Name: development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation
Uploaded: 2012-07-10T12:00:00
Duration: 10 min 1 s
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Fonti di finanziamento: Questo lavoro, sostenuto dal National Institutes of borse di studio, i sanitari HL067177 HL096845 e P01AI084853 alla DSW

1. Procedura di donatori <ol><li> Tutte le procedure chirurgiche sono stati eseguiti utilizzando una tecnica sterile. Non sono indicati gli antibiotici al donatore e topi riceventi. </li><li> Induzione dell&#39;anestesia del topo donatore è iniziata con il 5% isoflurano. </li><li> Il topo è orotracheally intubati con un 20-calibro catetere endovenoso e poi posto su un ventilatore roditore, utilizzando ossigeno al 100% ad una velocità di 125 respiri al minuto e circa 0,5 ml di volume di marea (2% del suo peso corporeo). </li><li> Anestesia per via inalatoria viene mantenuto con isoflurano 1-2%. </li><li> Il topo donatore viene collocato in posizione supina, preparata con 70% di alcol. </li><li> Laparosternotomy viene eseguita come una linea mediana combinato e incisione trasversale. </li><li> Eparina a 100 u / kg è iniettato nella vena cava inferiore (IVC), da sotto il fegato. </li><li> La membrana viene tagliata lungo la attacco ventrale costale verso la colonna vertebrale, e la cavità toracica è esposto tagliando entrambi i lati del toracemurare al collo. </li><li> Dopo l&#39;incisione della IVC a livello del diaframma, della appendice atriale destra viene tagliato ed i polmoni lavato con 2 ml di raffreddamento (4 ° C) Ringer lattato di iniezione e 0,1 ml di eparina attraverso una incisione trasversale alla radice dell&#39;arteria polmonare ( PA) tronco. </li><li> L&#39;arresto di ventilazione a due terzi di fine espirazione l&#39;inflazione, il cuore-polmone blocco viene asportato e conservato su ghiaccio (4 ° C). </li><li> Il polmone sinistro del donatore viene preparato per il destinatario dal sequestro di bracciali. Il legamento polmonare è inciso fino alla vena polmonare (PV). L&#39;ilo è portato togliendo esofago e aorta. </li><li> Identificare la PA, situato l&#39;aspetto più craniale del ilo, nonché le bronco allegate principali (Br). Con attenzione sezionare il PA dai bronchi. </li><li> Bracciale PA è fatto da un 24-gauge endovenosa (IV) catetere e tagliato a 0,5 mm di lunghezza con una estensione di 0,7 mm. </li><li> L&#39;intera superficie del manicotto viene poi abrasa per facilitare anastomosi. </li><li> Il manicotto per la bronco è derivato da un calibro del catetere 20-IV, e tagliato in lunghezza di 1,0 mm con una estensione di 0,7 mm. </li><li> Utilizzando gli stessi materiali, il bracciale PV varia con il peso del topo donatore. In particolare, per i topi 24-27 grammi la dimensione del bracciale è di 22-gauge, 0,7 mm di lunghezza con una estensione 0,7 mm. Per i topi peso 27-32 grammi, gli studi hanno utilizzato un 20-calibro catetere che è di 0,7 mm di lunghezza con una estensione 0,7 mm. </li><li> I polsini sono inseriti nelle estremità distali delle, PA PV e Br e fissata con una sutura 9-0. </li><li> Il polmone del donatore viene svuotata e lavata con soluzione salina sterile con eparina sterile prima di riporlo. Il polmone donatore viene quindi avvolto con garza sterile imbevuta in soluzione salina sterile su ghiaccio (4 ° C), che mantiene il polmone molto pulito