Name: the &alpha;-test: rapid cell-free cd4 enumeration using whole saliva
Uploaded: 2012-05-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Î±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva at JoVE.com

Forskningen ble støttet av Harry Winston Research Foundation.

1. Forbered Ferske Working Solutions <ol><li> TBS: 0,05 M Tris saltløsning, pH 7,8 (TBS). Forbered 60 ml TBS / mikroplate. </li><li> PPE: porcine bukspyttkjertelen elastase, type 1 (PPE) er gitt som en suspensjon. Rist godt og fortynne PPE i TBS til ca 0,01 U / ml. Forbered 6 ml arbeidsløsning / mikroplate). </li><li> SA 3 NA: succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide (SA 3 NA). Forbered 0,1 M lager SA 3 NA løsning i dimethyl sulfox...

<ol>
	<li>Friedlander, Y., Kark, J. D., Eisenberg, S., Stein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+LDL-cholesterol+from+total+cholesterol,+triglyceride+and+HDL-cholesterol:+a+comparison+of+methods+in+the+Jerusalem+Lipid+Research+Clinic+Prevalence+Study.">Calculation of LDL-cholesterol from total cholesterol, triglyceride and HDL-cholesterol: a comparison of methods in the Jerusalem Lipid Research Clinic Prevalence Study.</a> Isr. J. Med. Sci. 18, 1242-1252 (1982).</li><li>Lapidot, T., Petit, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+understanding+of+stem+cell+mobilization:+The+roles+of+chemokines,+proteolytic+enzymes,+adhesion+molecules,+cytokines,+and+stromal+cells.">Current understanding of stem cell mobilization: The roles of chemokines, proteolytic enzymes, adhesion molecules, cytokines, and stromal cells.</a> Exp. Hematol. 30, 973-981 (2002).</li><li>Bristow, C. L., Alfano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;1Antitrypsin+therapy+increases+CD4++lymphocytes+to+normal+values+in+HIV-1+patients.">&#945;1Antitrypsin therapy increases CD4+ lymphocytes to normal values in HIV-1 patients.</a> Soluble factors mediating innate immune responses to HIV infection. , (2010).</li><li>Bristow, C. L., Patel, H., Arnold, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self+antigen+prognostic+for+human+immunodeficiency+virus+disease+progression.">Self antigen prognostic for human immunodeficiency virus disease progression.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8, 937-942 (2001).</li><li>Bristow, C. L., Babayeva, M. A., LaBrunda, M., Mullen, M. P., Winston, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;1Proteinase+Inhibitor+regulates+CD4++lymphocyte+levels+and+is+rate+limiting+in+HIV-1+disease.">&#945;1Proteinase Inhibitor regulates CD4+ lymphocyte levels and is rate limiting in HIV-1 disease.</a> PLoS One. , (2011).</li><li>de Almeida, P. D. V., Gregio, A. M. T., Machado, M. A. N., de Lima, A. A. S., Azevedo, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva+Composition+and+Functions:+A+Comprehensive+Review.">Saliva Composition and Functions: A Comprehensive Review.</a> J. Contemp. Dent. Pract. 9, 72-80 (2008).</li><li>Edgar, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva:+its+secretion,+composition+and+funcitons.">Saliva: its secretion, composition and funcitons.</a> Br. Dent. J. , 172-305 (1992).</li><li>Bristow, C. L., Meo, F. d. i., Arnold, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+activity+of+&#945;1proteinase+inhibitor+and+++2macroglobulin+in+human+serum:+Application+to+insulin-dependent+diabetes+mellitus.">Specific activity of &#945;1proteinase inhibitor and 2macroglobulin in human serum: Application to insulin-dependent diabetes mellitus.</a> Clin. Immunol. Immunopathol. 89, 247-259 (1998).</li><li>Pederson, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+levels+of+&#945;2-macroglobulin,+&#945;1-antitrypsin,+C-reactive+protein,+cathepsin+G+and+elastase+in+humans+with+or+without+destructive+periodontal+disease.">Salivary levels of &#945;2-macroglobulin, &#945;1-antitrypsin, C-reactive protein, cathepsin G and elastase in humans with or without destructive periodontal disease.</a> Arch. Oral Biol. 40, 1151-1155 (1995).</li><li>Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+DNase+I+reduces+the+viscosity+of+cystic+fibrosis+sputum.">Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum.</a> PNAS. 87, 9188-9192 (1990).</li><li>LeVeque, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicenter,+randomized,+double-blind,+placebo-controlled,+dose-+titration+study+of+oral+pilocarpine+for+treatment+of+radiation-induced+xerostomia+in+head+and+neck+cancer+patients.">A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled, dose- titration study of oral pilocarpine for treatment of radiation-induced xerostomia in head and neck cancer patients.</a> J. Clin. Oncol. 11, 1124-1131 (1993).</li><li>Stevens, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+new+CD4+enumeration+technologies+for+resource-constrained+countries.">Evaluating new CD4 enumeration technologies for resource-constrained countries.</a> Nat. Rev. Microbiol. 6, S29-S38 (2008).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2010 ART guidelines for adults and adolescents - evidence map. , (2010).</li></ol>

