Name: the &alpha;-test: rapid cell-free cd4 enumeration using whole saliva
Uploaded: 2012-05-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Î±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva at JoVE.com

Forskningen blev støttet af Harry Winston Research Foundation.

1. Forbered Friske Working Solutions <ol><li> TBS: 0,05 M Tris-pufret saltopløsning, pH 7,8 (TBS). Fremstille 60 ml TBS / mikrotiterplade. </li><li> PPE: porcin pancreatisk elastase, type 1 (PPE) er tilvejebragt som en suspension. Ryst godt og fortyndes PV i TBS til ca 0,01 U / ml. Fremstilling af 6 ml arbejdsopløsning / mikrotiterplade). </li><li> SA 3 NA: succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilid (SA 3 NA). Fremstille 0,1 M stamopløsning SA <...

<ol>
	<li>Friedlander, Y., Kark, J. D., Eisenberg, S., Stein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+LDL-cholesterol+from+total+cholesterol,+triglyceride+and+HDL-cholesterol:+a+comparison+of+methods+in+the+Jerusalem+Lipid+Research+Clinic+Prevalence+Study.">Calculation of LDL-cholesterol from total cholesterol, triglyceride and HDL-cholesterol: a comparison of methods in the Jerusalem Lipid Research Clinic Prevalence Study.</a> Isr. J. Med. Sci. 18, 1242-1252 (1982).</li><li>Lapidot, T., Petit, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+understanding+of+stem+cell+mobilization:+The+roles+of+chemokines,+proteolytic+enzymes,+adhesion+molecules,+cytokines,+and+stromal+cells.">Current understanding of stem cell mobilization: The roles of chemokines, proteolytic enzymes, adhesion molecules, cytokines, and stromal cells.</a> Exp. Hematol. 30, 973-981 (2002).</li><li>Bristow, C. L., Alfano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;1Antitrypsin+therapy+increases+CD4++lymphocytes+to+normal+values+in+HIV-1+patients.">&#945;1Antitrypsin therapy increases CD4+ lymphocytes to normal values in HIV-1 patients.</a> Soluble factors mediating innate immune responses to HIV infection. , (2010).</li><li>Bristow, C. L., Patel, H., Arnold, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self+antigen+prognostic+for+human+immunodeficiency+virus+disease+progression.">Self antigen prognostic for human immunodeficiency virus disease progression.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8, 937-942 (2001).</li><li>Bristow, C. L., Babayeva, M. A., LaBrunda, M., Mullen, M. P., Winston, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;1Proteinase+Inhibitor+regulates+CD4++lymphocyte+levels+and+is+rate+limiting+in+HIV-1+disease.">&#945;1Proteinase Inhibitor regulates CD4+ lymphocyte levels and is rate limiting in HIV-1 disease.</a> PLoS One. , (2011).</li><li>de Almeida, P. D. V., Gregio, A. M. T., Machado, M. A. N., de Lima, A. A. S., Azevedo, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva+Composition+and+Functions:+A+Comprehensive+Review.">Saliva Composition and Functions: A Comprehensive Review.</a> J. Contemp. Dent. Pract. 9, 72-80 (2008).</li><li>Edgar, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva:+its+secretion,+composition+and+funcitons.">Saliva: its secretion, composition and funcitons.</a> Br. Dent. J. , 172-305 (1992).</li><li>Bristow, C. L., Meo, F. d. i., Arnold, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+activity+of+&#945;1proteinase+inhibitor+and+++2macroglobulin+in+human+serum:+Application+to+insulin-dependent+diabetes+mellitus.">Specific activity of &#945;1proteinase inhibitor and 2macroglobulin in human serum: Application to insulin-dependent diabetes mellitus.</a> Clin. Immunol. Immunopathol. 89, 247-259 (1998).</li><li>Pederson, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+levels+of+&#945;2-macroglobulin,+&#945;1-antitrypsin,+C-reactive+protein,+cathepsin+G+and+elastase+in+humans+with+or+without+destructive+periodontal+disease.">Salivary levels of &#945;2-macroglobulin, &#945;1-antitrypsin, C-reactive protein, cathepsin G and elastase in humans with or without destructive periodontal disease.</a> Arch. Oral Biol. 40, 1151-1155 (1995).</li><li>Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+DNase+I+reduces+the+viscosity+of+cystic+fibrosis+sputum.">Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum.</a> PNAS. 87, 9188-9192 (1990).</li><li>LeVeque, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicenter,+randomized,+double-blind,+placebo-controlled,+dose-+titration+study+of+oral+pilocarpine+for+treatment+of+radiation-induced+xerostomia+in+head+and+neck+cancer+patients.">A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled, dose- titration study of oral pilocarpine for treatment of radiation-induced xerostomia in head and neck cancer patients.</a> J. Clin. Oncol. 11, 1124-1131 (1993).</li><li>Stevens, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+new+CD4+enumeration+technologies+for+resource-constrained+countries.">Evaluating new CD4 enumeration technologies for resource-constrained countries.</a> Nat. Rev. Microbiol. 6, S29-S38 (2008).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2010 ART guidelines for adults and adolescents - evidence map. , (2010).</li></ol>

