Name: in ovo electroporation in chick midbrain for studying gene function in dopaminergic neuron development
Uploaded: 2012-08-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development at JoVE.com

Wij danken Dr Takahiko Matsuda voor het verstrekken van pCAG-mCherry te bouwen. YCM wordt ondersteund door een Career Development Award van de Schweppe Foundation en een subsidie ​​van de Whitehall Foundation.

1. Levering Voorbereiding (niet in video) <ol><li> Bereid een frisse 1x verdunning van penicilline / streptomycine (Pen / Strep) in 1X PBS. Niet meer dan 50 ml noodzakelijk. Filter met een 0,22 pm spuitfilter. </li><li> Bereid injectie constructen door het combineren gewenste plasmide constructen. We hebben allemaal constructies zetten in de pCAG-Flag vector met de juiste stoichiometrie tot een uiteindelijk volume van ~ 10 pl. Ook moet pCAG-GFP 14 of pCAG-mCherry worden toegevoegd voor het bijhouden van ele...

<ol>
	<li>Wightman, R. M., Robinson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+changes+in+mesolimbic+dopamine+and+their+association+with+'reward'.">Transient changes in mesolimbic dopamine and their association with 'reward'.</a> J. Neurochem. 82, 721-735 (2002).</li><li>Kelley, A. E., Berridge, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroscience+of+natural+rewards:+relevance+to+addictive+drugs.">The neuroscience of natural rewards: relevance to addictive drugs.</a> J. Neurosci. 22, 3306-3311 (2002).</li><li>Moore, D. J., West, A. B., Dawson, V. L., Dawson, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathophysiology+of+Parkinson's+disease.">Molecular pathophysiology of Parkinson's disease.</a> Annu. Rev. Neurosci. 28, 57-87 (2005).</li><li>Dailly, E., Chenu, F., Renard, C. E., Bourin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine,+depression+and+antidepressants.">Dopamine, depression and antidepressants.</a> Fundam. Clin. Pharmacol. 18, 601-607 (2004).</li><li>Sesack, S. R., Carr, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+prefrontal+cortex+inputs+to+dopamine+cells:+implications+for+schizophrenia.">Selective prefrontal cortex inputs to dopamine cells: implications for schizophrenia.</a> Physiol. Behav. 77, 513-517 (2002).</li><li>Ang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+midbrain+dopaminergic+neuron+development.">Transcriptional control of midbrain dopaminergic neuron development.</a> Development. 133, 3499-3506 (2006).</li><li>Andersson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+intrinsic+determinants+of+midbrain+dopamine+neurons.">Identification of intrinsic determinants of midbrain dopamine neurons.</a> Cell. 124, 393-405 (2006).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Series+of+Normal+Stages+in+the+Development+of+the+Chick+Embryo.">A Series of Normal Stages in the Development of the Chick Embryo.</a> J. Morphol. 88, 49 (1951).</li><li>Bellairs, R., Osmond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The atlas of chick development. , (2005).</li><li>Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Shocking'+developments+in+chick+embryology:+electroporation+and+in+ovo+gene+expression.">'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).</li><li>Momose, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation.">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).</li><li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).</li><li>Nishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+in+vivo+gene+transfer+using+intraarterial+plasmid+DNA+injection+following+in+vivo+electroporation.">High-efficiency in vivo gene transfer using intraarterial plasmid DNA injection following in vivo electroporation.</a> Cancer Res. 56, 1050-1055 (1996).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16-22 (2004).</li><li>Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Ovo+Electroporations+of+HH+Stage+10+Chicken+Embryos.">In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos.</a> J. Vis. Exp. (9), e408 (2007).</li><li>Chesnutt, C., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-based+short-hairpin+RNA+interference+in+the+chicken+embryo.">Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo.</a> Genesis. 39, 73-78 (2004).</li></ol>

De in ovo elektroporatie van embryonale kuiken middenhersenen biedt lage kosten en snel alternatief voor het genereren van transgene of knockout dieren te voeren in vivo studie genfuncties in middenhersenen dopaminerge ontwikkeling. Met korte 2 mm L-vormige platina elektroden met embryonale middenhersenen specifieke DNA injectie is het van essentieel belang om efficiënte expressie van het gen van interesse in middenhersenen dopaminerge progenitors. Daarnaast, met behulp van de juiste HH stadium 11 kip...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Bevruchte kippeneieren </td><td> Charles River Laboratories </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Egg incubator </td><td> GQF Manufacturing </td><td> 1502 Sportsman </td><td></td></tr><tr><td> BTX Electroporator </td><td> BTX Harvard Apparatuur </td><td> ECM830 </td><td></td></tr><tr><td> Elektroden </td><td> BTX Harvard Apparatuur </td><td> 45-0162 L-vormige genetrodes </td><td> Voor gebruik met ECM830 electroporator </td></tr><tr><td> Platinum iridium draad </td><td> Alfa Aesar </td><td> # 10056 </td><td> 0,5 mm Voor het maken van 2 mm lang elektroden </td></tr><tr><td> Glazen capillair </td><td> Wereld precisie-instrument </td><td> TW100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader pipetpunt </td><td> Eppendorf </td><td> 5242 956.003 </td><td></td></tr><tr><td> Oost-Indische inkt </td><td> Staples </td><td></td><td> Filter 20% voor gebruik </td></tr><tr><td> Microinjector </td><td> Parker Automation, Parker Hannifin Samenwerking </td><td> Picospritzer III </td><td></td></tr><tr><td> TL-dissectie microscoop </td><td> Leica </td><td> MZ16F </td><td></td></tr><tr><td> Micropipet trekker </td><td> Sutter Instrument </td><td> D-97 </td><td></td></tr></tbody></table>

