Name: the &alpha;-test: rapid cell-free cd4 enumeration using whole saliva
Uploaded: 2012-05-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Î±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva at JoVE.com

Forschung wurde von der Harry Winston Forschungsgemeinschaft unterstützt.

1. Bereiten Sie frische Arbeitskopie Lösungen <ol><li> TBS: 0,05 M Tris-gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,8 (TBS). Bereiten Sie 60 ml TBS / Mikroplatten. </li><li> PSA: Schweine-Pankreas-Elastase, Typ 1 (PSA) wird als Suspension zur Verfügung gestellt. Gut schütteln und verdünnen PSA in TBS auf etwa 0,01 U / ml. Bereiten Sie 6 ml Arbeitslösung / Mikroplatten). </li><li> SA 3 NA: Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilid (SA 3 NA). Bereiten 0,1...

<ol>
	<li>Friedlander, Y., Kark, J. D., Eisenberg, S., Stein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+LDL-cholesterol+from+total+cholesterol,+triglyceride+and+HDL-cholesterol:+a+comparison+of+methods+in+the+Jerusalem+Lipid+Research+Clinic+Prevalence+Study.">Calculation of LDL-cholesterol from total cholesterol, triglyceride and HDL-cholesterol: a comparison of methods in the Jerusalem Lipid Research Clinic Prevalence Study.</a> Isr. J. Med. Sci. 18, 1242-1252 (1982).</li><li>Lapidot, T., Petit, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+understanding+of+stem+cell+mobilization:+The+roles+of+chemokines,+proteolytic+enzymes,+adhesion+molecules,+cytokines,+and+stromal+cells.">Current understanding of stem cell mobilization: The roles of chemokines, proteolytic enzymes, adhesion molecules, cytokines, and stromal cells.</a> Exp. Hematol. 30, 973-981 (2002).</li><li>Bristow, C. L., Alfano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;1Antitrypsin+therapy+increases+CD4++lymphocytes+to+normal+values+in+HIV-1+patients.">&#945;1Antitrypsin therapy increases CD4+ lymphocytes to normal values in HIV-1 patients.</a> Soluble factors mediating innate immune responses to HIV infection. , (2010).</li><li>Bristow, C. L., Patel, H., Arnold, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self+antigen+prognostic+for+human+immunodeficiency+virus+disease+progression.">Self antigen prognostic for human immunodeficiency virus disease progression.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8, 937-942 (2001).</li><li>Bristow, C. L., Babayeva, M. A., LaBrunda, M., Mullen, M. P., Winston, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;1Proteinase+Inhibitor+regulates+CD4++lymphocyte+levels+and+is+rate+limiting+in+HIV-1+disease.">&#945;1Proteinase Inhibitor regulates CD4+ lymphocyte levels and is rate limiting in HIV-1 disease.</a> PLoS One. , (2011).</li><li>de Almeida, P. D. V., Gregio, A. M. T., Machado, M. A. N., de Lima, A. A. S., Azevedo, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva+Composition+and+Functions:+A+Comprehensive+Review.">Saliva Composition and Functions: A Comprehensive Review.</a> J. Contemp. Dent. Pract. 9, 72-80 (2008).</li><li>Edgar, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva:+its+secretion,+composition+and+funcitons.">Saliva: its secretion, composition and funcitons.</a> Br. Dent. J. , 172-305 (1992).</li><li>Bristow, C. L., Meo, F. d. i., Arnold, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+activity+of+&#945;1proteinase+inhibitor+and+++2macroglobulin+in+human+serum:+Application+to+insulin-dependent+diabetes+mellitus.">Specific activity of &#945;1proteinase inhibitor and 2macroglobulin in human serum: Application to insulin-dependent diabetes mellitus.</a> Clin. Immunol. Immunopathol. 89, 247-259 (1998).</li><li>Pederson, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+levels+of+&#945;2-macroglobulin,+&#945;1-antitrypsin,+C-reactive+protein,+cathepsin+G+and+elastase+in+humans+with+or+without+destructive+periodontal+disease.">Salivary levels of &#945;2-macroglobulin, &#945;1-antitrypsin, C-reactive protein, cathepsin G and elastase in humans with or without destructive periodontal disease.</a> Arch. Oral Biol. 40, 1151-1155 (1995).</li><li>Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+DNase+I+reduces+the+viscosity+of+cystic+fibrosis+sputum.">Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum.</a> PNAS. 87, 9188-9192 (1990).</li><li>LeVeque, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicenter,+randomized,+double-blind,+placebo-controlled,+dose-+titration+study+of+oral+pilocarpine+for+treatment+of+radiation-induced+xerostomia+in+head+and+neck+cancer+patients.">A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled, dose- titration study of oral pilocarpine for treatment of radiation-induced xerostomia in head and neck cancer patients.</a> J. Clin. Oncol. 11, 1124-1131 (1993).</li><li>Stevens, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+new+CD4+enumeration+technologies+for+resource-constrained+countries.">Evaluating new CD4 enumeration technologies for resource-constrained countries.</a> Nat. Rev. Microbiol. 6, S29-S38 (2008).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2010 ART guidelines for adults and adolescents - evidence map. , (2010).</li></ol>