e sterile. </li><li> Un morsetto microvasi è posto sulla bronco per impedire l&#39;entrata Ringer lattato nelle vie aeree. </li></ol> 2. Destinatario Procedura <ol><li> Induzione di anesdell&#39;anestesia e ventilazione meccanica sono gli stessi descritti sopra per il donatore. </li><li> La parete toracica sinistra è rasata e preparata con il 70% di alcol e il campo operatorio è drappeggiato. </li><li> Una incisione toracotomia è fatto a sinistra terzo spazio intercostale, estendendo l&#39;incisione dorsalmente vicino alla colonna vertebrale, e un morsetto microvasi posto sui vasi polmonari sinistra e dei bronchi adiacenti al cuore. Potete vedere PA all&#39;aspetto cranica, PV alla fine caudale ilo e Fr. tra di loro. </li><li> Utilizzando una leggera trazione sul pinza emostatica per provocare una leggera tensione sul, PA Br e PV, il polmone sinistro è tirato fuori dalla cavità toracica, lasciando le strutture ilari centrali bloccato. </li><li> L&#39;, PA e PV Br sono isolati per via smussa seguito mettendo una sutura 9-0 posizionato liberamente in tutto il, PA e PV fr. </li><li> Dopo la dissezione della PA completamente dalla sua guaina avventizia, una piccola incisione trasversale di circa un quarto della circonferenza della nave èfatta nella parete anteriore, lasciando la continuazione della parte dorsale dell&#39;arteria intatto. </li><li> Il polmone donatore, avvolto in freddo, Ringer lattato-impregnato garza di cotone e preparate come sopra descritto, è quindi posizionato nella cavità toracica, e polsini inserito nel PA ricevente, PV e Br e fissato con 9-0 sutura. </li><li> Il morsetto a croce ilo viene rimosso consentendo riperfusione e ventilazione. </li><li> Dopo aver posizionato il polmone trapiantato nuovamente nel torace destinatario, l&#39;incisione toracotomia è chiuso con un 5-0 sutura. </li><li> Il topo è consentito di recuperare da anestesia. Buprenorfina (0,05-0,15 mg / kg) è somministrato immediatamente dopo l&#39;intervento chirurgico, e per ogni 8 ore per 2-3 giorni post-operatorie. </li></ol> 3. Risultati rappresentativi La nostra esperienza ci ha insegnato che richiede diversi mesi di pratica ripetuta per diventare esperti nel modello di topo trapianto di polmone. Dopo di abilità è raggiunto, abbiamo unchieved un tasso del 96% (96/100 interventi consecutivi) la sopravvivenza perioperatoria con decessi che si verificano entro sette giorni dopo l&#39;intervento. Due morti erano dovute a sanguinamento durante l&#39;intervento che ha avuto inizio, e pneumothraces sono stati la causa di morte negli altri due topi. Per tutte le procedure, il tempo di ischemia calda era 14,32 ± 3,14 minuti, tempo di ischemia fredda era 58,51 ± 18.06 minuti. Tre ortotopici gruppi di trapianto di polmone sono stati studiati: isograft: C57BL / 6 → C57BL / 6, trapianto: C57BL/10 → C57BL / 6 e C57BL / 6 → C57BL/10. Abbiamo usato solo i topi maschi, ma la nostra tecnica può essere applicato anche a topi di sesso femminile, perché non vi è alcuna significativa differenza anatomica tra i sessi. La classificazione di rigetto patologia è stata condotta in cieco utilizzando criteri standard per polmone clinica trapianto 7 (Tabella 1). Mentre abbiamo osservato il rigetto lieve o assente in isograft (C57BL / 6 → C57BL / 6), entrambe le combinazioni trapianto allogenico sviluppato aziendeconfrontabili rigetto acuto o