Name: harvesting and cryo-cooling crystals of membrane proteins grown in lipidic mesophases for structure determination by macromolecular crystallography
Uploaded: 2012-09-02T14:00:00
Duration: 18 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography at JoVE.co

Det er mange som har bidratt til dette arbeidet, og de fleste er fra Caffrey Membran strukturelle og funksjonelle biologi Group, både tidligere og nåværende medlemmer. For alle, og spesielt til Jingquan Tan og Joseph Lyons, vi utvider våre varmeste takk og takknemlighet. Dette arbeidet ble støttet delvis av tilskudd fra Science Foundation Irland (07/IN.1/B1836), National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 og U54GM094599), og FP7 COST og Marie Curie Actions (CM0902 og PIEF-GA-2009 -235612).

1. Laboratory Set-up Pre-fangst <ol><li> I forberedelsene til høsting, fyll tørt skum Dewar med flytende nitrogen og plassere den ved siden av mikroskop hvor høsting skal skje. </li><li> Senk lagring pucken, åpner ende opp i flytende nitrogen inni skum Dewar og la den helt kult. </li><li> Sikre en mikro-montering av en størrelse som passer krystall som skal høstes på en magnetisk tryllestav (figur 5). Det er viktig å ha på hånden en rekke reservedeler magnetisk wands forhåndslastet med mikro-mounts å imøtekomme for situasjoner der det er nødvendig å høste flere krystaller fra en bolus. Spare tryllestaver skal være tilgjengelig til alle tider. </li><li> Plasser en mikropipette, skjær og fellingsmidlet løsning som ble brukt for krystallvekst ved siden høsting mikroskop. Det kan være nødvendig for å dekke mesofase og for å forhindre uttørking når brønnen åpnes. </li><li> Har en notatbok og penn på benken like ved, og / ellerdatamaskinen åpne. Disse vil bli brukt til å registrere observasjoner vedrørende kvaliteten, utseende, plassering, lagring pucken nummer osv., av krystaller etter hvert som de er høstet, Cryo-avkjølt og plassert i lagring. </li><li> Hvis en assistent er tilgjengelig for å hjelpe med slakting denne personen må forstå tydelig protokollen som vil bli fulgt, i hvilken rekkefølge de ulike trinnene vil skje, og deres rolle i den totale prosessen. </li></ol> Med alle de materialer og utstyr på plass vår neste oppgave er å: 2. Identifisere Plater og Wells som inneholder krystaller <ol><li> Den enkleste og mest direkte metode for å finne høstbare krystaller er å inspisere brønner for hånd med et mikroskop med normal og med kryssede polarisert lys. Justere opplysende lysintensiteten på mikroskopet kan hjelpe med å finne krystaller. </li><li> Alternativt, krysset en imager der platene er vist automatisk med normal og polarisered lys, kan brukes for å lete etter krystaller. </li><li> Evaluere ved øyet registrert digitale bilder på en dataskjerm. </li><li> Tydelig markere de brønner med krystaller for høsting og ta kommentarer på størrelse, kvalitet og plassering av krystaller i mesofase i maskinen eller på en datamaskin. </li><li> Ta av platen inneholder krystaller for høsting fra imager. </li></ol> 3. Åpning av en godt med cubic mesofase. Metode 1 Platene som krystaller vokser ved in meso metoden er glass sandwich-plater (figur 2). For å få tilgang til mesofase og krystallene deri, er det nødvendig å åpne brønnen. Dette gjøres ved hjelp av en glass skjærende verktøy for å kutte den øvre coverglass som forsegler vel som deretter kan fjernes. Det finnes flere tilnærminger for å kutte og fjerne coverglass fra over en krystallisering godt. En å bruke er diktert av den type of mesofase hvori krystallen er funnet voksende. Dette kan være svært viskøs og klebrig kubiske fase (figur 3A), eller dens mer fluidum variant, svampen fasen (Figur 3B). I denne videoen artikkelen viser vi hvordan du åpner brønner og å høste krystaller fra begge disse hosting materialer. <ol><li> Plasser glasset-sandwich krystallisering plate på stadium av et lysmikroskop. </li><li> Ved hjelp av en glass skjæreverktøy scorer coverglass lett med to konsentriske sirkler som befinner seg over avstandsstykket og like utenfor omkretsen av brønnen. Med en ny skjærende verktøy, krever scoring minimal anvendt trykk. Erstatt verktøyet med en ny når trykket er nødvendig å score øker enda brøkdel, dette vanligvis oppstår etter åpning 10 brønner. </li><li> Bryte opp glass i rommet mellom de to sirklene scoret for det formål å slippe indre coverglass. Dette genererer mange glasskår og støv. Fjerne dem med en fuktetpapirhåndkle. </li><li> Fjern den frigjorte coverglass ved å ta tak det med en fin tippet pinsett og vippe den unna og av brønnen. I dette tilfellet, forblir den kubiske fase fast og på plass på basisplaten av brønnen. </li><li> Zoome inn for å få et klarere syn på kubikk mesofase som nå er klart til bruk i krystall høsting. </li></ol> 4. Åpning