Name: planarian immobilization, partial irradiation, and tissue transplantation
Uploaded: 2012-08-06T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Chiyoko Kobayashi og Kiyokazu Agata for nyttige råd om planarian transplantasjon, samt tidligere og nåværende medlemmer av Sánchez lab for uvurderlige diskusjoner under utviklingen av disse teknikkene. Dette arbeidet ble støttet av NIH Training Grant (5T32 HD0791) til OCG og NIH R37GM057260 til ASA. ASA er en Howard Hughes Medical Institute etterforsker.

Merk: denne protokollen tilsier bruk av potensielt farlige stoffer (bly og chloretone). Anskaffe, lese, og følge HMS-datablad for alle potensielt farlige materialer. 1. Animal Kultur, merking og klargjøring <ol><li> For dyr kultur og manøvreringer planarian vann (1x Montjuic salter 9) og plast overføre pipetter. </li><li> Seksuell biotype Schmidtea Mediterranea kan brukes når opp i laboratoriet under normale kultur forhold 10. Å produse...

<ol>
	<li>Morgan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+studies+of+the+regeneration+of+Planaria+maculata.">Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata.</a> Arch. Entw. Mech. Org. 7, 364-397 .</li><li>Reddien, P. W., Sanchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+planarian+regeneration.">Fundamentals of planarian regeneration.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 725-757 (2004).</li><li>Randolph, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regeneration+of+the+tail+in+lumbriculus.">The regeneration of the tail in lumbriculus.</a> J. Morphol. 7, 317-344 .</li><li>Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+neoblasts+are+pluripotent+adult+stem+cells+that+underlie+planarian+regeneration.">Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration.</a> Science. 332, 811-816 (2011).</li><li>Santos, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transplantation+in+planaria.">Studies on transplantation in planaria.</a> Biological Bulletin. 57, 188-197 (1929).</li><li>Morgan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+grafted+pieces+of+planarians.">Regeneration of grafted pieces of planarians.</a> J. Exp. Zo&#246;l. 3, 269-294 (1906).</li><li>Dubois, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+&#225;+l+'&#232;tude+de+la+migration+des+cellules+de+règènèration+chez+les+Planaires+dulcicoles.">Contribution &#225; l '&#232;tude de la migration des cellules de règènèration chez les Planaires dulcicoles.</a> Bull. Biol. Fr. Belg. 83, 213-283 (1949).</li><li>Purton, L. E., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+factors+in+murine+hematopoietic+stem+cell+assays.">Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays.</a> Cell Stem Cell. 1, 263-270 (2007).</li><li>Cebria, F., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarian+homologs+of+netrin+and+netrin+receptor+are+required+for+proper+regeneration+of+the+central+nervous+system+and+the+maintenance+of+nervous+system+architecture.">Planarian homologs of netrin and netrin receptor are required for proper regeneration of the central nervous system and the maintenance of nervous system architecture.</a> Development. , 132-3691 (2005).</li><li>Newmark, P. A., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bromodeoxyuridine+specifically+labels+the+regenerative+stem+cells+of+planarians.">Bromodeoxyuridine specifically labels the regenerative stem cells of planarians.</a> Dev. Biol. 220, 142-153 (2000).</li><li>Miller, W., Kennedy, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+attenuation+in+lead,+aluminum,+and+concrete+in+the+range+275+to+525+kilovolts.">X-ray attenuation in lead, aluminum, and concrete in the range 275 to 525 kilovolts.</a> Radiology. 65, 920-925 (1955).</li><li>Pearson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-based+whole-mount+in+situ+hybridization+method+for+planarians.">Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians.</a> Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).</li><li>Hayashi, T., Asami, M., Higuchi, S., Shibata, N., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+planarian+X-ray-sensitive+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of planarian X-ray-sensitive stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Dev. Growth Differ. 48, 371-380 (2006).</li><li>Reddien, P. W., Oviedo, N. J., Jennings, J. R., Jenkin, J. C., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMEDWI-2+is+a+PIWI-like+protein+that+regulates+planarian+stem+cells.">SMEDWI-2 is a PIWI-like protein that regulates planarian stem cells.</a> Science. 310, 1327-1330 (2005).</li><li>St&#233;phan-Dubois, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+cellules+de+r&#233;g&#233;n&#233;ration+chez+la+planaire+Dendrocoleum+lacteum.">Les cellules de r&#233;g&#233;n&#233;ration chez la planaire Dendrocoleum lacteum.</a> Bulletin de la Société Zooologique de France. 86, 172-185 (1961).</li><li>Gurley, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+secreted+Wnt+pathway+components+reveals+unexpected+complexity+of+the+planarian+amputation+response.">Expression of secreted Wnt pathway components reveals unexpected complexity of the planarian amputation response.</a> Dev. Biol. 347, 24-39 (2010).</li><li>Salvetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+stem+cell+plasticity:+neoblast+repopulation+in+non-lethally+irradiated+planarians.">Adult stem cell plasticity: neoblast repopulation in non-lethally irradiated planarians.</a> Dev. Biol. 328, 305-314 (2009).</li></ol>