Ufortynnet serum inneholder median 36 mM α 1 PI og 3,6 mM α 2 makroglobulin (α 2 M) en 10-fold forskjell 8. Begge proteiner konkurrere om binding til PPE. Disse to egenskapene, konsentrasjon og PPE tilhørighet, har blitt utnyttet for å utvikle en metode som er i stand til spesifikt måle α 1 PI i normal serum i nærvær av konkurrerende α 2 M 8. Denne metoden kan påvise så lite som 50 nm μ 1 PI i 0,3% serum. På en serumfor...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagensen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Sialogogue, 0.05M sitronsyre </td><td> EDA er sukkerfrie sukkertøy, 4900 Rear N.20th Street, Philadelphia, 19144 PA </td><td> Sugar-Free Lemon dråper </td></tr><tr><td> Svin bukspyttkjertelen elastase, type 1 (EC 3.4.21.36) </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, 63103 MO </td><td> E1250 </td></tr><tr><td> Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S4760 </td></tr><tr><td> Coomassie Brilliant Blue R-250 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B7920 </td></tr><tr><td> Vevskultur-behandlet, 96 og mikroplater </td><td> Becton Dickinson, Franklin Lakes, 07417-1886 NJ </td><td> 35-3072 </td></tr><tr><td> Mikroplateleser med filtre for 405 nm og 595 nm </td><td> MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Wien, 22182 Virginia </td><td> Dynex P97277 </td></tr></tbody></table>

the &alpha;-test: rapid cell-free cd4 enumeration using whole saliva

Det er et presserende behov for rimelig CD4 telling å overvåke HIV sykdom. CD4 Oppregningen er utilgjengelig i ressurs-begrensede områder på grunn av tid og temperatur restriksjoner, teknisk raffinement, og kostnader av reagenser, særlig monoklonale antistoffer til måle CD4 på blodceller, det eneste øyeblikket akseptabel metode. En vanlig brukt kostnadsbesparende og tidsbesparende laboratorium strategi er å beregne, fremfor å måle visse blodverdier. For eksempel er LDL-nivå beregnet ved hjelp av målte nivåene av total kolesterol, HDL og triglyserider en. Dermed teller identifisering av celle-frie korrelater som direkte regulerer antallet CD4 + T celler kan gi en nøyaktig metode for beregning CD4 grunn av fysiologiske relevans korrelater. Antall stamceller som angir blod og er skjebnebestemt til å bli sirkulerende CD4 + T celler bestemmes av chemokine CXCL12 ennd sin reseptor CXCR4 grunn av sin innflytelse på locomotion to. Prosessen med stamcelle bevegelse inn i blodet er i tillegg regulert av celleoverflaten human leukocytt elastase (hle CS) og hle CS-reaktivt aktive α 1 proteinase inhibitor (α 1 PI, en α antitrypsin, SerpinA1) 3. I HIV-1 sykdom, er α en PI inaktivert på grunn av sykdom prosesser 4. I de tidlige asymptomatiske kategorier av HIV-1 sykdom, ble aktiv α 1 PI funnet å være under normal i 100% av ubehandlede HIV-1 pasienter (median = 12 mM, til og oppnå normale nivåer i løpet av de symptomatiske kategoriene 4, 5. Dette mønsteret har blitt tilskrevet immune inaktivering, ikke for lite syntese, proteolytisk inaktivering, eller oksygenering. Vi observerte at i HIV-1 fag med&gt; 220 CD4-celler / mL ble CD4-tall korrelert med serumnivået av aktive α en PI (r 2 = 0,93, p &amp;lt; 0,0001, n = 26) og inaktive α en PI (r 2 = 0,91, p &lt;0,0001, n = 26) 5. Administrasjon av α 1 PI til HIV-1 infiserte og ikke-infiserte pasienter resulterte i dramatiske økninger i CD4-tall tyder på α 1 PI deltar i regulering av antallet CD4 + T celler i blodet tre. Med stimulering, inneholder hele spytt nok serøs sekresjon (plasma inneholder proteinavleiring materiale som passerer gjennom blodårene vegger i spytt) for å tillate måling av aktive α 1 PI og korrelasjonen av denne målingen er bevis på at det er en nøyaktig metode for beregning CD4-tall. Kort, sialogogues som tyggegummi eller sitronsyre stimulere exudation av serum i hele munnen spytt. Etter å stimulere serum exudation, er aktiviteten av serum α 1 PI i spytt målt ved sin evne til å hemme elastase aktivitet. Svin bukspyttkjertelen elastase (PPE)er en lett tilgjengelig billig kilde til elastase. PPE binder seg til α 1 PI danner en en-til-en kompleks som hindrer PVU fra spalte sine spesifikke substrater, hvorav den ene er den kolorimetrisk peptid, succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide (SA 3 NA). Ruger spytt med en mette konsentrasjon av PVU i 10 min ved romtemperatur tillater binding av PVU til alle aktive α 1 PI i spytt. Den resulterende hemming av PVU ved aktiv α 1 PI kan måles ved å legge PVU underlaget SA 3 NA. (Figur 1). Selv CD4-tall er målt i blod volum (CD4 celler / mL), er konsentrasjonen av α 1 PI i spytt knyttet til konsentrasjonen av serum i spytt, ikke til volum av spytt siden volum kan variere betydelig i løpet av dagen og person til person seks. Imidlertid er nesten alt proteinet i spytt på grunn av serum innhold, og proteininnholdet i spytt er measurable 7. Dermed er aktive α 1 PI i spytt beregnes som forholdet til spytt proteininnhold og den såkalte α 1 PI Index. Resultater som presenteres her viser at α 1 PI Index gir en nøyaktig og presis fysiologisk metode for beregning av CD4-tall.

