Name: oct4gip reporter assay to study genes that regulate mouse embryonic stem cell maintenance and self-renewal
Uploaded: 2012-05-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal at JoVE.com

우리는 읽고 원고를 편집 브래드 Lackford 감사드립니다. 이 연구는 환경 건강 과학, 건강 교내 연구 프로그램 Z01ES102745 국립 연구소 (GH까지)의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

1. Oct4GiP 마우스 ES 세포 유지 보수 Oct4GiP 전지는 친절 박사 오스틴 스미스에 의해 제공되었다. 그들은 Oct4-GFPiresPac transgene 4,5 들고 129/Ola 마우스에서 파생되었다. 그들은 ESGRO 전체 더하기 clonal 학년 중간 (Millipore), 또는 M15 매체의 젤라틴 코팅 조직 배양 플레이트에 유지됩니다 DMEM (Invitrogen)은 15% FBS, 1000 U / ML ESGRO (Millipore), 1X 비로 보충 필수 아미노산 (Invitrogen), 1X EmbryoMax...

<ol>
	<li>Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+differentiation:+emergence+of+a+new+era+in+biology+and+medicine.">Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine.</a> Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).</li><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations:+lessons+from+embryonic+development.">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132, 661-680 (2008).</li><li>Hu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+a+new+transcriptional+module+required+for+self-renewal.">A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal.</a> Genes Dev. 23, 837-848 (2009).</li><li>Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+potency+by+spontaneous+fusion.">Changing potency by spontaneous fusion.</a> Nature. 416, 545-548 (2002).</li><li>Ying, Q. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation.">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li><li>Nichols, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+pluripotent+stem+cells+in+the+mammalian+embryo+depends+on+the+POU+transcription+factor+Oct4.">Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4.</a> Cell. 95, 379-391 (1998).</li><li>Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+expression+of+Oct-3/4+defines+differentiation,+dedifferentiation+or+self-renewal+of+ES+cells.">Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells.</a> Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).</li><li>Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+RNAi+screen+for+Oct4+modulators+defines+a+role+of+the+Paf1+complex+for+embryonic+stem+cell+identity.">A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity.</a> Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).</li><li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+cloning+of+Nanog,+a+pluripotency+sustaining+factor+in+embryonic+stem+cells.">Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells.</a> Cell. 113, 643-655 (2003).</li><li>Masui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+governed+by+Sox2+via+regulation+of+Oct3/4+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).</li><li>Mitsui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeoprotein+Nanog+is+required+for+maintenance+of+pluripotency+in+mouse+epiblast+and+ES+cells.">The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells.</a> Cell. 113, 631-642 (2003).</li><li>Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNAi+screen+of+chromatin+proteins+identifies+Tip60-p400+as+a+regulator+of+embryonic+stem+cell+identity.">An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity.</a> Cell. 134, 162-174 (2008).</li><li>Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+embryonic+stem+(ES)+cells+in+media+supplemented+with+recombinant+leukemia+inhibitory+factor.">Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor.</a> 141, 344-352 (1990).</li><li>Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+embryonic+stem+cell+state.">Control of the embryonic stem cell state.</a> Cell. 144, 940-954 (2011).</li><li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development.">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450, 1230-1234 (2007).</li><li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution.">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li><li>Rodda, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+nanog+by+OCT4+and+SOX2.">Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2.</a> J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).</li><li>Schaniel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+short+hairpin+RNAs--triggers+of+gene+silencing--into+mouse+embryonic+stem+cells.">Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).</li><li>Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+subpopulations+in+undifferentiated+ES+cell+culture.">Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture.</a> Development. 135, 909-918 (2008).</li></ol>

