Name: in ovo electroporation in chick midbrain for studying gene function in dopaminergic neuron development
Uploaded: 2012-08-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development at JoVE.com

Agradecemos al Dr. Takahiko Matsuda para la prestación del pCAG-mCherry construir. YCM está respaldada por un premio de Desarrollo de la Carrera de la Fundación Schweppe y una beca de la Fundación Whitehall.

1. Suministro preparación (no en vídeo) <ol><li> Preparar una dilución nueva 1X de penicilina / estreptomicina (Pen / Strep) en 1X PBS. No más de 50 mL es necesario. Filtrar con un filtro de 0,22 micras jeringa. </li><li> Preparar las construcciones de inyección mediante la combinación de construcciones de plásmidos deseados. Ponemos todas las construcciones en el vector pCAG-Bandera con estequiometría apropiada para un volumen final de ~ 10 l. Además, pCAG-GFP 14 o pCAG mCherry-se debe agregar par...

<ol>
	<li>Wightman, R. M., Robinson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+changes+in+mesolimbic+dopamine+and+their+association+with+'reward'.">Transient changes in mesolimbic dopamine and their association with 'reward'.</a> J. Neurochem. 82, 721-735 (2002).</li><li>Kelley, A. E., Berridge, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroscience+of+natural+rewards:+relevance+to+addictive+drugs.">The neuroscience of natural rewards: relevance to addictive drugs.</a> J. Neurosci. 22, 3306-3311 (2002).</li><li>Moore, D. J., West, A. B., Dawson, V. L., Dawson, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathophysiology+of+Parkinson's+disease.">Molecular pathophysiology of Parkinson's disease.</a> Annu. Rev. Neurosci. 28, 57-87 (2005).</li><li>Dailly, E., Chenu, F., Renard, C. E., Bourin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine,+depression+and+antidepressants.">Dopamine, depression and antidepressants.</a> Fundam. Clin. Pharmacol. 18, 601-607 (2004).</li><li>Sesack, S. R., Carr, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+prefrontal+cortex+inputs+to+dopamine+cells:+implications+for+schizophrenia.">Selective prefrontal cortex inputs to dopamine cells: implications for schizophrenia.</a> Physiol. Behav. 77, 513-517 (2002).</li><li>Ang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+midbrain+dopaminergic+neuron+development.">Transcriptional control of midbrain dopaminergic neuron development.</a> Development. 133, 3499-3506 (2006).</li><li>Andersson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+intrinsic+determinants+of+midbrain+dopamine+neurons.">Identification of intrinsic determinants of midbrain dopamine neurons.</a> Cell. 124, 393-405 (2006).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Series+of+Normal+Stages+in+the+Development+of+the+Chick+Embryo.">A Series of Normal Stages in the Development of the Chick Embryo.</a> J. Morphol. 88, 49 (1951).</li><li>Bellairs, R., Osmond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The atlas of chick development. , (2005).</li><li>Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Shocking'+developments+in+chick+embryology:+electroporation+and+in+ovo+gene+expression.">'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).</li><li>Momose, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation.">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).</li><li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).</li><li>Nishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+in+vivo+gene+transfer+using+intraarterial+plasmid+DNA+injection+following+in+vivo+electroporation.">High-efficiency in vivo gene transfer using intraarterial plasmid DNA injection following in vivo electroporation.</a> Cancer Res. 56, 1050-1055 (1996).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16-22 (2004).</li><li>Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Ovo+Electroporations+of+HH+Stage+10+Chicken+Embryos.">In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos.</a> J. Vis. Exp. (9), e408 (2007).</li><li>Chesnutt, C., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-based+short-hairpin+RNA+interference+in+the+chicken+embryo.">Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo.</a> Genesis. 39, 73-78 (2004).</li></ol>

La electroporación in ovo en el cerebro medio de los embriones de pollo ofrece una alternativa de bajo costo y rápida a la generación de animales transgénicos o knockout para realizar el estudio in vivo de las funciones de los genes en el cerebro medio dopaminérgico el desarrollo neuronal. Usando corto 2 mm de electrodos de platino largos en forma de L, junto con la inyección de ADN embrionario mesencéfalo-específico es la clave para lograr una expresión eficaz del gen de interés en ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Huevos de gallina fertilizados </td><td> Charles River Laboratories </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Huevo de incubadora </td><td> GQF Manufactura </td><td> Deportista 1502 </td><td></td></tr><tr><td> BTX Electroporador </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td> ECM830 </td><td></td></tr><tr><td> Electrodos </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td> 45-0162 en forma de L genetrodes </td><td> Para el uso con ECM830 electroporador </td></tr><tr><td> De alambre de platino iridio </td><td> Alfa Aesar </td><td> # 10056 </td><td> 0,5 mm de diámetro Para hacer los electrodos 2 mm de largo </td></tr><tr><td> Vidrio tubo capilar </td><td> Mundial de instrumentos de precisión </td><td> TW100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader punta de la pipeta </td><td> Eppendorf </td><td> 5242 956.003 </td><td></td></tr><tr><td> Tinta china </td><td> Staples </td><td></td><td> Filtrar 20% antes de su uso </td></tr><tr><td> Microinyector </td><td> Parker Automation, Parker Hannifin Cooperación </td><td> Picospritzer III </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de disección fluorescente </td><td> Leica </td><td> MZ16F </td><td></td></tr><tr><td> Micropipeta extractor </td><td> Sutter Instrument </td><td> D-97 </td><td></td></tr></tbody></table>

