Name: development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation
Uploaded: 2012-07-10T12:00:00
Duration: 10 min 1 s
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Fuentes de financiación: este trabajo como apoyo de los Institutos Nacionales de Salud subvenciones HL067177 y HL096845 y P01AI084853 al Departamento de Bienestar Social

1. Donante de Procedimiento <ol><li> Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron utilizando una técnica estéril. No se administran antibióticos para el donante y los ratones receptores. </li><li> La inducción de la anestesia del ratón donante se inicia con isoflurano 5%. </li><li> El ratón está intubado orotraqueal con un catéter intravenoso de calibre 20 y luego colocado en un respirador de roedores, utilizando oxígeno al 100% a una tasa de 125 respiraciones por minuto y aproximadamente 0,5 ml de volumen corriente (2% de su peso corporal). </li><li> La anestesia se mantuvo con inhalado 1-2% de isoflurano. </li><li> El ratón donante se coloca en una posición supina, preparado con 70% de alcohol. </li><li> Laparosternotomy se realiza como una línea media combinada y la incisión transversal. </li><li> La heparina a 100 U / kg se inyecta en la vena cava inferior (VCI), desde justo por debajo del hígado. </li><li> El diafragma se corta a lo largo del enganche ventral costera hacia la columna vertebral, y la cavidad torácica, se expone mediante la reducción de ambos lados del pechopared para el cuello. </li><li> Después de una incisión en la vena cava inferior a nivel del diafragma, el apéndice auricular derecho está cortado y lavado de los pulmones con 2 ml de refrigeración (4 ° C) de lactato de Ringer inyección y 0,1 ml de heparina a través de una incisión transversal en la raíz de la arteria pulmonar ( PA) del tronco. </li><li> Detención de ventilación en los dos tercios de final de la espiración la inflación, el bloque corazón-pulmón se extirpa y se almacena en hielo (4 ° C). </li><li> El pulmón izquierdo del donante se prepara para el destinatario por la unión de los puños. El ligamento pulmonar se realiza una incisión hasta la vena pulmonar (VP). El hilo se lleva a cabo mediante la eliminación de esófago y la aorta. </li><li> Identificar la AP, que se encuentra en el aspecto más craneal del hilo, así como los bronquios adjuntos principales (Br). Diseccionar cuidadosamente la Autoridad Palestina de los bronquios. </li><li> Manguito PA está hecha de un calibre 24-intravenosa (IV) del catéter y se corta a 0,5 mm de longitud con una extensión de 0,7 mm. </li><li> Toda la superficie del manguito es entonces abrasión para facilitar anastomosismosis. </li><li> El manguito de los bronquios se deriva de un catéter de calibre 20-IV, y cortar en longitud de 1,0 mm con una extensión de 0,7 mm. </li><li> Utilizando los mismos materiales, el manguito PV varía con el peso del ratón donante. En concreto, para los ratones 24-27 gramos el tamaño del manguito es de calibre 22, 0,7 mm de longitud con una extensión de 0,7 mm. Para ratones pesan 27-32 gramos, los estudios utilizaron un catéter de calibre 20 que es de 0,7 mm de longitud con una extensión de 0,7 mm. </li><li> Los puños se insertan en los extremos distales de la AP, VP y Br y asegurado con una sutura 9-0. </li><li> El pulmón donante se vacía y se lavó con solución salina estéril con heparina estéril antes de su almacenamiento. El pulmón donante se envuelve con una gasa estéril empapada en solución salina estéril en hielo (4 ° C), que mantiene el pulmón muy limpio y estéril. </li><li> Una abrazadera de los microvasos se coloca en el bronquio para evitar la entrada de lactato de Ringer en las vías respiratorias. </li></ol> 2. Receptor Procedimiento <ol><li> La inducción de la anestesiaanestesia y la ventilación mecánica son los mismos como se ha descrito anteriormente para el donante. </li><li> La pared izquierda del pecho se afeita y prepara con el 70% de alcohol y el campo quirúrgico se cubrió. </li><li> Una toracotomía se hace en el espacio intercostal izquierdo tercero, extendiendo la incisión dorsalmente cerca de la columna vertebral, y una abrazadera microvasos colocado en los vasos pulmonares izquierdas y bronquios adyacentes al corazón. Usted puede ver PA en el aspecto del cráneo, la energía fotovoltaica en el extremo caudal del hilo y el hermano entre ellos. </li><li> Utilizando una tracción suave en la pinza hemostática para causar una tensión leve en el PA, el hermano y la fotovoltaica, el pulmón izquierdo se saca de la cavidad torácica, dejando las estructuras hiliares centrales sujeta. </li><li> El PA, PV y el hermano están aislados mediante disección roma seguido por la colocación de una sutura de 9-0 coloca libremente alrededor de la PA, PV y el hermano. </li><li> Después de la disección de la Autoridad Palestina por completo de su vaina adventicia, de una pequeña incisión transversal de aproximadamente un cuarto de la circunferencia de la nave eshecha en la pared anterior, dejando la continuación de la parte dorsal de la arteria intacta. </li><li> El pulmón donante, envuelto en una gasa fría, lactato de Ringer algodón empapada y preparado como se ha descrito anteriormente, se coloca entonces en la cavidad torácica, y puños insertado en el receptor PA, PV y Br y asegurado con 9-0 sutura. </li><li> El pinzamiento hiliar se elimina lo que permite la reperfusión y la ventilación. </li><li> Después de colocar el pulmón trasplantado de nuevo en el tórax receptor, la toracotomía se cierra con una sutura de 5-0. </li><li> El ratón se le permite recuperarse de la anestesia. La buprenorfina (0.05-0.15 mg / kg) se administra inmediatamente después de la cirugía, y por cada 8 horas durante 2-3 días después de la cirugía. </li></ol> 3. Los resultados representativos Nuestra experiencia nos ha enseñado que se requiere de varios meses de práctica repetida para alcanzar la competencia en el modelo murino de trasplante de pulmón. Después de aptitud se logra, que unLOGRADOS una tasa de 96% (96/100 cirugías consecutivas) la supervivencia perioperatoria con las muertes que ocurren dentro de siete días después de la operación. Dos muertes se debieron a hemorragias, que comenzó durante la operación, y pneumothraces fueron la causa de muerte en los otros dos ratones. Para todos los procedimientos, el tiempo de isquemia caliente fue de 14,32 ± 3,14 minutos, y el tiempo de isquemia fría fue de 58,51 ± 18,06 minutos. Tres grupos ortotópico de trasplante de pulmón fueron estudiadas: isoinjerto: C57BL / 6 → C57BL / 6, aloinjerto: C57BL/10 → C57BL / 6 y C57BL / 6 → C57BL/10. Se utilizó sólo los ratones machos pero nuestra técnica puede ser también aplicado a ratones hembra, porque no hay diferencia significativa anatómica entre los sexos. La clasificación de rechazo de la patología se realizó en forma ciega la utilización de criterios uniformes para el trasplante pulmonar clínica 7 (Tabla 1). Mientras que se observó el rechazo leve o no en el isoinjerto (C57BL / 6 → C57BL / 6), las dos combinaciones de aloinjertos desarrolló compañíasel rechazo comparable aguda o crónica (Figura 1). Por el contrario, OB fue significativamente más frecuente en el C57BL/10 → C57BL / 6 que C57BL / 6 → C57BL/10 grupo por day28 (Tabla 1). <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> C57BL / 6 → C57BL / 6 </td><td> C57BL/10 → C57BL / 6 </td><td> C57BL / 6 → C57BL/10 </td><td> P-valor </td></tr><tr><td> Rechazo de Patología &quot;A&quot; Resultados en el día 28 </td><td> 0,67 ± 0,89 </td><td> * 3,33 ± 0,82 </td><td> * 3,29 ± 0,76 </td><td> * P&gt; 0,05 </td></tr><tr><td> Ratones ob / totales en 21 y 28 días </td><td> 0/24 (0%) </td><td> ** 14/34 (42,1%) </td><td> ** 2/16 (12,5%) </td><td> ** P &lt;0,05 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Resultados histológicos de rechazo agudo del trasplante y la prevalencia de la bronquiolitis obliterante mensaje. Puntuación de rechazo agudo (&quot;A&quot; Resultados) por la norma crisisrios como se describe en los resultados representativos. Los datos representan la media ± desviación estándar de &quot;A&quot; Resultados en el trasplante de 28 días después. Los datos representan la cantidad y el porcentaje de ratones en cada grupo que se desarrollaron en el OB 21 y 28 días después del transplante. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3947/3947fig1.jpg" /> Figura 1. Los hallazgos macroscópicos y la histopatología en 28 días después de trasplante de pulmón. Grupo 1A representan hallazgos macroscópicos y H &amp; E de pulmón y de pulmón isoinjerto manchada ingenuo derecha. Grupo 1B y 1C representa H &amp; E y tricrómico de Masson manchada BL/10 injerto de pulmón trasplantado en receptor del ratón BL / 6, que se desarrolló OB OB y ​​no, respectivamente. La flecha blanca en 1B identifica las lesiones de OB. Grupo 1D muestra aloinjerto BL / 6 de pulmón trasplantado en receptor del ratón BL/10. Averías principal durante el procedimiento fueron como sigue. <ol><li> Desorden de la sangre de flujo: de pulmón de donantes descarga hastael color se vuelve de color blanco. El uso de una presión excesiva podría inducir edema pulmonar. Sin embargo, no empujar demasiado para evitar el edema después del trasplante. </li><li> La dificultad de inserción del manguito en el donante: Cerciorarse de que la vasculatura es de una longitud suficiente y libre de grasa y los tejidos adjuntos conectivo. </li><li> Sangrado en el sitio de la anastomosis: Utilice Q consejos para aplicar presión a la zona afectada durante unos 5 minutos. </li><li> Receptor de la sangre PA obstrucción del flujo: Principalmente causado por una torsión de la banda durante la inserción. Si el aire se observa dentro de la Autoridad Palestina a continuación, volver a hacer de la anastomosis es necesario. </li><li> Difícil anastomosis PV: Membrana de la energía fotovoltaica es muy delgada y las lágrimas con facilidad. Seleccione el tamaño del manguito adecuado e insertar directamente al PV del receptor con mucha suavidad. </li><li> Receptor de la sangre PV obstrucción del flujo: Asegúrese de que la posición y dirección de la banda. Soltar la compresión del manguito bronquial. </li><li> Neumotórax: Esto puede ser causado por cualquiera de perforación bronquial debido a la manipulation de la vía aérea, o la perforación de la superficie del pulmón debido a un trauma asociado con el procedimiento de trasplante. El primero se trata con el cierre quirúrgico del agujero en la pared las vías respiratorias, y este último es tratado por sobrecosido la fuga en la superficie del pulmón utilizando 10-0 sutura de nylon. </li></ol>