cronico (Figura 1). Al contrario, OB era significativamente più frequente nel C57BL/10 → C57BL / 6 di C57BL / 6 → C57BL/10 gruppo di day28 (Tabella 1). <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> C57BL / 6 → C57BL / 6 </td><td> C57BL/10 → C57BL / 6 </td><td> C57BL / 6 → C57BL/10 </td><td> P-value </td></tr><tr><td> Rifiuto Patologia &quot;A&quot; punteggi a giorno 28 </td><td> 0,67 ± 0,89 </td><td> * 3,33 ± 0,82 </td><td> * 3,29 ± 0,76 </td><td> * P&gt; 0.05 </td></tr><tr><td> OB / mice totali al giorno 21 e 28 </td><td> 0/24 (0%) </td><td> ** 14/34 (42,1%) </td><td> ** 2/16 (12,5%) </td><td> ** P &lt;0,05 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Punteggi istologiche di rigetto acuto e la prevalenza di trapianto dopo la bronchiolite obliterante. Scoring di rigetto acuto (&quot;a&quot; Scores) dalla norma CRIteri, come descritto nei risultati rappresentativi. I dati rappresenta la media ± SD di &quot;A&quot; punteggi a 28 giorni post-trapianto. I dati rappresenta la quantità e la percentuale di topi in ciascun gruppo che sviluppate OB giorni 21 e 28 trapianto. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3947/3947fig1.jpg" /> Figura 1. Reperti macroscopici e istopatologici a 28 giorni dopo il trapianto di polmone. Pannello di 1A rappresentano risultati macroscopici e H &amp; E polmonari Isograft macchiato del polmone destro e ingenuo. Pannello 1B e 1C rappresenta H &amp; E e di Masson tricromica tinto BL/10 trapianto del polmone trapiantato nel ricevente del mouse BL / 6, che ha sviluppato OB OB e non, rispettivamente. La freccia bianca in 1B individua lesioni OB. 1D pannello mostra polmonare BL / 6 trapiantato trapiantato nel ricevente BL/10 mouse. Guasti principale durante la procedura era la seguente. <ol><li> Disturbi del flusso sanguigno: polmone del donatore fino Flushil colore diventa di colore bianco. L&#39;uso di una pressione eccessiva può indurre edema polmonare. Ma non spingere troppo per evitare che l&#39;edema dopo il trapianto. </li><li> Difficoltà di inserimento nella cuffia del donatore: Accertarsi che la vascolarizzazione è sufficientemente lungo e privo di allegati tessuto adiposo e connettivo. </li><li> Sanguinamento al sito di anastomosi: Usa suggerimenti Q per esercitare una pressione al sito in questione per circa 5 minuti. </li><li> Destinatario ostruzione del flusso di sangue PA: principalmente causata dalla torsione del polso durante l&#39;inserimento. Se l&#39;aria si osserva all&#39;interno della PA poi ri-do della anastomosi è necessario. </li><li> Difficile anastomosi PV: membrana del fotovoltaico è molto sottile e facilmente lacrime. Selezionare corretta dimensione del bracciale ed inserire direttamente PV del destinatario molto delicatamente. </li><li> Destinatario ostruzione del flusso di sangue PV: Assicurarsi che la posizione e la direzione della cuffia. Rilasciare la compressione dal bracciale bronchiale. </li><li> Pneumotorace: Ciò può essere causato da una perforazione bronchiale a causa manipulation delle vie aeree, o perforazione della superficie del polmone a causa di trauma associato con la procedura di trapianto. Il primo è trattata con chiusura chirurgica del foro all&#39;interno della parete delle vie aeree, e quest&#39;ultimo è trattata oversewing la perdita sulla superficie polmonare utilizzando 10-0 sutura di nylon. </li></ol>