Ufortyndet serum indeholder median 36 uM α en PI og 3,6 uM α 2-makroglobulin (α 2 M) en 10-fold forskel 8. Begge proteiner konkurrerer om binding til PV. Disse to egenskaber, koncentration og PV affinitet, er blevet udnyttet til at udvikle en fremgangsmåde, der er i stand til specifikt at måle α en PI i normalt serum i nærvær af konkurrerende α 2 M 8. Denne fremgangsmåde kan påvise så lidt som 50 nM μ 1-PI i 0,3% serum. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td></tr><tr><td> Sialagogum, 0,05 M citronsyre </td><td> EDA sukkerfrie slik, 4900 Bag N.20th Street, Philadelphia, PA 19144 </td><td> Sukker-Free Lemon dråber </td></tr><tr><td> Svinepankreas elastase, type 1 (EF 3.4.21.36) </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63.103 </td><td> E1250 </td></tr><tr><td> Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S4760 </td></tr><tr><td> Coomassie Brilliant Blue R-250 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B7920 </td></tr><tr><td> Vævskultur-behandlede, 96 brønds mikroplader </td><td> Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886 </td><td> 35-3072 </td></tr><tr><td> Microplate Reader med filtre til 405 nm og 595 nm </td><td> MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Wien, Virginia 22182 </td><td> Dynex P97277 </td></tr></tbody></table>

the &alpha;-test: rapid cell-free cd4 enumeration using whole saliva

Der er et presserende behov for en overkommelig pris CD4 tælling til at overvåge HIV-sygdom. CD4 tælling er uden for rækkevidde i ressource-begrænset områder på grund af den tid og temperatur begrænsninger, teknisk raffinement og omkostninger af reagenser, navnlig monoklonale antistoffer til at måle CD4 på blodceller, den eneste i øjeblikket acceptabel metode. En almindeligt anvendt omkostningsbesparende og tidsbesparende laboratorium strategi er at beregne, snarere end foranstaltninger visse blodværdier. For eksempel LDL-niveauer beregnes ved hjælp af målte niveauer af total cholesterol, HDL og triglycerider 1. Således identifikation af cellefrie korrelerer der direkte regulere antallet af CD4 + T-celler kan tilvejebringe en nøjagtig metode til beregning af CD4-tællinger på grund af fysiologiske relevans af korrelerer. Antallet af stamceller, der træder blod og er bestemt til at blive cirkulerende CD4 +-T-celler bestemmes ved chemokin CXCL12 ennd dets receptor CXCR4 på grund af deres indflydelse på bevægelse 2. Processen stamcelle bevægelse i blodet er yderligere reguleres ved celleoverfladen human leukocytelastase (HLE CS) og HLE CS-reaktive aktive α 1-proteinaseinhibitor (α en PI, α en antitrypsin, SerpinA1) 3. I HIV-1-sygdom, er α 1 PI inaktiveret skyldes sygdomsprocesser 4. I de tidlige asymptomatiske kategorier af HIV-1 sygdom, blev aktivt α en PI fundet at være under normal i 100% af ubehandlede HIV-1-patienter (median = 12 uM, og for at opnå normale niveauer i de symptomer kategori 4, 5. Denne mønster er blevet tilskrevet immun inaktivering, ikke tilstrækkelig syntese, proteolytisk inaktivering eller iltning. Vi observerede, at HIV-1 individer med&gt; 220 CD4 celler / ul blev CD4 tællinger korreleret med serumniveauer af aktiv α en PI (r2 = 0,93, p &amp;lt, 0,0001, n = 26) og inaktive α en PI (R2 = 0,91, p &lt;0,0001, n = 26) 5. Indgivelse af α 1-PI til HIV-1 inficerede og uinficerede individer resulterede i dramatiske stigninger i CD4 tællinger antyder α en PI deltager i reguleringen af antallet af CD4 + T-celler i blodet 3. Ved stimulering indeholder helspyt tilstrækkelig serøs væske (plasma indeholdende proteinholdigt materiale, som passerer gennem blodkarvægge i spyt) for at tillade måling af aktiv α 1-PI og korrelation af denne måling er bevis på, at det er en nøjagtig metode til beregning af CD4 tællinger. Kort fortalt sialogogues såsom tyggegummi eller citronsyre stimulere udsivning af serum i hele munden spyt. Efter stimulering serum exudat, er aktiviteten af serum α 1-PI i spyt målt ved dets evne til at inhibere elastase-aktivitet. Porcin pancreatisk elastase (PPE)er et let tilgængeligt billig kilde af elastase. PPE binder til α en PI danner en én-til-en kompleks, der forhindrer PV i spalte de specifikke substrater, hvoraf den ene er den kolorimetriske peptidet, succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilid (SA 3 NA). Inkubering spyt med en mættende koncentration af PV i 10 minutter ved stuetemperatur tillader binding af PV til alle aktive α en PI i spyt. Den resulterende inhibering af PV af aktiv α en PI kan måles ved at tilsætte PPE substratet SA 3 NA. (Figur 1). Selv CD4 tællinger målt i blodvolumen (CD4 celler / ul), er koncentrationen af α 1-PI i spyt relateret til koncentrationen af serum i spyt, ikke volumen spyt, idet mængden kan variere betydeligt i løbet af dagen og personen til person 6. Imidlertid næsten hele proteinet i spyt skyldes serum indhold, og proteinindholdet af spyt er MEAsurable 7. Således er aktiv α en PI spyt beregnet som et forhold til spyt proteinindhold og betegnes α en PI Index. Resultaterne præsenteret heri viser, at α en PI indeks tilvejebringer en nøjagtig og præcis fysiologisk metode til beregning af CD4 tællinger.