av en godt med Cubic mesofase. Metode 2 <ol><li> Hjelp av glasset kutteverktøy vurdering rette, parallelle linjer i coverglass til en side av brønnen og som strekker seg over godt selv. Dette muliggjør enklere pinsett tilgang til og fjerning av coverglass. </li></ol> I dette spesielle demonstrasjonen, sprekker coverglass i frigjøre coverglass fra den klebrige spacer overflaten. I prosessen skifter coverglass i posisjon og fellingsmidlet skiller fra den kubiske fase. Når coverglass løftes noen av fellingsmidlet går med det. Vi sitter igjen med en utsatt bolus av mesofase uten omkringliggende precipitant. Umiddelbart, tilsett 1 pl frisk precipitant oppå bolus med en mikropipette for å hindre at mesofase tørker ut og gjennomgår en faseendring som kan skade krystaller. Bolusen er nå klar til å bli brukt i krystall høstingen. 5. Åpning av en godt med svamp fase. Mislykkes Svampen fasen er mindre tilgivende å arbeide med på grunn av sin evne til å flyte. Hvis som flyter resultater i svampen fasen kontakter omkretsen av brønnen kapillaritet vil trekke ut mesofase og krystallene vil gå tapt. Et eksempel på dette skjer er vist i dette videoklippet. <ol><li> Zoom inn på svamp fase og bytte frem og tilbake mellom normal og krysset polarisert lys for å finne krystaller i svampen fase. </li><li> I forberedelsene for å åpne godt score og kutte coverglass som beskrevet i § 3. I prosessen sprekker coverglass. I forsøking å åpne brønnen de fellingsmidlet skift i retning av sprekken og til slutt det kommer i kontakt med avstandsstykket. Med fellingsmidlet går noen av svampen fase og dets last av krystaller som er tapt. </li></ol> I denne spesielle sekvens, blir polarisatorene på mikroskop ikke helt krysset og krystallene kan ses som lyse objekter samtidig at brønnen og dens innhold forblir synlig. 6. Åpning av en godt med svamp fase. Vellykket <ol><li> Zoom inn på svampen fasen og identifisere en krystall både i normal og krysset polarisert lys. </li><li> Score, kutte og fjerne en del av coverglass dekker godt, som i § 4.1. Ufullstendig krysset polarisert lys brukes til å holde styr på krystallen. </li><li> Innføre et stykke tørt silkepapir gjennom åpningen i coverglass og inn i brønnen inntil det bare berører fellingsmidlet løsningen. Veken vekk løsningen forsiktigly inntil det er nesten alle borte og fjern vevet. Dette fører til at gjenværende precipitant og svamp fase med krystall fortsatt på plass, for å trekke under coverglass. </li><li> Score, kutte og fjerne med en pinsett resten av coverglass, som i avsnitt 4.1. I dette tilfellet, deler svamp fasen, noen forblir i brønnen og noen pinner til coverglass. Krystallen er i bolusen på coverglass. Fordi det er svært lite precipitant stede, begynner svamp fase å gjennomgå en faseovergang sannsynlig på grunn tørker ut. Dette kan sees som en ring av dobbeltbrytningen som migrerer mot midten av bolus. Straks legge precipitant til bolus for å stoppe overgangen. Bolusen er nå klar til bruk i krystall høsting. </li></ol> 7. Høsting og Cryo-kjøling Crystals fra Cubic fase <ol><li> Gå frem og tilbake mellom normal og krysset polarisert lys for å finne krystaller i den kubiske fase bolus i åpne godt. I thans videosekvens opptil fire dobbeltbrytende krystaller kan sees i den kubiske fase bolus med kryss polarisert lys. </li><li> Bruk en montert Cryo-bue (fig. 5) til å undersøke den ferskt eksponert mesofase for krystaller, å fiske ut krystaller og deretter å stupe dem inneholdt i Cryo-buen, i flytende nitrogen i Dewar umiddelbart ved høsting. Ideelt sett bør høsting og snap-kjøling skje i en sammenhengende og rask bevegelse. Så lite overholde mesofase som mulig bør høstes med krystallen. I vår erfaring, er Cryo-protectant ikke nødvendig med i meso-dyrket krystaller. </li><li> Siden det ikke er mulig å se etter krystall i Cryo-loop øyeblikkelig etter høsting inspisere mesofase bolus brukes til høsting å verifisere at krystallen er ikke lenger der tyder på at det ble høstet vellykket. </li></ol> 8. Høsting og Cryo-kjøling Crystals fra Sponge fase <ol><li> Gå frem og tilbake mellom normal og krysset polarisert lys for å finne krystaller i svampen fase bolus i åpne godt. I denne videosekvensen mange dobbeltbrytende krystaller kan sees i bolus henhold kryssede polarisert lys. </li><li> Bruk en montert Cryo-bue (figur 5) for å fiske ut krystaller fra svampen fase og å stupe dem inneholdt i eller på cryoloop, i flytende nitrogen i Dewar umiddelbart ved høsting. Som med høsting fra den kubiske fase, ideelt sett, bør Cryo-kjøleprosessen skje umiddelbart krystall er høstet med så lite tid som mulig elapsing mellom faktisk høsting hendelsen og stuper inn flytende nitrogen. Så lite følger svamp fase som mulig bør høstes med krystall. Som nevnt, er Cryo-beskyttelsesmiddel