<ol>
	<li>Asimacopoulos, P. J., Molokhia, F. A., Pegg, C. A., Norman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+transplantation+in+the+rat.">Lung transplantation in the rat.</a> Transplant Proc. 3, 583-585 (1971).</li><li>Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+technique+of+experimental+lung+transplantation+in+rabbits.">Surgical technique of experimental lung transplantation in rabbits.</a> Ann. Thorac. Cardiovasc. Surg. 11, 7-11 (2005).</li><li>McDyer, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+murine+obliterative+bronchiolitis+in+transplant.">Human and murine obliterative bronchiolitis in transplant.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 4, 37-43 (2007).</li><li>Sato, M., Keshavjee, S., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+research:+animal+models+of+obliterative+bronchiolitis+after+lung+transplantation.">Translational research: animal models of obliterative bronchiolitis after lung transplantation.</a> Am. J. Transplant. 9, 1981-1987 (2009).</li><li>Okazaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+orthotopic+vascularized+aerated+lung+transplantation.">A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation.</a> Am. J. Transplant. 7, 1672-1679 (2007).</li><li>Fan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+IL-17+Prevents+Obliterative+Bronchiolitis+in+Murine+Orthotopic+Lung+Transplantation.">Neutralizing IL-17 Prevents Obliterative Bronchiolitis in Murine Orthotopic Lung Transplantation.</a> Am. J. Transplant. 11, 911-922 (2011).</li><li>Stewart, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revision+of+the+1996+working+formulation+for+the+standardization+of+nomenclature+in+the+diagnosis+of+lung+rejection.">Revision of the 1996 working formulation for the standardization of nomenclature in the diagnosis of lung rejection.</a> J. Heart Lung Transplant. 26, 1229-1242 (2007).</li><li>Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+rat+lung+transplantation+using+a+cuff+technique.">Simplified rat lung transplantation using a cuff technique.</a> J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 97, 578-581 (1989).</li><li>Jungraithmayr, W. M., Korom, S., Hillinger, S., Weder, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+orthotopic,+single-lung+transplantation.">A mouse model of orthotopic, single-lung transplantation.</a> J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 137, 486-491 (2009).</li><li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+vascularized+right+lung+transplantation+in+the+mouse.">Orthotopic vascularized right lung transplantation in the mouse.</a> J. Thorac. Cardiovasc. Surg. , (2010).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Trapianto di polmone nei topi ortotopica è una sfida a causa di richieste di microchirurgia e la fragilità estrema dei tessuti. Introduzione della tecnica bracciale è consentito per l&#39;uso diffuso del trapianto polmone ortotopico in ratti 8. Questa divenne la base per lo sviluppo del modello ortotopica trapianto di polmone nei topi nel nostro laboratorio. Nei topi e ratti, a differenza dell&#39;uomo, il polmone sinistro contiene un solo lobo e costituisce solo il 25% della massa polmonare totale. Questo rende sinistra-singolo trapianto polmonare fattibile nel modello murino, senza la necessità di un sistema di supporto circolatorio. Le operazioni preliminari hanno rivelato che la ventilazione e la perfusione del polmone trapiantato era fortemente dipendente dalla dimensione del PV anastomosi. Specifico PV dimensioni del bracciale anastomotica sono stati utilizzati per abbinare dei donatori e dei destinatari come riportato 9. Inappropriato bracciale dimensionamento portato in entrambi i atelettasia del polmone trapiantato o deiscenza della Anast PVomosis. Okazaki et al ha riferito l&#39;uso combinato di legatura nave e il ritaglio del bronco 5. In questo studio si usa un clip da aneurisma per tutte le strutture ilari, che suggeriamo può abbreviare il tempo caldo ischemico. Una limitazione del trapianto ortotopico polmone sinistro nel modello murino è che gli animali destinatario può sopravvivere dopo alloimmune-mediata necrosi delle loro alloinnesti 5. Pertanto, gli studi di sopravvivenza non sono fattibili e la valutazione del trapianto dipende dall&#39;esame istologico del polmone trapiantato 10. Utilizzando questa tecnica, abbiamo sviluppato un modello preclinico bronchiolite obliterante nei topi. In particolare, il topo è C57BL/10 donatore e il ricevente è C57BL / 6. Questo suggerisce il ruolo di minore, e non maggiori, antigeni di istocompatibilità nella patogenesi della bronchiolite obliterante 6. Inoltre, abbiamo riportato neutralizzando IL-17 impedisce bronchiolite obliterante nel modello murino. Questa modalitàl rappresenta un nuovo strumento di ricerca per l&#39;esame del trapianto polmonare e il progresso dei trapianti polmonari clinici.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome dell&#39;apparecchiatura </td><td> Azienda </td><td> Catalogo numero </td></tr><tr><td> Zeiss OPMI 6SFC-1880 </td><td> Prescott Inc </td><td> PMZ014 </td></tr><tr><td> Harvard roditori Ventilatore </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 55-7058 </td></tr><tr><td> 20-gauge catetere IV </td><td> Terumo Medical Corporation </td><td> 100510D </td></tr><tr><td> 22-IV calibro catetere </td><td> Terumo Medical Corporation </td><td> 081015S </td></tr><tr><td> 24-gauge IV catetere </td><td> Terumo Medical Corporation </td><td> 100522A </td></tr><tr><td> 9/0 Meth Virgin Blue Silk </td><td> Ashaway Line &amp; Twine Mfg. CO </td><td> MBVS-90 </td></tr><tr><td> 10-0 Alcon sutura chirurgica </td><td> Alcon Laboratories, Inc </td><td> 8065-192101 </td></tr><tr><td> Black 5-0/18inches seta intrecciata </td><td> Henry Schein </td><td> M652630 </td></tr><tr><td> Sodio Eparina 1000 unità / ml </td><td> APP Pharmaceuticals </td><td> 407156 </td></tr><tr><td> Soluzione Betadine </td><td> Purdue prodotto </td><td> 67618-150 </td></tr><tr><td> Iniezione di Ringer lattato </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-7953-03 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Ceppo dei topi </td><td> Venditore </td><td> Età, peso </td><td> Di genere, commenti </td></tr><tr><td> C57BL/10 </td><td> Harlan Sprague-Dawley </td><td> 8-12 settimane, 25-30g </td><td> Maschio, donatori </td></tr><tr><td> C57BL / 6 </td><td> Harlan Sprague-Dawley </td><td> 8-12 settimane, 25-30g </td><td> Maschio, donatore o del ricevente </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Tabella di topi, specific reagenti e attrezzature.