in ovo electroporation in chick midbrain for studying gene function in dopaminergic neuron development

Dopaminerge neuronen in het ventrale middenhersenen controle beweging, emotioneel gedrag en beloning mechanismen 1-3. Het disfunctioneren van ventrale middenhersenen dopaminerge neuronen betrokken is bij de ziekte van Parkinson, schizofrenie, depressie en dementie 1-5. Zo kon het bestuderen van de regulering van de middenhersenen dopaminerge neuron differentiatie niet alleen belangrijk inzicht in de mechanismen tot regeling van middenhersenen ontwikkeling en neurale voorlopercellen lot specificatie, maar ook de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën voor de behandeling van een verscheidenheid van menselijke neurologische aandoeningen. Dopaminerge neuronen te onderscheiden van neurale voorlopercellen langs de ventriculaire zone van de embryonale ventrale middenhersenen. De ontwikkeling van neurale voorlopercellen wordt gecontroleerd door genexpressie-programma&#39;s 6,7. Hier melden wij technieken gebruik te maken van elektroporatie om specifiek te uiten genen in de middenhersenen van Hamburger Hamilton (HH) etappe 11 (eirteen somieten, 42 uur) kippenembryo&#39;s 8,9. De externe ontwikkeling van kippenembryo&#39;s zorgt voor een handige experimentele manipulaties op specifieke embryonale stadia, met de effecten die op een later ontwikkelingstijd punten 10-13. Chick embryonale neurale buizen eerder dan HH stadium 13 (negentien somieten, 48 uur) bestaat uit multipotente neurale voorlopercellen die in staat zijn te differentiëren in verschillende celtypes van het zenuwstelsel. De pCAG vector, die zowel een CMV-promotor en een chick β-actine enhancer bevat, zorgt voor een krachtige uiting van vlag of een andere epitoop-gemerkte constructen in embryonale kuiken neurale buizen 14. In dit rapport, benadrukken we speciale maatregelen voor de regionale beperkte genexpressie te bereiken in embryonale middenhersenen dopaminerge neuron voorouders, met inbegrip van hoe te injecteren DNA-constructen in het bijzonder in de embryonale middenhersenen regio en hoe elektroporatie lokaliseren met kleine custom-made elektroden. Het analyseren van cHick middenhersenen later stadium een uitstekende in vivo voor plasmide vector-gemedieerde gain-of-functie en verlies-van-functie studies van middenhersenen ontwikkeling. Wijziging van de experimentele systeem kan verlengen assay naar andere delen van het zenuwstelsel voor het uitvoeren lot mapping analyse en onderzoeken van de regulering van de genexpressie.

Watch this Scientific Journal Video about In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development at JoVE.com

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Om de functie en de regulatie van genen tijdens de ontwikkeling van middenhersenen dopaminerge neuronen te beoordelen, beschrijven we een methode die inhoudt dat<em&gt; In ovo</em&gt; Elektroporatie van plasmide DNA-constructen in het embryonale kuiken ventrale middenhersenen dopaminerge neuronen voorouders. Deze techniek kan worden gebruikt om efficiënte expressie van genen van interesse te bereiken verschillende aspecten van middenhersenen ontwikkeling dopaminerge differentiatie te bestuderen.

In ovo Elektroporatie in Chick middenhersenen voor het bestuderen van gen-functie in dopaminerge Neuron Ontwikkeling

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Elektroporatie gevolgd door primaire neuronale Cultuur voor het bestuderen van Gene Functie in subset van de corticale neuronen

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfectie van Mouse retinale ganglioncellen door In vivo Elektroporatie

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Muis In Utero Elektroporatie: Gecontroleerde spatiotemporele Gene Transfectie

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypische Slice culturen van embryonale ventrale middenhersenen: Een systeem om Dopaminerge Neuronale Development Study In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dubbele Elektrofysiologische Opnames van synaptisch-opgeroepen astrogliale en Neuronale responsen bij acute hippocampus Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

In ovo Expressie van MicroRNA in ventrale Chick Middenhersenen

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Geregisseerd Dopaminerge Neuron Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

In Vivo Calcium beeldvorming van dwarslijn haarcellen in larvale zebravis

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

Bestuderen van de hersenfunctie bij kinderen met behulp van Liquor

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D Kinematic Analyse voor de functionele evaluatie in het Rattenmodel van Sciatische Zenuwbrekerletsel

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...