Name: the &alpha;-test: rapid cell-free cd4 enumeration using whole saliva
Uploaded: 2012-05-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Î±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva at JoVE.com

La investigación fue apoyada por la Fundación de Investigación de Harry Winston.

1. Preparar soluciones frescas de Trabajo <ol><li> TBS: 0,05 M de Tris Buffered Saline pH, 7,8 (TBS). Preparar 60 ml de TBS / microplaca. </li><li> EPI: elastasa pancreática porcina, de tipo 1 (EPP) se proporciona como una suspensión. Agitar bien y diluir PPE en TBS a aproximadamente 0,01 U / ml. Preparar 6 ml de solución de trabajo / microplaca). </li><li> SA 3 NA: succinil-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilida (SA 3 NA). Prepare 0,1 M de valores ...

<ol>
	<li>Friedlander, Y., Kark, J. D., Eisenberg, S., Stein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+LDL-cholesterol+from+total+cholesterol,+triglyceride+and+HDL-cholesterol:+a+comparison+of+methods+in+the+Jerusalem+Lipid+Research+Clinic+Prevalence+Study.">Calculation of LDL-cholesterol from total cholesterol, triglyceride and HDL-cholesterol: a comparison of methods in the Jerusalem Lipid Research Clinic Prevalence Study.</a> Isr. J. Med. Sci. 18, 1242-1252 (1982).</li><li>Lapidot, T., Petit, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+understanding+of+stem+cell+mobilization:+The+roles+of+chemokines,+proteolytic+enzymes,+adhesion+molecules,+cytokines,+and+stromal+cells.">Current understanding of stem cell mobilization: The roles of chemokines, proteolytic enzymes, adhesion molecules, cytokines, and stromal cells.</a> Exp. Hematol. 30, 973-981 (2002).</li><li>Bristow, C. L., Alfano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;1Antitrypsin+therapy+increases+CD4++lymphocytes+to+normal+values+in+HIV-1+patients.">&#945;1Antitrypsin therapy increases CD4+ lymphocytes to normal values in HIV-1 patients.</a> Soluble factors mediating innate immune responses to HIV infection. , (2010).</li><li>Bristow, C. L., Patel, H., Arnold, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self+antigen+prognostic+for+human+immunodeficiency+virus+disease+progression.">Self antigen prognostic for human immunodeficiency virus disease progression.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8, 937-942 (2001).</li><li>Bristow, C. L., Babayeva, M. A., LaBrunda, M., Mullen, M. P., Winston, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;1Proteinase+Inhibitor+regulates+CD4++lymphocyte+levels+and+is+rate+limiting+in+HIV-1+disease.">&#945;1Proteinase Inhibitor regulates CD4+ lymphocyte levels and is rate limiting in HIV-1 disease.</a> PLoS One. , (2011).</li><li>de Almeida, P. D. V., Gregio, A. M. T., Machado, M. A. N., de Lima, A. A. S., Azevedo, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva+Composition+and+Functions:+A+Comprehensive+Review.">Saliva Composition and Functions: A Comprehensive Review.</a> J. Contemp. Dent. Pract. 9, 72-80 (2008).</li><li>Edgar, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva:+its+secretion,+composition+and+funcitons.">Saliva: its secretion, composition and funcitons.</a> Br. Dent. J. , 172-305 (1992).</li><li>Bristow, C. L., Meo, F. d. i., Arnold, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+activity+of+&#945;1proteinase+inhibitor+and+++2macroglobulin+in+human+serum:+Application+to+insulin-dependent+diabetes+mellitus.">Specific activity of &#945;1proteinase inhibitor and 2macroglobulin in human serum: Application to insulin-dependent diabetes mellitus.</a> Clin. Immunol. Immunopathol. 89, 247-259 (1998).</li><li>Pederson, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+levels+of+&#945;2-macroglobulin,+&#945;1-antitrypsin,+C-reactive+protein,+cathepsin+G+and+elastase+in+humans+with+or+without+destructive+periodontal+disease.">Salivary levels of &#945;2-macroglobulin, &#945;1-antitrypsin, C-reactive protein, cathepsin G and elastase in humans with or without destructive periodontal disease.</a> Arch. Oral Biol. 40, 1151-1155 (1995).</li><li>Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+DNase+I+reduces+the+viscosity+of+cystic+fibrosis+sputum.">Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum.</a> PNAS. 87, 9188-9192 (1990).</li><li>LeVeque, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicenter,+randomized,+double-blind,+placebo-controlled,+dose-+titration+study+of+oral+pilocarpine+for+treatment+of+radiation-induced+xerostomia+in+head+and+neck+cancer+patients.">A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled, dose- titration study of oral pilocarpine for treatment of radiation-induced xerostomia in head and neck cancer patients.</a> J. Clin. Oncol. 11, 1124-1131 (1993).</li><li>Stevens, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+new+CD4+enumeration+technologies+for+resource-constrained+countries.">Evaluating new CD4 enumeration technologies for resource-constrained countries.</a> Nat. Rev. Microbiol. 6, S29-S38 (2008).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2010 ART guidelines for adults and adolescents - evidence map. , (2010).</li></ol>