<ol>
	<li>Asimacopoulos, P. J., Molokhia, F. A., Pegg, C. A., Norman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+transplantation+in+the+rat.">Lung transplantation in the rat.</a> Transplant Proc. 3, 583-585 (1971).</li><li>Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+technique+of+experimental+lung+transplantation+in+rabbits.">Surgical technique of experimental lung transplantation in rabbits.</a> Ann. Thorac. Cardiovasc. Surg. 11, 7-11 (2005).</li><li>McDyer, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+murine+obliterative+bronchiolitis+in+transplant.">Human and murine obliterative bronchiolitis in transplant.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 4, 37-43 (2007).</li><li>Sato, M., Keshavjee, S., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+research:+animal+models+of+obliterative+bronchiolitis+after+lung+transplantation.">Translational research: animal models of obliterative bronchiolitis after lung transplantation.</a> Am. J. Transplant. 9, 1981-1987 (2009).</li><li>Okazaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+orthotopic+vascularized+aerated+lung+transplantation.">A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation.</a> Am. J. Transplant. 7, 1672-1679 (2007).</li><li>Fan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+IL-17+Prevents+Obliterative+Bronchiolitis+in+Murine+Orthotopic+Lung+Transplantation.">Neutralizing IL-17 Prevents Obliterative Bronchiolitis in Murine Orthotopic Lung Transplantation.</a> Am. J. Transplant. 11, 911-922 (2011).</li><li>Stewart, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revision+of+the+1996+working+formulation+for+the+standardization+of+nomenclature+in+the+diagnosis+of+lung+rejection.">Revision of the 1996 working formulation for the standardization of nomenclature in the diagnosis of lung rejection.</a> J. Heart Lung Transplant. 26, 1229-1242 (2007).</li><li>Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+rat+lung+transplantation+using+a+cuff+technique.">Simplified rat lung transplantation using a cuff technique.</a> J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 97, 578-581 (1989).</li><li>Jungraithmayr, W. M., Korom, S., Hillinger, S., Weder, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+orthotopic,+single-lung+transplantation.">A mouse model of orthotopic, single-lung transplantation.</a> J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 137, 486-491 (2009).</li><li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+vascularized+right+lung+transplantation+in+the+mouse.">Orthotopic vascularized right lung transplantation in the mouse.</a> J. Thorac. Cardiovasc. Surg. , (2010).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El trasplante de pulmón ortotópico en ratones es un reto debido a las demandas de microcirugía y la extrema fragilidad de los tejidos. La introducción de la técnica del manguito ha permitido el uso generalizado del trasplante de pulmón en ratas ortotópico 8. Esto se convirtió en la base para el desarrollo del modelo ortotópico de trasplante de pulmón en ratones en el laboratorio. En ratones y ratas, a diferencia de los seres humanos, el pulmón izquierdo contiene sólo un lóbulo y representa sólo 25% de la masa total del pulmón. Esto hace izquierdo único trasplante de pulmón factible en el modelo murino sin la necesidad de un sistema de apoyo circulatorio. Nuestros cirugías preliminares reveló que la ventilación y la perfusión del pulmón trasplantado era altamente dependiente del tamaño de PV anastomosis. Específica PV tamaño del manguito anastomótica se utilizaron para que coincida con los donantes y los receptores como se informó 9. Inapropiado del manguito de tamaño dado lugar a la atelectasia del pulmón trasplantado o dehiscencia de la Anast PVomosis. Okazaki et al informaron de la utilización de ligadura de los vasos combinado y el recorte del bronquio 5. En el presente estudio se utiliza un clip de aneurisma de todas las estructuras hiliares, lo que le sugerimos puede acortar el tiempo de isquemia caliente. Una limitación del trasplante de pulmón ortotópico izquierdo en el modelo murino es que los animales receptores puede sobrevivir después de aloinmune mediada por la necrosis de los aloinjertos 5. Por lo tanto, los estudios de supervivencia no son viables y la evaluación del injerto depende de un examen histológico del pulmón trasplantado 10. Usando esta técnica, hemos desarrollado un modelo preclínico de bronquiolitis obliterante en los ratones. Específicamente, el ratón donante es C57BL/10 y el destinatario es C57BL / 6. Esto sugiere el papel de menor importancia, y no los antígenos de histocompatibilidad más importantes, en la patogenia de la bronquiolitis obliterante 6. Además, nos han informado de la neutralización de IL-17 previene la bronquiolitis obliterante en el modelo murino. Este modol representa una nueva herramienta de investigación para el examen de un trasplante de pulmón y el progreso de los trasplantes de pulmón clínicos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del equipo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo número </td></tr><tr><td> Zeiss OPMI 6SFC-1880 </td><td> Prescott Inc </td><td> PMZ014 </td></tr><tr><td> Ventilador de Harvard de roedores </td><td> Aparato de Harvard </td><td> 55-7058 </td></tr><tr><td> 20-IV calibre catéter </td><td> Terumo Medical Corporation </td><td> 100510D </td></tr><tr><td> 22-IV calibre catéter </td><td> Terumo Medical Corporation </td><td> 081015S </td></tr><tr><td> 24-IV calibre catéter </td><td> Terumo Medical Corporation </td><td> 100522A </td></tr><tr><td> 9/0 Meth Virgin Blue Silk </td><td> Ashaway de línea y Cordeles Mfg CO </td><td> MBVS-90 </td></tr><tr><td> 10-0 Alcon sutura quirúrgica </td><td> Alcon Laboratories, Inc. </td><td> 8065-192101 </td></tr><tr><td> Black 5-0/18inches seda trenzada </td><td> Henry Schein </td><td> M652630 </td></tr><tr><td> Heparina sódica 1000 unidades / ml </td><td> APP Pharmaceuticals </td><td> 407156 </td></tr><tr><td> Betadine Solución </td><td> Purdue producto </td><td> 67618-150 </td></tr><tr><td> La inyección de Ringer lactato </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-7953-03 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Cepa de los ratones </td><td> Vendedor </td><td> La edad, el peso </td><td> Género, Comentarios </td></tr><tr><td> C57BL/10 </td><td> Harlan Sprague-Dawley </td><td> 8-12 semanas, 25-30g </td><td> Donante masculino, </td></tr><tr><td> C57BL / 6 </td><td> Harlan Sprague-Dawley </td><td> 8-12 semanas, 25-30g </td><td> Hombre, donante o del receptor </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Tabla de los ratones, específiIC reactivos y equipos.

