dieser Modusl stellt einen neuartigen Forschungs-Werkzeug für die Untersuchung von Lungen-Transplantation und die Weiterentwicklung der klinischen Lungen-Transplantationen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Bezeichnung des Geräts </td><td> Firma </td><td> Katalog Anzahl </td></tr><tr><td> Zeiss OPMI 6SFC-1880 </td><td> Prescotts Inc </td><td> PMZ014 </td></tr><tr><td> Harvard Rodent Ventilator </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 55-7058 </td></tr><tr><td> 20-Gauge-IV-Katheter </td><td> Terumo Medical Corporation </td><td> 100510D </td></tr><tr><td> 22-Gauge-IV-Katheter </td><td> Terumo Medical Corporation </td><td> 081015S </td></tr><tr><td> 24-Gauge-IV-Katheter </td><td> Terumo Medical Corporation </td><td> 100522A </td></tr><tr><td> 9/0 Meth. Blue Virgin Silk </td><td> Ashaway Line &amp; CO Bindfäden Mfg </td><td> MBVS-90 </td></tr><tr><td> 10-0 Alcon Chirurgische </td><td> Alcon Laboratories, Inc </td><td> 8065-192101 </td></tr><tr><td> Bl.ack Geflochtene Seide 5-0/18inches </td><td> Henry Schein </td><td> M652630 </td></tr><tr><td> Heparin-Natrium 1000 Einheiten / ml </td><td> APP Pharmaceuticals </td><td> 407156 </td></tr><tr><td> Betadine Lösung </td><td> Purdue Produkt </td><td> 67618-150 </td></tr><tr><td> Ringer-Laktat-Injektionslösung </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-7953-03 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Stamm der Mäuse </td><td> Verkäufer </td><td> Alter, Gewicht </td><td> Geschlecht, Kommentare </td></tr><tr><td> C57BL/10 </td><td> Harlan Sprague-Dawley </td><td> 8-12 Wochen, 25-30g </td><td> Männlich, Spender </td></tr><tr><td> C57BL / 6 </td><td> Harlan Sprague-Dawley </td><td> 8-12 Wochen, 25-30g </td><td> Männlich, Spender oder Empfänger </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Tabelle der Mäuse, speIC Reagenzien und Geräte.

development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation

Orthotopen Lungentransplantation bei Ratten wurde zuerst von Asimacopoulos und Kollegen im Jahr 1971 1 angegeben. Derzeit ist diese Methode auch anerkannten und standardisierten nicht nur für die Untersuchung von allo-Ablehnung, sondern auch zwischen syngenen Stämme für die Prüfung Mechanismen der Ischämie-Reperfusionsverletzung nach Lungentransplantation. Obwohl die Anwendung der Ratte und anderen Großtiermodell 2 maßgeblich an der Aufklärung dieser Studien wird die Bedeutung dieser Untersuchungen durch die Knappheit der Knockout und transgenen Ratten beschränkt. Aufgrund keine wirksamen Therapien für Bronchiolitis obliterans, die führende Todesursache in den Lungen-Transplantation Patienten gab es eine intensive Suche nach vorklinischen Modellen, die Bronchiolitis obliterans replizieren. Die Trachea Allotransplantat Modell ist das am weitesten verbreitete und können einige der histopathologische Merkmale der Bronchiolitis obliterans 3 geben. Durch das Fehlen eines intakten vasculature ohne Anschluss an die Empfängeradresse leitenden Atemwegen und unvollständige pathologische Merkmale der Bronchiolitis obliterans begrenzen die Nützlichkeit dieses Modells 4. Anders als bei der Transplantation von anderen soliden Organen, haben vaskularisierten Maus Lungen-Transplantationen erst kürzlich von Okazaki und Kollegen wurden zum ersten Mal in 2007 5 berichtet. Die Anwendung der Grundprinzipien der Ratte Lungen-Transplantation, initiiert unserem Labor das Bronchiolitis obliterans-Modell mit kleineren histoinkompatiblen Antigen murinen orthotopen linken Single-Lungen-Transplantationen, die das weitere Studium der Bronchiolitis obliterans Immunpathogenese 6 ermöglicht.

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Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation

Bronchiolitis obliterans ist der Schlüssel Hindernis für die langfristige Überleben der Lunge Transplantatempfänger und das Fehlen einer robusten präklinischen Modell schließt die Prüfung Bronchiolitis obliterans Immunpathogenese. Im Gegensatz zu anderen Organtransplantationen hat vaskularisierten Maus Lungentransplantation erst vor kurzem entwickelt worden. Hier zeigen wir unser eigenständig entwickeltes Modell Bronchiolitis obliterans nach murinen orthotopen Single-Lungen-Transplantation.

Entwicklung einer Bronchiolitis obliterans in einem Mausmodell der orthotopen Lungentransplantation

Orthotopic lung transplantation in rats was first reported by Asimacopoulos and colleagues in 1971 1. Currently, this method is well accepted and ...

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