ikke nødvendig med i meso-dyrket krystaller. </li></ol> 9. Lagring krystaller i Dewars <ol><li> Etter å ha dyttet den montert sløyfe til flytende niTrogen plasserer den i en av de holder sporene lagring pucken i skum Dewar. Alle manipulasjoner er ferdig med sløyfen, at toppen av den magnetiske stav og pucken neddykket i flytende nitrogen. </li><li> Markere plasseringen og detaljene i de høstet og Cryo-avkjølte krystall i den bærbare datamaskinen og / eller på datamaskinen. </li><li> Når pucken i skum Dewar er full eller høsting for dagen er ferdig overføring pucken inn en henlagt puck holder i et lager eller en transport Dewar fylt med flytende nitrogen. Krystaller kan sendes i transport Dewars til synkrotronanlegg for diffraksjon datainnsamling. </li></ol> 10. Representant Resultater Målsettingen for høsting og Cryo-kjøling øvelser demonstrert her er å overføre en krystall fra hosting mesofase inn Cryo-buer, til vitrify den bøyde krystall og å plassere den i lagring i flytende nitrogen i en Dewar. Den ideelle situasjonen er der høsting og cryo-kjøling er gjort på en slik måte at diffraksjon kvaliteten av krystallen er bevart i prosessen. Så lite mesofase som mulig bør høstes med krystallen. Dette er for å gjøre lokalisere krystall og sentrere den i røntgenstråle at mye mindre utfordrende, for å øke hastigheten Cryo-avkjøling med sikte på forglassing, og for å minimere forstyrrende bakgrunnsflekker fra mesofase under diffraksjon datainnsamling. Noen eksempler på Cryo-avkjølte prøver der krystallen kan og ikke kan ses er vist i figur 6. Der krystallen ikke kan ses av øyet er det vanligvis nødvendig å ty til diffraksjon rastering for å finne den krystall og å sentrere det i strålen for datainnsamling 27. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Skjematisk fremstilling av en biologisk membran som viser lipid dobbeltlag i og på som are ligger en rekke proteiner. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. En fullastet og forseglet 96-brønns glassplate-sandwich krystallisering plate. Hver brønn inneholder 50 nl kubikk fase og 1 pl precipitant løsning. For å tydeliggjøre den kubiske fase blitt farget med Sudan Rød og precipitant løsningen inkluderer metylenblått. Fra 5 Reference. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3. Krystaller av membran proteiner som vokser i lipidic mesofase. A. Den kubiske fase med en krystall av bacteriorhodopsin fra H. halobium. B. svamp fase inneholdende en krystall av vitamin B12 reseptor / transporter, BtuB, fra E. coli. Fra 25 Reference. De kubikk og svamp fasene har kontrasterende appearances er så åpenbare ved å sammenligne panelene A og B. Den kubiske fase i A er ekstremt viskøse og beholder sin opprinnelige form. Det ikke flyter. Dette er særlig tydelig ved kantene av de mesofase bolus som har en ru utseende. Kontrakt, er svamp fase betydelig mindre viskøs og det renner. Dermed mislykkes svamp fase for å beholde sin opprinnelige form og kantene er karakteristisk glatt. Utfellingsmidler som inkluderer Jeffamine, 400 PEG, 2-metyl-2 ,4-pentandiol, pentaerytritol propoksylat, butandiol og heksandiol, kan resultere i en overgang fra den kubiske til svampen fase 4,26. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig4.jpg" alt="Figur 4" /> Figur 4. Flytdiagrammet oppsummerer trinnene involvert i produksjon, høsting og Cryo-kjøling av i meso-dyrket membran protein krystaller (A). Bare de trinnene omgitt av den stiplede rødelinje, og som er beskrevet i detalj i (B), er dekket i denne Jove artikkelen. Panel A er fra Reference 3. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4001/4001fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> . <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig5.jpg" alt="Figur 5" /> Figur 5. En tom Cryo-løkke montert på en pinne som er holdt på plass på en magnetisk stav. Utvidede utsikt over pinnen (A) og mikro-mount (B) i denne viktige verktøy for høsting og Cryo-kjøling vises. Den tomme løkken i enden av mikro-braketten i B er 30 pm i diameter. Mens ikke å ha testet andre sløyfeenheter typer omfattende, finner vi at MiTeGen looper vist fungerer godt med både kubikk og svamp faser. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig6.jpg" alt="Figur 6" /> Figur 6. Høstet og Cryo-avkjølte krystaller av membran proteiner i Cryo-buer som vist med et in-line på et mikroskop synkrotron beamline. A, B. Eksempler på høstes krystaller (caa3 cytokrom oksidase 34 (A), diacylglycerol kinase, DgkA (B)) der krystaller (blå pil) er synlig gjennom Cryo-avkjølte mesofase på en Cryo-loop. C. Eksempel på hvor slaktet krystall er ikke synlig i Cryo-avkjølte mesofase på en Cryo-loop. Spissen av loopen identifiseres med en rød pil. Den følger Cryo-avkjølte mesofase er identifisert med en blå pil.