Unverdünntes Serum enthält Median 36 um α 1 PI und 3,6 um α 2 Makroglobulin (α 2 M) ein 10-facher Unterschied 8. Beide Proteine ​​um die Bindung an PSA. Diese beiden Eigenschaften, Konzentration und PPE Affinität, wurden genutzt, um ein Verfahren, das imstande ist, spezifisch Messen α 1 PI in normalem Serum in Gegenwart von konkurrierenden α 2 M 8 zu entwickeln. Diese Methode kann so wenig wie 50 nM μ 1 PI in 0,3% Serum ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Sialogogue, 0,05 M Zitronensäure </td><td> Edas Zuckerfreie Bonbons, 4900 Hintere N.20th Street, Philadelphia, PA 19144 </td><td> Sugar-Free Lemon Drops </td></tr><tr><td> Schweine-Pankreas-Elastase, Typ 1 (EC 3.4.21.36) </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103 </td><td> E1250 </td></tr><tr><td> Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S4760 </td></tr><tr><td> Coomassie Brilliant Blue R-250 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B7920 </td></tr><tr><td> Gewebekultur-behandelt, 96 Well Mikrotiterplatten </td><td> Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886 </td><td> 35-3072 </td></tr><tr><td> Mikroplatten-Reader mit Filtern für 405 nm und 595 nm </td><td> MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182 </td><td> Dynex P97277 </td></tr></tbody></table>

the &alpha;-test: rapid cell-free cd4 enumeration using whole saliva

Es besteht ein dringender Bedarf an erschwinglichen CD4-Enumeration, um HIV-Erkrankung zu überwachen. CD4-Zählung ist außerhalb der Reichweite in Regionen mit begrenzten Ressourcen aufgrund der Zeit und Temperatur Einschränkungen, technische Raffinesse, und die Kosten für Reagenzien, insbesondere monoklonale Antikörper gegen CD4 auf Blutzellen, die einzige derzeit akzeptable Methode zu messen. Eine häufig verwendete kostengünstige und zeitsparende Labor Strategie ist es, zu berechnen, anstatt Maßnahme bestimmte Blutwerte. Zum Beispiel werden LDL-Spiegel unter Verwendung der gemessenen Werte von Gesamtcholesterin, HDL und Triglyceride 1. Somit zählt Identifizierung von zellfreien korreliert, die direkt regulieren die Anzahl der CD4 + T-Zellen konnte eine genaue Methode zur Berechnung CD4 bereitzustellen aufgrund der physiologischen Bedeutung der korreliert. Die Anzahl der Stammzellen, die Blut eintreten und bestimmt zu werden zirkulierender CD4 + T-Zellen wird durch das Chemokin CXCL12 einer bestimmtennd seinen Rezeptor CXCR4 durch ihren Einfluss auf die Fortbewegung 2. Verfahren nach Stammzellen Bewegung in Blut wird zusätzlich durch Zelloberfläche menschliche Leukozyten-Elastase (HLE CS) und dem HLE CS-reaktiven aktiven α 1-Proteinase-Inhibitor (α 1 PI, α 1-Antitrypsin, SERPINA1) 3 geregelt. In HIV-1-Erkrankung, ist α 1 PI inaktiviert durch Krankheitsprozesse 4. In den frühen Gruppen von asymptomatischen HIV-1 Erkrankung, wurde die aktive α 1 PI zufolge unter werden in 100% der unbehandelten HIV-1-Patienten (M = 12 pM, und ein normales während der symptomatischen Kategorien 4, 5 zu erreichen normal. Diese Muster hat Immunsystem Inaktivierung zugeschrieben, nicht ausreichend Synthese proteolytischen Inaktivierung oder Sauerstoff. Wir beobachteten, dass bei HIV-1-Patienten mit&gt; 220 CD4-Zellen / ul, CD4-Zahlen mit Serum Spiegel der aktiven α 1 PI korreliert (r 2 = 0,93, p &amp;lt; 0,0001, n = 26) und inaktive α 1 PI (r 2 = 0,91, p &lt;0,0001, n = 26) 5. Die Verabreichung von α 1 PI, um HIV-1 infizierten und nicht infizierten Probanden führte zu dramatischen Anstieg der CD4-Zellzahl darauf hindeutet, α 1 PI beteiligt an der Regulation der Anzahl der CD4 + T-Zellen im Blut 3. Mit Stimulation, enthält ganze Speichel ausreichend seröse Exsudat (Plasma, das verbleibende Material, das durch Wände der Blutgefäße in den Speichel übergeht), damit die Messung von aktiven α 1 PI und die Korrelation dieser Messung gibt Hinweise, dass es eine genaue Methode zur Berechnung der CD4-Zellzahl ist. Kurz gesagt, stimulieren sialogogues wie Kaugummi oder Zitronensäure die Exsudation von Serum in ganzen Mund Speichel. Nach Stimulation Serum Exsudation, wird die Aktivität von Serum α 1 PI im Speichel durch seine Fähigkeit, Elastase-Aktivität zu hemmen gemessen. Schweine-Pankreas-Elastase (PPE)ist ein leicht verfügbares preiswerten Quelle für Elastase. PPE bindet an α 1 PI Bilden einer eins-zu-eins-Komplex, der verhindert, PPE Abspaltung ihrer spezifischen Substraten, von denen die kolorimetrische Peptid ist, Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-Nitroanilid (SA 3 NA). Inkubation von Speichel mit einer sättigenden Konzentration von PSA für 10 Minuten bei Raumtemperatur ermöglicht die Bindung von PSA an alle aktiven α 1 PI im Speichel. Die daraus resultierende Hemmung der PSA, die unter aktiver α 1 PI kann durch Zugabe des PSA-Substrat SA 3 NA. (Abbildung 1) gemessen werden. Obwohl CD4 in Bezug auf das Blutvolumen (CD4-Zellen / ul) gemessen werden, wird die Konzentration an α 1 PI im Speichel zu der Konzentration von Serum im Speichel und nicht die für die Menge der Speichel da das Volumen beträchtlich variieren während des Tages und Person bis 6 Personen. Es ist praktisch das gesamte Protein im Speichel durch Serumgehalt, und das Protein von Speichel wird gemesversicherbar 7. Somit wird aktiven α 1 PI im Speichel im Verhältnis zum Speichel Proteingehalt berechnet und wird als α 1 PI-Index. Hier dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die α 1 PI-Index eine genaue und präzise physiologische Verfahren zur Berechnung CD4 bietet.