Suero sin diluir contiene la mediana de 36 mM α 1 PI y 3,6 mM α 2 macroglobulina (α 2 M), una diferencia de 10 veces 8. Ambas proteínas competir por la unión a EPI. Estas dos características, la concentración y la afinidad del PPE, se han explotado para desarrollar un método que es capaz de medir específicamente α 1 PI en el suero normal en presencia de competir α 2 M 8. Este método puede detectar cantidades tan pequeñas como 50 μ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Sialogogo, 0,05 M de ácido cítrico </td><td> Caramelos Sugarfree EDA, 4900 trasero N.20th Street, Philadelphia, PA 19144 </td><td> Sin azúcar gotas de limón </td></tr><tr><td> Elastasa pancreática porcina, de tipo 1 (EC 3.4.21.36) </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103 </td><td> E1250 </td></tr><tr><td> Succinil-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilida </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S4760 </td></tr><tr><td> Coomassie Brilliant Blue R-250 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B7920 </td></tr><tr><td> El cultivo de tejidos tratados, microplacas de 96 pocillos </td><td> Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886 </td><td> 35-3072 </td></tr><tr><td> Lector de microplacas con filtros de 405 nm y 595 nm </td><td> MTX Lab Systems, Inc. 8456 Road, Building D, Vienna, Virginia 22182 </td><td> Dynex P97277 </td></tr></tbody></table>

the &alpha;-test: rapid cell-free cd4 enumeration using whole saliva

Hay una necesidad urgente para el recuento de CD4 asequibles para controlar la enfermedad del VIH. Recuento de CD4 está fuera del alcance de las regiones con recursos limitados, debido a la restricciones de tiempo y temperatura, la sofisticación técnica, y el costo de los reactivos, en particular los anticuerpos monoclonales para medir los CD4 en las células de la sangre, el único método aceptable. Una estrategia de uso común de ahorro de costes y ahorro de tiempo de laboratorio consiste en calcular, en lugar de medir los valores sanguíneos determinados. Por ejemplo, los niveles de LDL se calculan utilizando los niveles medidos de colesterol total, HDL y triglicéridos 1. Por lo tanto, la identificación de células libres de los correlatos que regulan directamente el número de células CD4 + T podría proporcionar un método exacto para calcular el recuento de células CD4, debido a la importancia fisiológica de las correlaciones. El número de células madre que entran a la sangre y están destinados a convertirse en circulación células T CD4 + está determinada por la quimioquina CXCL12 unª de su receptor CXCR4, debido a su influencia sobre la locomoción 2. El proceso de la locomoción de las células madre en sangre es, además, regulada por la superficie celular elastasa de leucocitos humanos (HLE CS) y la ELH CS-reactivo activo α 1 inhibidor de proteinasa (PI 1 α, α 1 antitripsina, SERPINA1) 3. En la enfermedad de VIH-1, α 1 PI está inactiva debido a procesos de la enfermedad 4. En las categorías primeros asintomáticos de VIH-1 enfermedad, activo α 1 PI se encontró que era inferior a lo normal en el 100% de VIH-1 no tratados los pacientes (mediana = 12 mM, y para lograr niveles normales durante las categorías sintomáticas 4, 5. Este patrón se ha atribuido a la inactivación inmune, no a la síntesis insuficiente, la inactivación proteolítica, o la oxigenación. Hemos observado que en VIH-1 sujetos con CD4&gt; 220 células / l, el recuento de CD4 se correlaciona con los niveles séricos de PI activo α 1 (R 2 = 0,93, p &amp;lt; 0.0001, n = 26) y los inactivos α 1 PI (R 2 = 0,91, p &lt;0,0001, n = 26) 5. La administración de α 1 PI al VIH-1 en individuos infectados y no infectados como resultado aumentos significativos en los recuentos de CD4 que sugieren α 1 PI participa en la regulación del número de células T CD4 + en la sangre 3. Con la estimulación, toda la saliva contiene exudado seroso suficiente (plasma que contiene material proteínico que pasa a través de las paredes de los vasos sanguíneos en la saliva) para permitir la medición de la actividad α 1 PI y la correlación de esta medida es evidencia de que es un método preciso para calcular los recuentos de CD4. En pocas palabras, sialogogos tales como la goma de mascar o ácido cítrico estimula la exudación de suero en la saliva toda la boca. Después de la estimulación exudación de suero, la actividad de suero α 1 PI en la saliva se mide por su capacidad para inhibir la actividad de la elastasa. Elastasa pancreática porcina (EPP)es una fuente barata fácilmente disponibles de la elastasa. PPE se une a α 1 PI formando un complejo uno-a-uno que evita PPE de escindir sus sustratos específicos, uno de los cuales es el péptido colorimétrico, succinil-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilida (SA 3 NA). Incubando saliva con una concentración de saturación de PPE durante 10 min a temperatura ambiente permite la unión de PPE a toda la sesión α 1 PI en la saliva. La inhibición de PPE por activo α 1 PI puede ser medido mediante la adición del PPE sustrato SA 3 de NA. (Figura 1). Aunque los recuentos de CD4 se miden en términos de volumen de sangre (células CD4 / l), la concentración de α 1 PI en la saliva se relaciona con la concentración de suero en la saliva, no al volumen de la saliva puesto que el volumen puede variar considerablemente durante el día y persona a persona 6. Sin embargo, prácticamente toda la proteína en la saliva es debido al contenido de suero, y el contenido en proteínas de la saliva es MEAmensurable 7. Por lo tanto, activa α 1 PI en la saliva se calcula como la relación al contenido de proteínas y la saliva se denomina α 1 Índice de PI. Los resultados presentados en este documento demuestran que la α 1 Índice de PI proporciona un método fisiológico exacto y preciso para el cálculo de los recuentos de CD4.