<ol>
	<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination:+use+of+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure determination: use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li><li>Caffrey, M., Li, D., Dukkipati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+structure+determination+using+crystallography+and+lipidic+mesophases+-+recent+advances+and+successes.">Membrane protein structure determination using crystallography and lipidic mesophases - recent advances and successes.</a> Biochemistry. , (2012).</li><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protocols. 4, 706-731 (2009).</li><li>Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room+to+move:+crystallizing+membrane+proteins+in+swollen+lipidic+mesophases.">Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases.</a> J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).</li><li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases.">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).</li><li>Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Setvens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor.">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li><li>Chien, E. Y., Liu, W., Zhao, Q., Katritch, V., Han, G. W., Hanson, M. A., Shi, L., Newman, A. H., Javitch, J. A., Cherezov, V., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+dopamine+D3+receptor+in+complex+with+a+D2/D3+selective+antagonist.">Structure of the human dopamine D3 receptor in complex with a D2/D3 selective antagonist.</a> Science. 330, 1091-1095 (2010).</li><li>Granier, S., Manglik, A., Kruse, A. C., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Weis, W. I., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+delta-opioid+receptor+bound+to+naltrindole.">Structure of the delta-opioid receptor bound to naltrindole.</a> Nature. 485, 400-404 (2012).</li><li>Haga, K., Kruse, A. C., Asada, H., Yurugi-Kobayashi, T., Shiroishi, M., Zhang, C., Weis, W. I., Okada, T., Kobilka, B. K., Haga, T., Kobayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+M2+muscarinic+acetylcholine+receptor+bound+to+an+antagonist.">Structure of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor bound to an antagonist.</a> Nature. 482, 547-551 (2012).</li><li>Hanson, M. A., Roth, B., Jo, E., Griffith, M. T., Scott, F. L., Reinhart, G., Desale, H., Clemons, B., Cahalan, S. M., Schuerer, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+lipid+G+protein-coupled+receptor.">Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptor.</a> Science. 335, 851-855 (2012).</li><li>Jaakola, V. P., Griffith, M. T., Hanson, M. A., Cherezov, V., Chien, E. Y., Lane, J. R., Ijzerman, A. P., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2.6+angstrom+crystal+structure+of+a+human+A2A+adenosine+receptor+bound+to+an+antagonist.">The 2.6 angstrom crystal structure of a human A2A adenosine receptor bound to an antagonist.</a> Science. 322, 1211-1217 (2008).</li><li>Kruse, A. C., Hu, J., Pan, A. C., Arlow, D. H., Rosenbaum, D. M., Rosemond, E., Green, H. F., Liu, T., Chae, P. S., Dror, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+the+M3+muscarinic+acetylcholine+receptor.">Structure and dynamics of the M3 muscarinic acetylcholine receptor.</a> Nature. 482, 552-556 (2012).</li><li>Manglik, A., Kruse, A. C., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Mathiesen, J. M., Sunahara, R. K., Pardo, L., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Granier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+micro-opioid+receptor+bound+to+a+morphinan+antagonist.">Crystal structure of the micro-opioid receptor bound to a morphinan antagonist.</a> Nature. 485, 321-326 (2012).</li><li>Rasmussen, S. G., Choi, H. J., Fung, J. J., Pardon, E., Casarosa, P., Chae, P. S., Devree, B. T., Rosenbaum, D. M., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Schnapp, A., Konetzki, I., Sunahara, R. K., Gellman, S. H., Pautsch, A., Steyaert, J., Weis, W. I., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+nanobody-stabilized+active+state+of+the+beta(2)+adrenoceptor.">Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor.</a> Nature. 469, 175-180 (2011).</li><li>Rasmussen, S. G. F., Devree, B. T., Zou, Y., Kruse, A. C., Chung, K. Y., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Chae, P. S., Pardon, E., Calinski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal++structure+of+the+&#946;2+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex.">Crystal structure of the &#946;2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li><li>Rosenbaum, D. M., Cherezov, V., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Yao, X. J., Weis, W. I., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCR+engineering+yields+high-resolution+structural+insights+into+beta2-adrenergic+receptor+function.">GPCR engineering yields high-resolution structural insights into beta2-adrenergic receptor function.</a> Science. 318, 1266-1273 (2007).