development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation

El trasplante de pulmón ortotópico en ratas fue reportada primero por Asimacopoulos y colegas en 1971 1. Actualmente, este método es bien aceptado y normalizado no sólo para el estudio de alo-rechazo, sino también entre cepas singénicos para examinar los mecanismos de lesión por isquemia-reperfusión después de un trasplante de pulmón. Aunque la aplicación de la rata y el otro modelo animal de gran tamaño 2 contribuido de manera significativa al esclarecimiento de estos estudios, el alcance de las investigaciones está limitado por la escasez de octavos de final y las ratas transgénicas. Dado que no hay terapias efectivas para la bronquiolitis obliterante, la principal causa de muerte en pacientes de trasplante de pulmón, se ha producido una intensa búsqueda de modelos pre-clínicos que reproducen la bronquiolitis obliterante. El modelo de aloinjerto traqueal es el más ampliamente utilizado y puede reproducir algunas de las características histopatológicas de la bronquiolitis obliterante 3. Sin embargo, la falta de un vasculat intactoUre sin conexión con vías de conducción del destinatario, e incompleto características patológicas de la bronquiolitis obliterante limita la utilidad de este modelo de 4. A diferencia del trasplante de otros órganos sólidos, los trasplantes de pulmón de ratón vascularizados sólo recientemente han sido reportados por Okazaki y sus colegas, por primera vez en 2007 5. La aplicación de los principios básicos del trasplante de pulmón de rata, nuestro laboratorio inició el modelo de bronquiolitis obliterante con menores histoincompatibles antígeno murino ortotópico de una sola izquierda trasplantes de pulmón que permite el estudio adicional de inmunopatogénesis bronquiolitis obliterante 6.

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Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation

Bronquiolitis obliterante es el principal obstáculo para la supervivencia a largo plazo de los receptores de trasplante de pulmón y la falta de un modelo preclínico robusta impide el examen de inmunopatogénesis bronquiolitis obliterante. A diferencia de otros trasplantes de órganos sólidos, el trasplante de pulmón de ratón vascularizado sólo recientemente ha sido desarrollado. Aquí mostramos nuestro modelo desarrollado de manera independiente después de la bronquiolitis obliterante murino ortotópico de un solo trasplante de pulmón.

El desarrollo de bronquiolitis obliterante en un modelo murino de trasplante de pulmón ortotópico

Orthotopic lung transplantation in rats was first reported by Asimacopoulos and colleagues in 1971 1. Currently, this method is well accepted and ...

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