Name: customization of aspergillus niger morphology through addition of talc micro particles
Uploaded: 2012-03-15T13:00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles at JoVE.com

De auteurs zeer erkentelijk voor de financiële steun van de Duitse Research Foundation (DFG) door de gezamenlijke onderzoekscentrum SFB 578 &quot;Van gen tot Product&quot; aan de Technische Universität Braunschweig, Duitsland.

1. Reactor Setup en start van de teelt 4 bioreactor teelten in totaal worden uitgevoerd. <ol><li> Een 3 L geroerde tank bioreactor met een werkvolume van 2,2 L voor de teelt van A. niger SKAn1015. </li><li> Giet 72,6 g glucose monohydraat in de reactor en vul het op met 1,9 L gedeïoniseerd water. </li><li> Installeer de reactor apparatuur zoals 3 schotten, een twee zes-bladige schijf turbine waaier, een pH-elektrode, een gas inlaat met lucht filter, een koel-vinger, een uitlaat luchtkoeler met lucht filter, een dompelbuis voor steriele bemonstering met luchtfilter en de inlaat slangen voor medium, inoculum, zuren en basen. </li><li> Autoclave de reactor bij 121 ° C gedurende 20 minuten. </li><li> Sluit de reactor met het zuur-base reservoir (2 M HCl, 2 M NaOH) en de overeenkomstige pompen en het opzetten van een pH-waarde van 5,0 ± 0,05 met pH regeling. </li><li> Link de reactor met het koelwater systeem en zet de verwarmingsmantelin het reactorvat. </li><li> Installeer de temperatuursensor met bijbehorende controle-eenheid en tot een temperatuur van 37 ingesteld ± 0,1 ° C bij de temperatuur regeling. </li><li> Plaats de agitatie motor op de hoogte van de reactor en breng het in gebruik met een agitatie snelheid van 200 min -1. </li><li> Voeg de steriele minimale groeimedium 11 door een van de steriele toevoerslangen (250 ml). Voor gemiddelde bereiding alle componenten waren autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 min en gemengd. Drie teelten componenten omvatten talkpoeder (3MgO • 4SiO 2 • H 2 O) in concentraties van 1 g / L (reactor 2), 3 g / L (reactor 3) en 10 g / L (reactor 4). Voor gebruik van de micro-deeltjes opnieuw in suspensie in 50 mM natriumacetaat buffer (pH 6,5) en de steriele medium toevoegen. In controlekweken (zonder deeltjes) vervangen micro deeltjes suspensie met 50 mM natriumacetaat buffer (pH 6,5). </li><li> Voeg de sporensuspensie (aantal kiemen) eens bereid Wucherpfennig et. al (2011) 11 door een van de steriele toevoerslangen (50 ml), zodat de concentratie van sporen bedraagt ​​1X10 ml 6 -1. De enting markeert het begin van de teelt (h = 0 h). </li><li> Start de beluchting met een snelheid van 1,0 L min -1. </li></ol> 2. Steriele Sampling na 24, 48 en 72 uur van de teelt <ol><li> Neem 50 ml steriele cultuur bouillon in een flacon buis. </li><li> Gebruik monster voor het bepalen van biomassa droog gewicht, β-fructofuranosidase activiteit en microscopische analyse. </li></ol> 3. Bepaling van de Biomassa Gewicht na 24, 48 en 72 uur van de teelt <ol><li> Biomassa monsters worden genomen ten minste in tweevoud. </li><li> Gewicht een cellulose filter met een microschaal na drogen in een exsiccator en plaats filter in een Büchner trechter aangesloten waterstraal vacuümpomp. </li><li> Filtreer een bepaald monster volume (bv. 10 ml) eennd Spoel het filter met 10 ml gedeïoniseerd water tot medium verbindingen te verwijderen uit de biomassa. </li><li> Rimpel het filter een keer in het midden, plaats hem in een glazen petrischaal en zet hem in een ruimte droger tot gewicht standvastigheid (minimaal 24 uur). </li><li> Koel het filter in een exsiccator en meet het gewicht. </li><li> Bereken de biomassa droge als het verschil tussen het gewicht van het filter met en zonder droge biomassa gedeeld door de gebruikte monstervolume. </li></ol> 4. Bepaling van de extracellulaire enzymatische activiteit van β-fructofuranosidase door GOD / POD-essay na 24, 48 en 72 uur van de teelt Bewaar de monsters op het ijs voortdurend tijdens het werken met hen. <ol><li> Filter 1,5 ml cultuur suspensie via een celluloseacetaat filter door de kweek suspensie met een injectiespuit door het filter in een reactiebuis. Bewaar de reactiebuis bij -20 ° C tot gebruik. </li><li> Voor het reactiemengsel gebruik 20il monster en voeg 200 ul 1,65 M sucrose opgelost in 0,05 M fosfaatbuffer (pH 5,4) de reactie van sucrose met glucose leiden. Cary de reactie ten minste in duplo. </li><li> Incubeer het reactiemengsel bij 40 ° C gedurende 20 min in een verwarmingsblok. Stop de reactie incuberen bij 95 ° C gedurende 10 min in een verwarmingsblok. Koel het reactiemengsel door slaan op ijs en draaien beneden het gecondenseerde water door centrifugeren bij 13.000 g gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Om de pH en temperatuur afhankelijke splitsing van sucrose aan glucose rekeningnummer verrichten blanco met 20 pi gedeïoniseerd water in plaats van 20 pi monster. </li><li> Om rekening te houden resterende glucose in de cultuur bouillon, het uitvoeren van een negatieve controle voor elk monster. Daartoe gebruik 20 pi van het monster en inactiveren β-fructofuranosidase door verwarming bij 95 ° C gedurende 10 min voorafgaand aan de sucrose voegen en incubeer zoals beschreven in stap 4.3. </li><li> Verdun de monsters zodanig dat de volgende maatrefigureerde adsorptie in de gekalibreerde waardebereik. </li><li> Voer alle enzymatische assays in drievoud. Breng 2 pl verdunde monster in een micro-titer plaat goed. Breng een standaard assortiment voor de kalibratie van de micro-titer plaat door elk met 2 pl van tien glucose-oplossingen met tien verschillende kennis-concentraties (van 1 mm tot 15 mm) in plaats van 2 pl monster. Voor nulpunt kalibratie gebruik maken van 2 pl gedeïoniseerd water in plaats van 2 pl monster. </li><li> Voeg 200 pi van het reagens oplossing in elk putje met een multi pipet. </li><li> Incubeer het mengsel gedurende 10 min bij kamertemperatuur. </li><li> Bewaar de micro-titer plaat op 6 ° C tot meting (een paar uur bij de meeste). </li><li> Meet de absorptie bij 450 nm met behulp van een 96-wells plaat Sunrise micro-lezer en de Magellan data retrieval software. Stel de mengtijd tot 5 sec. en de rest periode tot 1 sec. </li><li> Open het resultaat grafiek met een spreadsheet en de bouw van een ijklijn met behulp van de standaard assortiment: glucose concentratie = a X + b absorptie </li><li> Bereken de activiteit: activiteit = (absorptie X verdunningsfactor-lege waarde) X a + b </li><li> Figuur uit de β-fructofuranosidase activiteit door het verschil te berekenen tussen de activiteiten van het monster en de juiste negatieve controle. </li><li> Bereken de specifieke productiviteit voor volgende gebruik door rekening te houden met biomassa droog gewicht en de β-fructofuranosidase activiteit 11. </li></ol> 5. Microscopie en Automated Image Analysis na 72 uur van de teelt <ol><li> Plaats ongeveer 3 ml cultuur suspensie in een plastic petrischaal enhen verdunnen fysiologische zoutoplossing tot morfologische structuren worden gescheiden. </li><li> Situeer de petrischaal onder de microscoop, die een geïntegreerde of aangesloten camera beschikt. Verwerven en op te slaan ongeveer 100 beelden (figuur 2) van morfologische structuren per monster. Let erop dat op elke afbeelding tenminste een object volledig is afgebeeld. </li><li> Open alle afbeeldingen van hetzelfde monster met de beeldverwerking programma ImageJ 12. Zet de foto&#39;s naar zwart-wit met behulp van het process tool &quot;Make Binary&quot; (Figuur 2). Voor het aanbrengen van de opdracht voor de hele serie foto&#39;s gebruik maken van een macro-code als volgt. lopen (,, Make Binary &quot;) </li><li> Open verwerkte binaire beelden ImageJ weer. Bereken de vormfactoren Feret de diameter, geprojecteerd oppervlakte, omtrek, circulariteit, aspect ratio, rondheid und degelijkheid voor elk beeld met de analyse tool &quot;Set waardering&quot;. Voor het aanbrengen van de opdracht om een ​​series van beelden gebruik maken van een macro-code als volgt. draaien (&quot;8-bit&quot;); draaien (&quot;Maak Binary&quot;); draaien (&quot;Set Schaal ...&quot;, &quot;afstand = X = 1000 bekend pixel = 1 eenheid = um global&quot;); draaien (&quot;Set Afmetingen ...&quot;, &quot;gebied omtrek vorm van Feret de limiet scherm redirect = Geen decimaal = 3&quot;); draaien (&quot;Analyseer deeltjes ...