</li><li>Rosenbaum, D. M., Zhang, C., Lyons, J. A., Holl, R., Aragao, D., Arlow, D. H., Rasmussen, S. G., Choi, H. J., Devree, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+an+irreversible+agonist-beta(2)+adrenoceptor+complex.">Structure and function of an irreversible agonist-beta(2) adrenoceptor complex.</a> Nature. 469, 236-240 (2011).</li><li>Shimamura, T., Shiroishi, M., Weyand, S., Tsujimoto, H., Winter, G., Katritch, V., Abagyan, R., Cherezov, V., Liu, W., Han, G. W., Kobayashi, T., Setvens, R. C., Iwata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+histamine+H1+receptor+complex+with+doxepin.">Structure of the human histamine H1 receptor complex with doxepin.</a> Nature. 475, 65-70 (2011).</li><li>Thompson, A. A., Liu, W., Chun, E., Katritch, V., We, H., Vardy, E., Huang, X. P., Trapella, C., Guerrini, R., Calo, G., Roth, B. L., Cherezov, V., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+nociceptin/orphanin+FQ+receptor+in+complex+with+a+peptide+mimetic.">Structure of the nociceptin/orphanin FQ receptor in complex with a peptide mimetic.</a> Nature. 485, 395-399 (2012).</li><li>Wu, B., Chien, E. Y., Mol, C. D., Fenalti, G., Liu, W., Katritch, V., Abagyan, R., Brooun, A., Wells, P., Bi, F. C., Hamel, D. J., Kuhn, P., Handel, T. M., Cherezov, V., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+CXCR4+Chemokine+GPCR+with+Small-Molecule+and+Cyclic+Peptide+Antagonists.">Structures of the CXCR4 Chemokine GPCR with Small-Molecule and Cyclic Peptide Antagonists.</a> Science. 330, 1066-1071 (2010).</li><li>Wu, H., Wacker, D., Mileni, M., Katritch, V., Han, G. W., Vardy, E., Liu, W., Thompson, A. A., Huang, X. P., Carroll, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+kappa-opioid+receptor+in+complex+with+JDTic.">Structure of the human kappa-opioid receptor in complex with JDTic.</a> Nature. 485, 327-332 (2012).</li><li>Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+structure+determination+of+GPCRs,+a+membrane+protein+family+with+high+potential+as+pharmaceutical+targets.">Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets.</a> Methods Mol. Biol. 654, 141-168 (2010).</li><li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast,+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins.">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picolitre-scale+crystallization+of+membrane+proteins.">Picolitre-scale crystallization of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 39, 604-606 (2006).</li><li>W&#246;hri, A. B., Johansson, L. C., Wadsten-Hindrichsen, P., Wahlgren, W. Y., Fischer, G., Horsefield, R., Katona, G., Nyblom, M., Oberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Lipidic-Sponge+Phase+Screen+for+Membrane+Protein+Crystallization.">A Lipidic-Sponge Phase Screen for Membrane Protein Crystallization.</a> Structure. 16, 1003-1009 (2008).</li><li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rastering+strategy+for+screening+and+centring+of+microcrystal+samples+of+human+membrane+proteins+with+a+sub-10+microm+size+X-ray+synchrotron.">Rastering strategy for screening and centring of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 microm size X-ray synchrotron.</a> 6, 587-597 (2009).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lipid's+eye+view+of+membrane+protein+crystallization+in+mesophases.">A lipid's eye view of membrane protein crystallization in mesophases.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 486-497 (2000).</li><li>Briggs, J., Chung, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+temperature-composition+phase+diagram+and+mesophase+structure+characterization+of+the+monoolein/water+system.">The temperature-composition phase diagram and mesophase structure characterization of the monoolein/water system.</a> J. Phys. Ii. 6, 723-751 (1996).</li><li>Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phase+diagram+of+the+monoolein/water+system:+metastability+and+equilibrium+aspects.">The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects.</a> Biomaterials. 21, 223-234 (2000).</li><li>Misquitta, Y., Cherezov, V., Havas, F., Patterson, S., Mohan, J. M., Wells, A. J., Hart, D. J., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+lipid+for+membrane+protein+crystallization.">Rational design of lipid for membrane protein crystallization.</a> J. Struct. Biol. 148, 169-175 (2004).</li><li>Caffrey, M., Porter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+Membrane+Proteins+for+Structure+Determination+using+Lipidic+Mesophases.">Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases.</a> J. Vis. Exp. , e1712 (2010).</li><li>Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+robot+for+high-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophase.">Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophase.</a> J. Vis. Exp. , e4000 (2012).</li><li>Lyons, J. A., Aragao, D., Slattery, O., Pisliakov, A. V., Soulimane, T., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+insights+into+electron+transfer+in+caa(3)-type+cytochrome+oxidase.">Structure insights into electron transfer in caa(3)-type cytochrome oxidase.</a> Nature. 10, (2012).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

I denne videoen artikkelen viste vi hvordan krystaller vokst i en lipidic mesofase er høstet og Cryo-avkjølt i forberedelse til bruk i diffraksjon datainnsamling og til slutt for strukturbestemmelse. Hosting mesofase kan være viskøs og klebrig kubiske fase eller mer flytende svamp fase 4. Hvordan glass sandwich-platene er åpnet og hvordan krystaller er høstet svært mye avhenger mesofase type. Det er derfor viktig å vite hvilke av de to til en arbeider med på forhånd. Identiteten av hosting lipid og fellingsmidlet brukes er viktig i denne sammenheng, og det fysiske utseendet av mesofase bolus i krystallisering brønnen kan brukes til å skille dem fra hverandre (figur 3). Høsting fra begge mesofase typene ble illustrert i denne artikkelen. Høsting små krystaller fra en lipidic mesofase i glass sandwich-plater er en møysommelig prosess som krever tid, ferdigheter, kompetanseience, tålmodighet og en stødig hånd. Det er viktig å sette av en passende mengde tid for høsting og å sette opp laboratoriet slik at alle forsyninger og utstyr er for hånden på forhånd. En annen person til å hjelpe til med innhøstingen er ikke viktig, men anbefales. Denne personen kan hjelpe med å levere pre-merkede platene til den enkelte gjør innhøsting samt å plassere Cryo-avkjølte montert looper med høstes krystaller i lagringsposisjon pucken. Assistenten kan også spille en viktig støtte rolle i å dokumentere observasjoner om krystaller gjort under høsting som kan vise seg avgjørende i løpet diffraksjon datainnsamling. I fravær av en assistent, kan en stemme-aktivert lydopptaksfunksjonen enheten med fordel brukes for dokumentasjon. Etter protokollen beskrevet i denne artikkelen vil bidra til å få Viewer opp og kjører med krystall høsting. Imidlertid er det viktig å forstå at prosessen er ikke enkelt, og at practice er nødvendig før du starter i høsting verdifulle membran protein krystaller. Det anbefales derfor at test plater med krystaller av proteiner som ikke er særlig verdifulle bli eksperimentert med første. Dette vil gi neophyte med verdifull erfaring i å kutte glass, fjerning av glasskår, løfte opp coverglass fra over mesofase, ved hjelp av polariserende funksjonen på mikroskop for å se krystaller og for å spore dem under høsting, og til slutt håndterer ulike typer mesophases og høsting fra dem. Teksturen i mesofase, og i forlengelsen av den enkle som krystaller kan høstes, forandrer seg med tiden under krystallisering. Det er derfor viktig å øve høsting med mindre verdifulle krystaller men med de som har vokst under de samme betingelser som de mer verdifulle de. Det er mulig å dyrke krystaller av lysozym og thaumatin ved in meso eller lipidic kubiske fase metode 28 og disse bør vurderesavfallsbeholder med måte å få kjennskap til materialer og metode. Man bør også vurdere å arbeide med protein-fri mesofase første til å lære av sine påfunn. Prosedyrene Her demonstreres var alle gjøres på en komfortabel 20 ° C eller deromkring. Det er mulig å dyrke krystaller ved in meso metoden ved lavere temperaturer. Således kan monoolein