Name: in ovo electroporation in chick midbrain for studying gene function in dopaminergic neuron development
Uploaded: 2012-08-03T13:00:00
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Agradecemos ao Dr. Takahiko Matsuda para fornecer o pCAG-mCherry construir. YCM é suportado por um prêmio de Desenvolvimento de Carreira da Fundação Schweppe e uma bolsa da Fundação Whitehall.

1. Fornecimento Preparação (e não em vídeo) <ol><li> Prepare uma diluição fresco 1X de penicilina / estreptomicina (Pen / Strep) em 1X PBS. Não mais do que 50 mL é necessário. Filtrar com um filtro de seringa de 0,22 uM. </li><li> Preparar construções de injecção através da combinação de construções de plasmídeos desejados. Nós colocar todas as construções no vector pCAG-Flag com estequiometria adequada para um volume final de 10 ~ uL. Além disso, pCAG-GFP 14 ou pCAG-mCherry deve ser ...

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	<li>Wightman, R. M., Robinson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+changes+in+mesolimbic+dopamine+and+their+association+with+'reward'.">Transient changes in mesolimbic dopamine and their association with 'reward'.</a> J. Neurochem. 82, 721-735 (2002).</li><li>Kelley, A. E., Berridge, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroscience+of+natural+rewards:+relevance+to+addictive+drugs.">The neuroscience of natural rewards: relevance to addictive drugs.</a> J. Neurosci. 22, 3306-3311 (2002).</li><li>Moore, D. J., West, A. B., Dawson, V. L., Dawson, T. 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A eletroporação em ovo de pinto mesencéfalo embrionário oferece um baixo custo e rápida alternativa para a geração de animais transgênicos ou knockout para realizar estudo in vivo de funções de genes no mesencéfalo de desenvolvimento neurônio dopaminérgico. Usando 2 mm curto eléctrodos de platina longos em forma de L, juntamente com a injecção de DNA embrionário mesencéfalo-específica é a chave para alcançar expressão eficiente do gene de interesse em progenitores do mese...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Ovos de galinha fertilizados </td><td> Charles River Laboratories </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ovo incubadora </td><td> GQF Manufacturing </td><td> 1502 Sportsman </td><td></td></tr><tr><td> BTX Electroporator </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td> ECM830 </td><td></td></tr><tr><td> Eletrodos </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td> 45-0162 em forma de L genetrodes </td><td> Para utilização com ECM830 electroporator </td></tr><tr><td> Irídio Platinum </td><td> Alfa Aesar </td><td> # 10056 </td><td> 0,5 mm de diâmetro Para fazer as 2 mm de comprimento eléctrodos </td></tr><tr><td> Tubo de vidro capilar </td><td> Instrumento de precisão Mundial </td><td> TW100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader pipeta </td><td> Eppendorf </td><td> 5242 956.003 </td><td></td></tr><tr><td> Nanquim </td><td> Staples </td><td></td><td> Filtrar 20% antes da utilização </td></tr><tr><td> Microinjector </td><td> Automação Parker, Parker Hannifin Cooperação </td><td> Picospritzer III </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de dissecção fluorescente </td><td> Leica </td><td> MZ16F </td><td></td></tr><tr><td> Micropipeta extrator </td><td> Instrumento Sutter </td><td> D-97 </td><td></td></tr></tbody></table>

in ovo electroporation in chick midbrain for studying gene function in dopaminergic neuron development

Neurônios dopaminérgicos localizados no mesencéfalo ventral controle movimento, o comportamento emocional, e mecanismos de recompensa 1-3. A disfunção de ventral mesencéfalo dopaminérgica neurónios está implicado na doença de Parkinson, esquizofrenia, depressão, demência e 1-5. Assim, estudando a regulação da diferenciação de neurônios dopaminérgicos no mesencéfalo poderia não apenas fornecer informação importante sobre mecanismos de regulação do desenvolvimento de mesencéfalo e especificação destino neural progenitor, mas também ajudar a desenvolver novas estratégias terapêuticas para o tratamento de uma variedade de distúrbios neurológicos humanos. Neurônios dopaminérgicos diferenciar dos progenitores neurais que revestem a zona ventricular de mesencéfalo ventral do embrião. O desenvolvimento de células progenitoras neurais é controlada por programas de expressão génica 6,7. Aqui relatamos técnicas utilizando eletroporação para expressar genes especificamente no mesencéfalo de estágio Hamburger Hamilton (HH) 11 (thsomitos irteen, 42 horas) embriões de galinha 8,9. O desenvolvimento externo de embriões de galinha permite convenientes manipulações experimentais específicas em estágios embrionários, com os efeitos determinados em momentos posteriores de desenvolvimento 10-13. Tubos pintainho embrionárias neurais mais cedo do que HH fase 13 (dezanove sómitos, 48 ​​horas) consistem em multipotentes progenitores neurais que são capazes de se diferenciar em tipos de células distintas do sistema nervoso. O vector pCAG, que contém tanto um promotor de CMV e um pintainho β-actina potenciador, permite a expressão robusta de Flag ou outras construções de epítopo-etiquetados em tubos de bico embrionárias neurais 14. Neste relatório, destacamos medidas especiais para alcançar a expressão do gene regionalmente restrito em embrionárias mesencéfalo progenitores de neurônios dopaminérgicos, incluindo a forma de injectar DNA constrói especificamente para a região do mesencéfalo embrionário e como identificar eletroporação com pequenos feitos por eletrodos. Analisando cmesencéfalo caipira em fases posteriores proporciona um excelente sistema in vivo para plasmídeo vetor mediada por ganho de função e perda de função de estudos de desenvolvimento mesencéfalo. Modificação do sistema experimental pode prolongar o ensaio para outras partes do sistema nervoso para executar a análise de mapeamento de destino e para investigar a regulação da expressão do gene.

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In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Para avaliar a função e regulação de genes durante o desenvolvimento de neurónios dopaminérgicos do mesencéfalo, nós descrevemos um método que envolve<em&gt; In ovo</em&gt; Electroporação de construções de DNA de plasmídeo em embrionárias de bico ventral do mesencéfalo progenitores de neurónios dopaminérgicos. Esta técnica pode ser utilizada para conseguir a expressão eficiente de genes de interesse para estudar diferentes aspectos do desenvolvimento mesencéfalo e diferenciação neuronal dopaminérgico.

Na eletroporação in ovo em Midbrain pintainho para estudar a função do gene em dopaminérgico Desenvolvimento Neuron

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

No útero Eletroporação seguido por Cultura Neuronal primário para estudar a função do gene no subconjunto dos neurônios corticais

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Neurociência

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotípicas culturas de mesencéfalo ventral Slice Embrionárias: Um Sistema para o Estudo de Desenvolvimento Neuronal dopaminérgicos In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Em Expression in ovo de microRNA em Ventral Pintinho Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dirigido neurônios dopaminérgicos Diferenciação de Células-Tronco pluripotentes humanas

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Na imagem latente de cálcio Vivo de células de cabelo linha Lateral no Zebrafish Larval

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

Estudando a função cerebral em crianças usando magnetoencefalografia

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Análise Cinética 3D para a Avaliação Funcional no modelo de rat da lesão ciática de esmagamento nervoso

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...