development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation

Trapianto di polmone ortotopica nei ratti è stata riportata da Asimacopoulos e colleghi nel 1971 1. Attualmente, questo metodo è ben accettato e standardizzato non solo per lo studio delle allo-rigetto ma anche tra ceppi singenici per l&#39;esame di meccanismi di ischemia-riperfusione dopo trapianto. Anche se l&#39;applicazione del ratto e di altri modelli animali di grandi dimensioni 2 contribuito in modo significativo alla spiegazione di questi studi, la portata di tali indagini è limitata dalla scarsità di topi knockout e transgenici. A causa esistono terapie efficaci per la bronchiolite obliterante, la principale causa di morte nei pazienti sottoposti a trapianto del polmone, c&#39;è stata una ricerca intensiva per modelli pre-clinici che replicano bronchiolite obliterante. Il modello di trapianto della trachea è il più utilizzato e può riprodurre alcune delle caratteristiche istopatologiche di bronchiolite obliterante 3. Tuttavia, la mancanza di un vasculat intattaure senza alcun legame con vie aeree di conduzione del destinatario, e incompleti caratteristiche patologiche di bronchiolite obliterante limitano l&#39;utilità di questo modello 4. A differenza di trapianto di altri organi solidi, vascolarizzati trapianti di polmone di topo solo di recente sono stati riportati da Okazaki e colleghi per la prima volta nel 2007 5. Applicando i principi di base del trapianto di polmone del ratto, il nostro laboratorio ha avviato il modello di bronchiolite obliterante con minori histoincompatible antigene murino ortotopici single-sinistra trapianti di polmone che permette lo studio ulteriore immunopatogenesi bronchiolite obliterante 6.

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Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation

Bronchiolite obliterante è l&#39;ostacolo chiave per la sopravvivenza a lungo termine del trapianto di polmone e la mancanza di un robusto modello preclinico preclude l&#39;esame di immunopatogenesi bronchiolite obliterante. A differenza di altri trapianti di organi solidi, vascolarizzato del mouse trapianto di polmone solo di recente è stato sviluppato. Qui vi mostriamo il nostro modello sviluppato in modo indipendente bronchiolite obliterante dopo murino ortotopico single-trapianto di polmone.

Sviluppo di bronchiolite obliterante in un modello murino di trapianto polmonare ortotopico

Orthotopic lung transplantation in rats was first reported by Asimacopoulos and colleagues in 1971 1. Currently, this method is well accepted and ...

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