som hosting lipid i en metastabil fase tilstand brukes ved 4 ° C 1,2,29,30. Et alternativ er å bruke rasjonelt utformet 7,9 MAG for lav temperatur krystallisering 31. Vi gjør lav temperatur crysallogenesis rutinemessig med visse membran protein mål. I dette tilfellet, blir krystallvekst og høsting gjort i en walk-in 4 ° C kjøleskap. Arbeider under slike forhold har sine egne utfordringer ikke minst som er behovet for varme og komfortable antrekk. Det neste trinnet i den totale prosessen med strukturbestemmelse hjelp makromolekylære krystalltallography er å samle diffraksjon data på krystaller høstet og snap-avkjølt som demonstrert i denne artikkelen. I meso-vokst krystaller er vanligvis små. Imidlertid har nyttige diffraksjon datainnsamling vært mulig med krystaller som har en maksimal dimensjon på 20 um 9. For dette formålet, er mikro-bjelke synkrotron X-stråling brukes og er fokus for en egen Jove artikkel i denne serien 32,33.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Komponenter </td></tr><tr><td> Buede pinsett </td><td> Sigma </td><td> F4142 </td><td> Tool </td></tr><tr><td> Disponibel pipettespisser </td><td> Gilson </td><td> Various </td><td> Disposable </td></tr><tr><td> Skum Dewar </td><td> Spearlab </td><td> FD-500 </td><td> Tool </td></tr><tr><td> Glass og metall avfallsbeholdere </td><td> Daniels Healthcare </td><td> DD479OL </td><td> Tool </td></tr><tr><td> Innhøsting looper </td><td> MiTeGen </td><td> Various </td><td> Tool </td></tr><tr><td> Høsting mikroskop </td><td> Nikon </td><td> SMZ1500 </td><td> Tool </td></tr><tr><td> Lab bærbare </td><td> Various </td><td> NA </td><td> Tool </td></tr><tr><td> Magnetic trykkknapp prøve lasting tryllestav </td><td> Hampton Forskning / Molecular Mål </td><td> HR4-729/MD7-411 </td><td> Tool </td></tr><tr><td> Original Puck (for bruk med ALS-stil roboter bare) </td><td> Krystall Positioning Systems </td><td> CP-111-035 </td><td> Tool </td></tr><tr><td> Pipetteringsutstyr </td><td> Gilson </td><td> Various </td><td> Tool </td></tr><tr><td> Precipitant løsninger </td><td> Various </td><td> Various </td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Puck Bent Cryo-Tong </td><td> Krystall Positioning Systems </td><td> CP-111-030 </td><td> Tool </td></tr><tr><td> Puck skrinlagt Shipping Cane (originale ALS-stil) med hekta håndtak og låsing stang </td><td> Krystall Positioning Systems </td><td> CP-111-029 </td><td> Tool </td></tr><tr><td> Renset vann </td><td> Millipore </td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Vernebriller </td><td&gt; Diverse </td><td> NA </td><td> Tool </td></tr><tr><td> Sample Pin Bases - Magnetisk (ikke-kobber) </td><td> Krystall Positioning Systems </td><td> CP-111-015 </td><td> Tool </td></tr><tr><td> Shipping Dewar </td><td> Taylor-Wharton </td><td> CX100 </td><td> Tool </td></tr><tr><td> Vev </td><td> NA </td><td> NA </td><td> Disposable </td></tr><tr><td> Wolframkarbid glass cutter (TCT abonnent) </td><td> SILVERLINE Tools (Yeovil, UK) </td><td> 633657 </td><td> Tool </td></tr></tbody></table>