Viktigheten av immobilisering Immobilisering er langt den mest kritiske trinnet for en vellykket gjennomføring av noen av disse prosessene. Hvis planaria har feil immobilisert før delvis bestråling, kan de flytte under ledelsen skjold, produsere inkonsistente og confounding resultater. I tillegg, hvis dyrene er utilstrekkelig immobilisert etter en transplantasjon, vil verten ormen trolig bevege seg bort fra transplantatet vev, noe som resulterer i en fiasko av graftet å gro skikkelig til ve...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagensen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> General Purpose overføringspipetten </td><td> Samco </td><td> 691 </td></tr><tr><td> Kapillærrør (ID 0,75 mm) </td><td> FHC </td><td> 30-30-0 </td></tr><tr><td> Kapillærrør (OD 0,7 mm) </td><td> FHC </td><td> 30-50-08 </td></tr><tr><td> Parafilm M </td><td> VWR </td><td> 52858-076 </td></tr><tr><td> Kimwipes 34155 </td><td> VWR </td><td> 500029-891 </td></tr><tr><td> Svart filter papir </td><td> Schleicher &amp; Schuell </td><td> 10310809 </td></tr><tr><td> Whatman # 2 filter papir 1002-055 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-810B </td></tr><tr><td> Whatman # 3 filter papir 1003-185 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-820E </td></tr><tr><td> Sigarettpapir rullende papir </td><td> Zig-Zag, original </td><td> NA </td></tr><tr><td> Petriretter </td><td> VWR </td><td> 82050-544 </td></tr><tr><td> Tang Dumont, INOX # 5 </td><td> FST </td><td> 11251-20 </td></tr><tr><td> Chloretone </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 112054 </td></tr><tr><td> Kasein </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C3400 </td></tr><tr><td> Bly Shields </td><td> Alpha Systems Corp, Bluffdale, UT </td><td> Spesialdesign </td></tr><tr><td> XRAD-320 Biologisk Irradiator </td><td> Precision X-Ray, North Branford, CT </td><td> NA </td></tr></tbody></table>

planarian immobilization, partial irradiation, and tissue transplantation

Den planarian, en ferskvann flatworm, har vist seg å være et kraftig system for dissekere metazoan regenerasjon og stilk cellebiologi 1,2. Planarian regenerering av eventuelle mangler eller er skadet vev er gjort mulig ved adulte stamceller kalles neoblasts 3. Selv om disse stamcellene har definitivt vist seg å være pluripotent og bemerkelsesverdig i stand til rekonstituering en hel dyr 4, heterogenitet innen stamcelleforskningen befolkningen og dynamikken i deres cellulære atferd fortsatt i stor grad uløst. På grunn av det store antallet og bred distribusjon av stamceller i hele planarian kroppen planen, blir avanserte metoder for å manipulere subpopulasjoner av stamceller for molekylær og funksjonelle studier in vivo nødvendig. Tissue transplantasjon og delvis bestråling er to metoder som en undergruppe planarian stamceller kan isoleres for videre studier. Hver teknikk har klare fordeler. Tproblemet transplantasjon gjør for innføring av stamceller, i et naivt vert, som er enten iboende genetisk distinkt eller har vært tidligere behandlet farmakologisk. Alternativt kan delvis bestråling for isolering av stamceller i en vert, sammenstilt til vev blottet for stamceller, uten innføring av et sår eller seteleie i vev integritet. Ved hjelp av disse to metodene, kan man undersøke cellen autonome og ikke-autonome faktorer som styrer stamceller funksjoner, for eksempel spredning, differensiering, og migrasjon. Både vev transplantasjon 5,6 og delvis bestråling 7 har blitt brukt historisk i å definere mange av spørsmålene om planarian regenerering som gjenstår under studien i dag. Imidlertid har disse teknikkene forble underused grunn av arbeidskrevende og inkonsekvent natur av tidligere metoder. Protokollene som presenteres her representerer et stort skritt fremover i å redusere den tiden ennd innsats som er nødvendig for å reproduserbart generere store mengder podet eller delvis bestrålt dyr med effektivitet nærmer 100 prosent. Vi dekker kultur av store dyr, immobilisering, forberedelse for delvis bestråling, vev transplantasjon, og optimalisering av dyr utvinning. Videre viser arbeidet som er beskrevet her den første søknaden av den delvise bestråling metode for bruk med den mest studerte planarian, Schmidtea Mediterranea. I tillegg åpner effektiv vev pode i planaria døren for funksjonstesting av subpopulasjoner av naive eller behandlet stamceller i repopulation analyser, som lenge har vært gull-standard metode for å analysere voksen stamcelle potensial i pattedyr 8. Bred bruk av disse teknikkene vil uten tvil føre til en bedre forståelse av de cellulære atferd av adulte stamceller under vev homeostase og regenerering.

Watch this Scientific Journal Video about Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation at JoVE.com

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

En effektiv metode for pode vev av definerte og konsistente størrelse mellom planaria er beskrevet. Inkludert er også en beskrivelse av hvordan immobilisering teknikken brukt for transplantasjon kan tilpasses, i forbindelse med bly skjold, for delvis bestråling av levende dyr.

Planarian Immobilisering, Delvis Bestråling, og Tissue Transplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Skin Transplantation

As one of the most stringent and least technically challenging models, skin transplantation is a standard method to assay host T cell responses to ...

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Germ Cell Transplantation og testis Tissue Xenografting i Mus

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Rapid isolering og rensing av Mitokondrier for transplantasjon Av Tissue Dissosiasjon og differensial Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

A Mouse Model of Intestinal Partial Obstruction

En musemodell av Intestinal delvis hindringer

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including ...

Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing

Planarian scrunching som en kvantitativ atferdslesning for skadelige Stimuli Sensing

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce ...