Name: oct4gip reporter assay to study genes that regulate mouse embryonic stem cell maintenance and self-renewal
Uploaded: 2012-05-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal at JoVE.com

Nous tenons à remercier Brad Lackford pour la lecture et la relecture du manuscrit. Cette recherche a été financée par l&#39;Institut national de l&#39;environnement Sciences de la santé, les National Institutes of Health Research Programme intra-muros Z01ES102745 (à GH).

1. Oct4GiP souris maintien des cellules ES Cellules Oct4GiP ont été aimablement fournies par le Dr Austin Smith. Elles ont été calculées à partir des souris portant un transgène 129/Ola Oct4-GFPiresPac 4,5. Ils sont maintenus dans de la gélatine recouvertes de plaques de culture tissulaire dans le ESGRO qualité moyenne, plus complet clonale (Millipore), ou dans le milieu M15: DMEM (Invitrogen) supplémenté avec 15% de FBS, 1000 U / ml ESGRO (Millipore), 1x non- acides amin...

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	<li>Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+differentiation:+emergence+of+a+new+era+in+biology+and+medicine.">Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine.</a> Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).</li><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations:+lessons+from+embryonic+development.">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132, 661-680 (2008).</li><li>Hu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+a+new+transcriptional+module+required+for+self-renewal.">A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal.</a> Genes Dev. 23, 837-848 (2009).</li><li>Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+expression+of+Oct-3/4+defines+differentiation,+dedifferentiation+or+self-renewal+of+ES+cells.">Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells.</a> Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).</li><li>Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+RNAi+screen+for+Oct4+modulators+defines+a+role+of+the+Paf1+complex+for+embryonic+stem+cell+identity.">A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity.</a> Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).</li><li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+cloning+of+Nanog,+a+pluripotency+sustaining+factor+in+embryonic+stem+cells.">Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells.</a> Cell. 113, 643-655 (2003).</li><li>Masui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+governed+by+Sox2+via+regulation+of+Oct3/4+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).</li><li>Mitsui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeoprotein+Nanog+is+required+for+maintenance+of+pluripotency+in+mouse+epiblast+and+ES+cells.">The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells.</a> Cell. 113, 631-642 (2003).</li><li>Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNAi+screen+of+chromatin+proteins+identifies+Tip60-p400+as+a+regulator+of+embryonic+stem+cell+identity.">An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity.</a> Cell. 134, 162-174 (2008).</li><li>Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+embryonic+stem+(ES)+cells+in+media+supplemented+with+recombinant+leukemia+inhibitory+factor.">Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor.</a> 141, 344-352 (1990).</li><li>Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+embryonic+stem+cell+state.">Control of the embryonic stem cell state.</a> Cell. 144, 940-954 (2011).</li><li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development.">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450, 1230-1234 (2007).</li><li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution.">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li><li>Rodda, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+nanog+by+OCT4+and+SOX2.">Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2.</a> J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).</li><li>Schaniel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+short+hairpin+RNAs--triggers+of+gene+silencing--into+mouse+embryonic+stem+cells.">Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).</li><li>Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+subpopulations+in+undifferentiated+ES+cell+culture.">Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture.</a> Development. 135, 909-918 (2008).</li></ol>

Le dosage journaliste Oct4GiP nous décrivons ci-dessus peut mesurer quantitativement l&#39;étendue de l&#39;auto-renouvellement vs différenciation. Comparé à d&#39;autres méthodes disponibles, tels que les 12 morphologie basée et la prolifération / viabilité à base de tests, il offre une sensibilité plus élevée et le débit, ainsi que d&#39;une mesure plus directe de l&#39;état de la cellule ES. Il est donc bien adapté pour les grands écrans et des analyses épistasie génétique. En effet, no...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Moyennes ESGRO année complète, ainsi que des clones </td><td> Millipore </td><td> SF001-500P </td></tr><tr><td> DMEM (glucose à haute 1X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> 0,25% de trypsine-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 1001817 </td></tr><tr><td> OPTI-MEM (milieu sans sérum à réduire) </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td></tr><tr><td> ESGRO MLIF (10 units/1ml 7) </td><td> Millipore </td><td> DAM1776540 </td></tr><tr><td> MEM NEAA (non-acides aminés essentiels) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> Nucléosides 100x pour les cellules souches embryonnaires </td><td> Millipore </td><td> 10620-1 </td&gt; </tr><tr><td> Le 2-mercaptoéthanol </td><td> Sigma </td><td> M7522-100ml </td></tr><tr><td> ES-qualifiée sérum de veau fœtal </td><td> Invitrogen </td><td> 10437 </td></tr><tr><td> SiARN Nanog </td><td> Invitrogen </td><td> MSS231181 </td></tr><tr><td> Oct4 siARN </td><td> Dharmacon </td><td> D-046256-02 </td></tr><tr><td> SiARN Sox2 </td><td> Dharmacon </td><td> M-058489-01 </td></tr></tbody></table> SiARN contrôle: duplex siRNA ciblant la luciférase de luciole (5&#39;-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthétisée par Dharamcon.

oct4gip reporter assay to study genes that regulate mouse embryonic stem cell maintenance and self-renewal

Pluripotence et l&#39;auto-renouvellement sont deux caractéristiques qui définissent les cellules souches embryonnaires (cellules ES). Comprendre le mécanisme moléculaire sous-jacent va grandement faciliter l&#39;utilisation de cellules souches embryonnaires pour des études de biologie du développement, la modélisation des maladies, la découverte de médicaments et la médecine régénératrice (examiné en 1,2). Pour accélérer l&#39;identification et la caractérisation de nouveaux régulateurs de l&#39;entretien des cellules ES et d&#39;auto-renouvellement, nous avons développé une fluorescence journaliste basé test pour mesurer quantitativement l&#39;état d&#39;auto-renouvellement des cellules ES de souris en utilisant les cellules Oct4GiP 3. Les cellules Oct4GiP exprimer la protéine fluorescente verte (GFP) sous le contrôle de la région promoteur du gène Oct4 4,5. Oct4 est nécessaire pour les cellules souches embryonnaires d&#39;auto-renouvellement, et est fortement exprimée dans les cellules ES et rapidement régulé à la baisse lors de la différenciation 6,7. En conséquence, expression de la GFP et de la fluorescence dans les cellules reporter fidèlement corréléeavec l&#39;identité des cellules ES 5, et le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) peut être utilisé pour suivre de près l&#39;état d&#39;auto-renouvellement des cellules au niveau unicellulaire 3,8. Couplé avec l&#39;ARNi, le dosage journaliste Oct4GiP peut être utilisé pour rapidement identifier et d&#39;étudier les régulateurs de l&#39;entretien des cellules ES et l&#39;auto-renouvellement 3,8. Comparé à d&#39;autres méthodes de dosage de l&#39;auto-renouvellement, il est plus commode, sensible, quantitative, et de moindre coût. Il peut être réalisé en 96 - ou 384 puits des plaques pour études à grande échelle tels que les écrans à haut débit ou d&#39;analyse épistasie génétique. Enfin, en utilisant d&#39;autres lignes spécifiques de lignée de cellules ES Reporter, le dosage que nous décrivons ici peuvent également être modifiées pour étudier les spécifications sort lors de la différenciation des cellules ES.

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Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Nous décrivons un test de fluorescence journaliste d&#39;identifier rapidement et de caractériser les gènes qui régulent la souris de maintenance de cellules souches embryonnaires et l&#39;auto-renouvellement.

Essai Reporter Oct4GiP d&#39;étudier les gènes qui régulent la souris maintenance des cellules souches embryonnaires et l&#39;auto-renouvellement

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...

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