Watch this Scientific Journal Video about The Î±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva at JoVE.com

The &#945;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

Eine Aufzählung CD4-Methode, die α-Test, beschrieben, nutzt ganzen Speichel auf eine schnelle und genaue CD4-Werten geben. Die α-Test kostet Pfennige und eliminiert die Notwendigkeit für technische Schulungen, teure Reagenzien wie monoklonale Antikörper, Mess-, Kälte-, Transport der Proben, sowie Sammlung und Handhabung von Blut.

Die α-Test: Rapid Zellfreie CD4-Zählung mit ganzen Speichel

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Research

JoVE Journal

Medicine

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&#946; using a Whole Blood Stimulation Assay

Genaue und einfache Messung der pro-inflammatorischen Zytokins IL-1β mit einem Vollblut Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

Forschung

Medizin

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

Schnelle Point-of-Care-Test von Enoxaparin Gerinnungshemmer Wirksamkeit im Vollblut

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

Sampling Human Indigenous Saliva Peptidome Using a Lollipop-Like Ultrafiltration Probe: Simplify and Enhance Peptide Detection for Clinical Mass Spectrometry

Probenahme menschliche Speichel Indigene Peptidoms Mit einem Lollipop-Like Ultrafiltration Sonde: vereinfachen und erweitern Peptid-Erkennung für Klinische Massenspektrometrie

Although human saliva proteome and peptidome have been revealed 1-2 they were majorly identified from tryptic digests of saliva proteins. Identification ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

Sammlung und Extraktion von DNA-Speichel für Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Rapid Fractionation and Isolation of Whole Blood Components in Samples Obtained from a Community-based Setting

Schnelle Fraktionierung und Isolierung von Vollblutkomponenten in Proben aus einer Gemeinschaft basierende Einstellung Erhalten

Collection and processing of whole blood samples in a non-clinical setting offers a unique opportunity to evaluate community-dwelling individuals both ...

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

Bewertung der gerinnungshemmenden und entzündungshemmenden Eigenschaften von Endothelzellen mit 3D Zellkultur und nicht-Antikoagulanzien Vollblut

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

Schätzung der Nephron-Zahl in Ganznierstein mit der Acid-Maeration-Methode

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

Schnelle Bewertung der Toxizität chemischer Verbindungen mit Zebrafischembryonen

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer

Schnelle viskoelastische Charakterisierung von Atemwegsschleim mit einem Tischrheometer

In muco-obstructive lung diseases (e.g., asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cystic fibrosis) and other respiratory conditions (e.g., ...

Whole-Kidney Three-Dimensional Staining with CUBIC

Ganznieren-dreidimensionale Färbung mit CUBIC

Although conventional pathology provided numerous information about kidney microstructure, it was difficult to know the precise structure of blood ...