Watch this Scientific Journal Video about The Î±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva at JoVE.com

The &#945;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

Un método de enumeración de CD4, la α-test, se describe que utiliza toda la saliva para proporcionar recuentos de células CD4 rápidos y precisos. Las pruebas α-cuesta centavos y elimina la necesidad de formación técnica, reactivos costosos, como los anticuerpos monoclonales, instrumentación, refrigeración, transporte de muestras, así como la recolección y el manejo de sangre.

El α-test: Rapid libre de células CD4 enumeración utilizando toda la saliva

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Research

JoVE Journal

Medicine

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&#946; using a Whole Blood Stimulation Assay

La medición precisa y simple de la citoquina pro-inflamatoria IL-1β mediante un análisis de sangre entera estimulación

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

Investigación

Medicina

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

Rapid Point-of-Care Ensayo de la eficacia anticoagulante enoxaparina en sangre entera

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

Sampling Human Indigenous Saliva Peptidome Using a Lollipop-Like Ultrafiltration Probe: Simplify and Enhance Peptide Detection for Clinical Mass Spectrometry

Toma de muestras de saliva humana Peptidome indígenas que utilizan una sonda de ultrafiltración Lollipop-térmica: Simplificar y mejorar la detección de péptidos de Espectrometría de Masas clínica

Although human saliva proteome and peptidome have been revealed 1-2 they were majorly identified from tryptic digests of saliva proteins. Identification ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

Recolección y extracción de ADN de la saliva de Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Rapid Fractionation and Isolation of Whole Blood Components in Samples Obtained from a Community-based Setting

Fraccionamiento rápida y aislamiento de componentes de sangre total en las muestras obtenidas a partir de una configuración basada en la comunidad

Collection and processing of whole blood samples in a non-clinical setting offers a unique opportunity to evaluate community-dwelling individuals both ...

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

Evaluación de las propiedades anticoagulantes y antiinflamatorias de las células endoteliales mediante cultivo celular 3D y sangre no anticoagulada

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

Estimación del número de Nefrona en riñón entera utilizando el método de maceración ácida

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

Evaluación rápida de la toxicidad de compuestos químicos mediante embriones de pez cebra

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer

Caracterización viscoelástica rápida del moco de las vías respiratorias utilizando un reómetro de sobremesa

In muco-obstructive lung diseases (e.g., asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cystic fibrosis) and other respiratory conditions (e.g., ...

Whole-Kidney Three-Dimensional Staining with CUBIC

Tinción tridimensional de riñón entero con CUBIC

Although conventional pathology provided numerous information about kidney microstructure, it was difficult to know the precise structure of blood ...