Watch this Scientific Journal Video about The Î±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva at JoVE.com

The &#945;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

En CD4 tælling metode, α-testen er beskrevet som anvender hele spyt for at tilvejebringe hurtige og nøjagtige CD4 tællinger. De α-test koster øre og eliminerer behovet for teknisk uddannelse, dyre reagenser, såsom monoklonale antistoffer, instrumentering, køleanlæg, transport af prøver samt indsamling og håndtering af blod.

Den α-test: Rapid Cellefri CD4 Optælling Anvendelse helspyt

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Research

JoVE Journal

Medicine

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&#946; using a Whole Blood Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

Hurtig Point-of-Care Assay af enoxaparin antikoagulerende effekt i fuldblod

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

Sampling Human Indigenous Saliva Peptidome Using a Lollipop-Like Ultrafiltration Probe: Simplify and Enhance Peptide Detection for Clinical Mass Spectrometry

Prøveudtagning Menneskelig Indigenous Spyt Peptidome Brug en Lollipop-Like Ultrafiltrering Probe: forenkle og forbedre Peptid Detection for Klinisk massespektrometri

Although human saliva proteome and peptidome have been revealed 1-2 they were majorly identified from tryptic digests of saliva proteins. Identification ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

Indsamling og brydning af spyt DNA til Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Rapid Fractionation and Isolation of Whole Blood Components in Samples Obtained from a Community-based Setting

Hurtig Fraktionering og Isolering af fuldblod Komponenter i prøver fra en EF-baserede indstilling

Collection and processing of whole blood samples in a non-clinical setting offers a unique opportunity to evaluate community-dwelling individuals both ...

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

Vurdering af de antikoagulerende og anti-inflammatoriske egenskaber i Endothelial celler ved hjælp af 3D cellekultur og ikke-antikoaguleret blod

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

Estimering af Neron nummer i hele nyrerne ved hjælp af Acid maceration metode

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

Hurtig evaluering af kemiske forbindelsers Toksicitet ved hjælp af Zebrafish-embryoner

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer

Hurtig viskoelastisk karakterisering af luftvejsslim ved hjælp af et bænkreometer

In muco-obstructive lung diseases (e.g., asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cystic fibrosis) and other respiratory conditions (e.g., ...

Whole-Kidney Three-Dimensional Staining with CUBIC

Tredimensionel farvning med hele nyrer med CUBIC

Although conventional pathology provided numerous information about kidney microstructure, it was difficult to know the precise structure of blood ...