Watch this Scientific Journal Video about The Î±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva at JoVE.com

The &#945;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

En CD4 oppregning metoden, α-test, er beskrevet som bruker hele spytt for å gi raske og nøyaktige CD4-tall. De α-test koster pennies og eliminerer behovet for teknisk opplæring, kostbare reagenser som monoklonale antistoffer, instrumentering, kjøling, transport av prøver, samt innsamling og håndtering av blod.

Den α-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Bruke Hele Spytt

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Research

JoVE Journal

Medicine

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&#946; using a Whole Blood Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

Rapid Point-of-Care-analysen av Enoksaparin Antikoagulerende Effekt i fullblod

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

Sampling Human Indigenous Saliva Peptidome Using a Lollipop-Like Ultrafiltration Probe: Simplify and Enhance Peptide Detection for Clinical Mass Spectrometry

Prøvetaking Menneskelig Indigenous Spytt Peptidome Bruke en Lollipop-Like ultrafiltrasjon Probe: Forenkle og forbedre Peptide Detection for klinisk massespektrometri

Although human saliva proteome and peptidome have been revealed 1-2 they were majorly identified from tryptic digests of saliva proteins. Identification ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

Innsamling og Utvinning av spytt DNA for Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Rapid Fractionation and Isolation of Whole Blood Components in Samples Obtained from a Community-based Setting

Rapid fraksjonering og isolering av Whole Blood komponenter i prøver tatt fra en fellesskapsbasert Setting

Collection and processing of whole blood samples in a non-clinical setting offers a unique opportunity to evaluate community-dwelling individuals both ...

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

Vurdering av antikoagulerende og anti-inflammatorisk egenskaper av endotelceller 3D cellekultur og ikke-anticoagulated fullblod

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

Estimering av Nephron nummer i hele nyrene ved hjelp av acid maserasjon Method

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

Rask evaluering av toksisitet av kjemiske forbindelser bruke sebrafisk embryo

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer

Rask viskoelastisk karakterisering av Airway Mucus ved hjelp av et benkeplate-reometer

In muco-obstructive lung diseases (e.g., asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cystic fibrosis) and other respiratory conditions (e.g., ...

Whole-Kidney Three-Dimensional Staining with CUBIC

Hel-nyre tredimensjonal farging med CUBIC

Although conventional pathology provided numerous information about kidney microstructure, it was difficult to know the precise structure of blood ...