harvesting and cryo-cooling crystals of membrane proteins grown in lipidic mesophases for structure determination by macromolecular crystallography

En viktig vei til hvordan proteiner fungere på en mekanistisk nivået er å ha strukturen av målproteinet tilgjengelig, ideelt på atom oppløsning. For tiden er det bare en måte å fange opp slik informasjon som brukes til integrerte membran proteiner (Figur 1), og de ​​komplekser de danner, og at metoden er makromolekylær røntgenkrystallografi (MX). Å gjøre MX diffraksjon kvalitet krystaller for som, i tilfelle av membran proteiner, ikke danner lett. En metode for utkrystalliserer membran proteiner som innebærer bruk av lipidic mesophases, spesielt de kubikk og svamp faser 1-5, har fått betydelig oppmerksomhet i det siste på grunn av suksesser den har hatt i G protein-koblet reseptor feltet 6-21 ( <a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www . mpdb.tcd.ie</a> ). Imidlertid metoden, heretter referert til som i meso eller lipidic kubiske fase metoden, kommer med sin egen tekniskeutfordringer. Disse oppstår, delvis grunnet generelt viskøs og klebrig natur lipidic mesofase hvor krystaller, som ofte er mikro-krystaller, vokse. Manipulere krystallene blir vanskelig som et resultat, og spesielt så ved innhøstingen 22,23. Problemer oppstår også ved trinnet som går forut høsting som krever at glass sandwich-platene der krystallene vokser (figur 2) 24,25 åpnes for å eksponere mesofase bolus, og krystallene deri, for høsting, Cryo-kjøling og eventuell X -ray diffraksjon datainnsamling. De kubikk og svamp mesofase varianter (figur 3) som krystaller må høstes har dypt forskjellige rheologies 4,26. Den kubiske fase er viskøs og klebrig beslektet til en tykk tannkrem. Derimot, er svamp fasen mer væske med en tydelig tendens til å flyte. Følgelig ulike tilnærminger for å åpne krystallisering brønner containing krystaller vokser i den kubiske og svampen fasen kalles for som faktisk forskjellige metoder kreves for høsting krystaller fra de to mesofase typer. Protokoller for å gjøre nettopp det har blitt raffinert og implementert i membranen strukturelle og funksjonelle Biologi (MS &amp; FB) Gruppe, og er beskrevet i detalj i denne Jove artikkelen (figur 4). Det gis eksempler på situasjoner der krystaller er vellykket høstes og Cryo-avkjølt. Vi også gi eksempler på saker hvor det oppstå problemer som fører til uopprettelig tap av krystaller og beskrive hvordan disse problemene kan unngås. I denne artikkelen Viewer er utstyrt med steg-for-trinn-instruksjoner for å åpne glass sandwich-krystallisering brønner, for høsting og for Cryo-kjøling krystaller av membran proteiner som vokser i kubikk og i svamp faser.

Watch this Scientific Journal Video about Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography at JoVE.co

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Her er beskrevet rutiner er implementert i Caffrey Membran strukturelle og funksjonelle biologi, for å høste og Cryo-cool membran protein krystaller vokst i lipidic kubikk og svamp faser for bruk i strukturbestemmelse hjelp macromolecular røntgenkrystallografi.

Høsting og Cryo-kjøling Krystaller av membran proteiner Grown i Lipidic Mesophases for strukturbestemmelse av Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Research

JoVE Journal

Biology

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

High-throughput krystallisering av membran proteiner Bruke Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Bruk av en robot for High-throughput Krystallisering av membran proteiner i Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intramikros for Imaging subcellulære strukturer i levende mus Uttrykke Fluorescent Proteiner

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Immunodeteksjonsprosedyren av yttermembran Proteiner med flowcytometri av Isolated Mitokondrier

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grønn Fluorescent Protein-baserte Expression Screening av membran proteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...