in ovo electroporation in chick midbrain for studying gene function in dopaminergic neuron development

Las neuronas dopaminérgicas en el movimiento del mesencéfalo ventral de control, el comportamiento emocional y los mecanismos de recompensa 1-3. La disfunción de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo ventral, está implicado en la enfermedad de Parkinson, la esquizofrenia, la depresión y la demencia 1-5. De este modo, el estudio de la regulación de la diferenciación de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo, no sólo podría proporcionar información importante sobre los mecanismos que regulan el desarrollo del cerebro medio y la especificación progenitoras neurales destino, sino también ayudar a desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento de una variedad de trastornos neurológicos humanos. Las neuronas dopaminérgicas diferenciarse de progenitores neurales que recubren la zona ventricular del cerebro medio ventral embrionario. El desarrollo de progenitores neurales está controlado por programas de expresión génica 6,7. Aquí mostramos las técnicas que utilizan la electroporación para expresar los genes específicamente en el cerebro medio de Hamburger y Hamilton (HH) la 11 ª etapa (tsomitas irteen, 42 horas), los embriones de pollo 8,9. El desarrollo de embriones de pollo externa permite convenientes manipulaciones experimentales en determinadas etapas embrionarias, con los efectos determinados en los puntos de tiempo posteriores del desarrollo 10-13. Polluelo de tubos neurales embrionarias antes del estadio HH 13 (diecinueve somitas, 48 ​​horas) consistirá en multipotenciales progenitoras neuronales que son capaces de diferenciarse en distintos tipos de células del sistema nervioso. El vector pCAG, que contiene tanto un promotor de CMV y un polluelo β-actina potenciador, permite la expresión robusta de la bandera o otras construcciones etiquetados epítopo en tubos de embriones de pollo neural 14. En este informe, hacemos hincapié en las medidas especiales para lograr la expresión de genes regional restringido en mesencéfalo dopaminérgicas embrionarias progenitoras neuronales, incluyendo cómo inyectar ADN construye específicamente en la región del cerebro medio embrionario y cómo identificar electroporación con pequeños electrodos hechos a la medida. El análisis de ccerebro medio cateto en etapas posteriores ofrece un excelente sistema in vivo para el plásmido vector-mediado por el aumento de la función y la pérdida de la función de los estudios del desarrollo del cerebro medio. La modificación del sistema experimental puede extender el ensayo a otras partes del sistema nervioso para realizar análisis destino mapeo y para investigar la regulación de la expresión génica.

Watch this Scientific Journal Video about In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development at JoVE.com

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Para evaluar la función y la regulación de los genes durante el desarrollo de las neuronas del cerebro medio dopaminérgico, se describe un método que consiste en<em&gt; In ovo</em&gt; Electroporación de construcciones de ADN plásmido en células progenitoras embrionarias de pollo ventral del cerebro medio de neuronas dopaminérgicas. Esta técnica puede utilizarse para lograr la expresión eficiente de genes de interés para estudiar diferentes aspectos del desarrollo y diferenciación de las neuronas del mesencéfalo dopaminérgica.

En electroporación in ovo en el mesencéfalo polluelo para estudiar la función génica en el desarrollo neuronal dopaminérgica

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

En el útero de electroporación seguido por cultivos neuronales primarias para estudiar la función génica en el subconjunto de neuronas corticales

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Investigación

Neurociencias

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

La transfección de células de ratón del ganglio de la retina por In vivo La electroporación

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Del ratón en el útero de electroporación: Transefection controlada Gene espacio-temporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Culturas organotípicos rebanada de mesencéfalo ventral embrionario: Un sistema para estudiar el desarrollo neuronal dopaminérgica In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dos registros electrofisiológicos de sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial en agudas rodajas de hipocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

En Expression in ovo de microARN en ventral del polluelo Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dirigida dopaminérgica Neurona La diferenciación de las células madre pluripotentes humanas

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

En proyección de imagen del calcio Vivo de las células de pelo de la línea Lateral en el pez cebra larvas

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

Estudiar la función cerebral en niños utilizando Magnetoencefalografía

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Análisis cinemático 3D para la evaluación funcional en el modelo de rata de lesión de aplastamiento de nervios ciáticos

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...