우리가 위에서 설명 Oct4GiP 기자 분석은 정량적 자기 갱신 대 분화의 정도를 측정할 수 있습니다. 이러한 형태학 기반의 12 확산 / assays 생존 기반과 같은 다른 가능한 방법, 비교, 그것은 높은 감도 및 처리량뿐만 아니라 ES 세포 상태의 더 직접적인 측정을 제공합니다. 그것은 따라서 잘 대형 스크린 및 유전자 epistasis 분석에 적합합니다. 실제로, 우리는 다른 사람이 성공적으로 게놈 전체의...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> ESGRO 완전한 플러스 clonal 등급 매체 </td><td> Millipore </td><td> SF001-500P </td></tr><tr><td> DMEM (높은 포도당 1X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11,965 </td></tr><tr><td> 0.25 % 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Invitrogen </td><td> 25,200 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 1,001,817 </td></tr><tr><td> OPTI-MEM (혈청 매체를 줄이기) </td><td> Invitrogen </td><td> 31,985 </td></tr><tr><td> ESGRO mLIF (10 7 units/1ml) </td><td> Millipore </td><td> DAM1776540 </td></tr><tr><td> MEM NEAA (비 필수 아미노산) </td><td> Invitrogen </td><td> 11,140 </td></tr><tr><td> ES 세포에 대한 100x Nucleosides </td><td> Millipore </td><td> 10620-1 </td&gt; </tr><tr><td> 2 - 메르 캅 토 에탄올 </td><td> 시그마 </td><td> M7522-100ml </td></tr><tr><td> ES-자격 태아 소 혈청 </td><td> Invitrogen </td><td> 10,437 </td></tr><tr><td> Nanog의 siRNA </td><td> Invitrogen </td><td> MSS231181 </td></tr><tr><td> Oct4 siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> D-046256-02 </td></tr><tr><td> Sox2의 siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> M-058489-01 </td></tr></tbody></table> 제어 siRNA : Dharamcon에 의해 합성 반딧불 루시페라제을 (5&#39;-CGTACGCGGAATACTTCGA) 대상으로 s​​iRNA의 이중.

oct4gip reporter assay to study genes that regulate mouse embryonic stem cell maintenance and self-renewal

Pluripotency과 자기 갱신은 배아 줄기 세포의 두 정의 특성 (ES 세포)입니다. 기본적인 분자 메커니즘을 이해하는 것은 크게 발달 생물학 연구, 질병 모델링, 약물 발견 및 재생 의료 (1,2 년 검토)의 ES 세포의 사용을 촉진합니다. ES 세포 유지 및 자기 갱신의 소설 규제의 식별 및 특성을 신속하게하기 위해 우리는 양적 Oct4GiP 세포에게 3을 사용 마우스 ES 세포의 자기 갱신 상태를 측정하는 형광 리포터 기반의 분석을 개발했습니다. Oct4GiP 전지는 4,5 Oct4 유전자 프로 모터 영역의 통제하에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현. Oct4는 차별 6,7 중에 ES 세포 자기 갱신이 필요합니다, 그리고 고도의 ES 세포에 표현되며, 빠르게 아래쪽 규제. 그 결과, 기자 세포에서 GFP 발현과 형광 성실하게 상호ES 세포 정체성 5 및 형광 - 활성 셀 정렬과 (FACS) 분석 밀접하게 단세포 레벨 3,8에서 세포의 자기 갱신 상태를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. RNAi와 결합, Oct4GiP 기자 분석은 신속 ES 세포 유지 및 자기 갱신 3,8의 규제를 파악하고 공부하는 데 사용할 수 있습니다. 자기 갱신을 시금위한 다른 방법과 비교했을 때, 그것은 더 편리하고 민감한, 양적, 그리고 낮은 비용입니다. 이러한 높은 처리량 화면 또는 유전자 epistasis 분석과 같은 대규모 연구 또는 접시 384 - 잘 - 그것은 96에 실시 할 수 있습니다. 마지막으로, 다른 혈통 특정 기자의 ES 세포 라인을 사용하여, 우리가 여기서 설명하는 분석도 ES 세포 분화 동안 운명 사양을 공부하고 수정할 수 있습니다.

Watch this Scientific Journal Video about Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal at JoVE.com

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

우리는 신속하게 식별하고 마우스 배아 줄기 세포 유지 및 자기 갱신을 조절 유전자를 특성화하기 위해 형광 기자 분석을 설명합니다.

마우스 배아 줄기 세포 유지 보수 및 자체 갱신을 조절 유전자를 공부하는 Oct4GiP 리포터 분석

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Murine 배아 줄기 세포로부터 조혈 줄기 세포의 유도

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

연구

생물학

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Immunosurgery에 의해 인간 배아 줄기 세포의 유도

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

체외에서 인간 배아 줄기 세포의 생체내의 Bioluminescence 리포터 진 영상에

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

인간 배아 줄기 세포의 문화 및 유지 관리

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

난생의 부재에서 자기 갱신 mESC를 지원하기 위해 SC1 (Pluripotin)의 사용

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

절연 및 마우스 배아 새싹 세포의 유도

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

배아 림브 스킨 Vasculature에 대한 전체 마운트 Immunohistochemical 분석 : 엠브료에 혈관 분기 Morphogenesis를 공부하는 모델 시스템

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Cardiogenic 유도 효율을 Quantifying에 대한 수정 마우스 배아의 줄기 세포 기반 어세이

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...