&quot;, &quot;size = 10000-Infinity circulariteit = 0.00-1.00 show = Contouren display&quot;); Bepaal X het aantal pixels die tot 1000 pm correleert met de bouw van een rechte lijn in een schaal bar. Correleren aantal pixels van de rechte lijn met de lengte van de schaal bar pm. </li><li> Open het resultaat bundel waarin vormfactor waarden voor elk beeld met een spreadsheet. Bereken een Morfologie aantal als volgt over de afbeelding. <img alt="Vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/4023/4023eq1.jpg" /></li><li> Bereken de gemiddelde waarde en standaarddeviatie voor de morfologie aantal, rekening houdend met alle afbeeldingen van een monster. </li&gt; <li> Gebruik een grafische en data-analyse programma voor grafische correlatie van de morfologie nummer met de specifieke productiviteit en bepalen de mathematische relatie door wiskundige regressie. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Door toevoeging van talk micro deeltjes A. niger Skan 1015 morfologie is veranderd van een echte pellet morfologie van een gedispergeerd of zelfs mycelium morfologie. Overwegende dat de pellet morfologie is te zien in normale omstandigheden een mycelium morfologie wordt gecreëerd door suppletie van medium met 10 g / L van talk micro-deeltjes (figuur 4.). Tegelijkertijd de activiteit van β-fructofuranosidase verhoogt ongeveer 3 maal 3-5. Een suppletie van 1 of 3 g / L van talkpoeder tot gedispergeerde morfologie, met een dubbele fructofuranosidase activiteit (figuur 4.). De micro-deeltje afhankelijk morfologie volledig kan worden beschreven door de Morphology getal dat kan worden berekend met behulp van parameters bepaald door de automatische beeldanalyse. Perfect rond en glad pellets zal in microscopische beelden verschijnen als perfecte cirkels. Voor dergelijke deeltjes de morfologie getal met de waarde 1. De kleinste fragment van mycelium morfologie kan worden vereenvoudigd als eendimensionale lijn waarbij een morfologie aantal 0. Alle tussenliggende morfologische vormen, zoals langgerekte onregelmatige korrels of klompjes zal dus waarden tussen 0 en 1. Vrij grote deeltjes resulteren in een hoge schimmel deeltjes met een groot oppervlak of langwerpige deeltjes in een betrekkelijk laag morfologie nummer 11. Bij normale omstandigheden de morfologie in reactor 1 vertoont een Morfologie aantal rond de 0,8. De morfologie in reactor 4 met 10 g / L talkpoeder is voorzien van een Mn ongeveer 0,1. De morfologie nummer reactoren 2 en 3, met talkpoeder concentraties van 1 en 3 g / l ligt tussen deze uitersten, waaruit een gedispergeerd morfologie. Aangezien micro deeltjes afhankelijk morfologie is nauw verwant met de β-fructofuranosidase productiviteit wordt een mathematisch verband tussen morfologie aantal en productiviteit soortgelijke figuur 5 verkregen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig1.jpg" /> Figuur 1. Algemeen schema van de proefopzet en de analytische procedure. A. niger geteeld (met of zonder microdeeltjes) in een 3 L geroerde tank bioreactor gedurende 72 uur. Na 24 tot 48 en 72 ha monster voor het bepalen van biomassa drooggewicht en β-fructofuranosidase activiteit, die weer gebruikt voor de berekening van de specifieke productiviteit. Na 48 uur de schimmel morfologie wordt onderzocht onder de microscoop en wordt gekenmerkt door digitale beeldanalyse. Relevante parameters van beeldanalyse worden gecombineerd om een ​​morfologie getal, dat mathematische verband met de specifieke productiviteit. <imgalt = &quot;Figuur 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4023/4023fig2.jpg&quot; /&gt; Figuur 2. Stappen van beeldverwerking voor microscopische-gegenereerde beelden van morfologische structuren van A. niger. Stap 1: image overname door microscoop. Stap 2: image verbeteren indien nodig. Stap 3: beeld binarisatie, zwart-wit (binaire) beeld gegenereerd in ImageJ. Stap 4: het binaire beeld wordt verwerkt door en ongewenste object worden gewist. Stap 5: morfologische analyse wordt uitgevoerd met de &quot;Analyseer deeltjes&quot; functie van het open source programma ImageJ. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig3.jpg" /> Figuur 3. Verschillende vormen van morfologische A. niger afhankelijk van de concentratie van toegevoegd microdeeltjes. Met de toenemende concentratie van micro-deeltjes toegevoegd de korrelgrootte nauwkeurig kan worden verlaagd tot kleine kern-schil pellets, kleine groepen en zelfs vrij verspreid mycelium. Morfologie techniek van Aspergillus niger SKAn1015 door micro deeltje suppletie in submerse cultuur. Zonder microdeeltjes (A), 10 mg / L (B), 0,1 g / L (C), 0,2 g / L (D), 0,3 g / L (E), 0,6 g / L (F), 1,0 g / L (G), 1,5 g / L (H), 2,0 g / L (I), 2,5 g / L (J), 3,0 g / L (K), 3,5 g / L (L), 4,0 g / L (M ), 4,5 g / L (N), 5,0 g / L (O) 10 g / L (P), 15 g / L (Q), 20 g / L (R), 30 g / L (S) en 40-50 g / L (T). Afbeeldingen zijn gemaakt door lichtmicroscopie na 72 uur van de teelt. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig4.jpg" /> Figuur 4. Fructofuranosidase activiteit in afhankelijkheid van talk micro deeltjesconcentratie 1 g / L (reactor 2), 3 g / L (reactor 3) en 10 g / L (reactor 4). Reactor 1 is niet aangevuld met micro-deeltjes, hier de teelt wordt uitgevoerd onder normale omstandigheden. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig5.jpg" /> Figuur 5. Representatieve goede correlatie (R2 = 0,91) van de morfologienummer en de specifieke productiviteit. De morfologie aantal uitgezet (abscis) tegen de specifieke productiviteit (ordinaat). Lineaire regressie levert de exponentiële relatie.

<ol>
	<li>Wucherpfennig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Applied Microbiology. 72, 89-136 (2010).</li><li>Driouch, H., H&#228;nsch, R., Wucherpfennig, T., Krull, R., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+enzyme+production+by+bio-pellets+of+Aspergillus+niger:+Targeted+morphology+engineering+using+titanate+microparticles.">Improved enzyme production by bio-pellets of Aspergillus niger: Targeted morphology engineering using titanate microparticles.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109, 462-471 (2012).</li><li>Driouch, H., Roth, A., Dersch, P., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+bioprocess+for+production+of+fructofuranosidase+by+recombinant+Aspergillus+niger.">Optimized bioprocess for production of fructofuranosidase by recombinant Aspergillus niger.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 87, 2011-2024 (2010).</li><li>Driouch, H., Roth, A., Dersch, P., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+fungi+in+good+shape:+Microparticles+for+tailor-made+fungal+morphology+and+enhanced+enzyme+production.">Filamentous fungi in good shape: Microparticles for tailor-made fungal morphology and enhanced enzyme production.</a> Bioengineered Bugs. 2, 100-104 (2011).</li><li>Driouch, H., Sommer, B., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+engineering+of+Aspergillus+niger+for+improved+enzyme+production.">Morphology engineering of Aspergillus niger for improved enzyme production.</a> Biotechnology and Bioengineering. 105, 1058-1068 (2010).</li><li>Kaup, B. -. A., Ehrich, K., Pescheck, M., Schrader, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microparticle-enhanced+cultivation+of+filamentous+microorganisms:+Increased+chloroperoxidase+formation+by+Caldariomyces+fumago+as+an+example.">Microparticle-enhanced cultivation of filamentous microorganisms: Increased chloroperoxidase formation by Caldariomyces fumago as an example.</a> Biotechnology and Bioengineering. 99, 491-498 (2008).</li><li>Hirayama, M., Sumi, N., Hidaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+fructooligosaccharide-producing+beta-fructofuranosidase+from+Aspergillus+niger+ATCC+20611.">Purification and characterization of a fructooligosaccharide-producing beta-fructofuranosidase from Aspergillus niger ATCC 20611.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 53, 667-673 (2006).</li><li>Rajoka, M. I., Yasmeen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+productivity+of+beta-fructofuranosidase+by+a+derepressed+mutant+of+Aspergillus+niger+form+conventional+and+non-conventional+substrates.">Improved productivity of beta-fructofuranosidase by a derepressed mutant of Aspergillus niger form conventional and non-conventional substrates.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 21, 471-478 (2005).</li><li>Zuccaro, A., G&#195;&#182;tze, S., Kneip, S., Dersch, P., Seibel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailor-made+fructooligosaccharides+by+a+combination+of+substrate+and+genetic+engineering.">Tailor-made fructooligosaccharides by a combination of substrate and genetic engineering.</a> ChemBioChem. 9, 143-149 (2008).</li><li>Huggett, A. S. G., Nixon, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+glucose+oxidase,+peroxidase,+and+o-dianisidin+in+determination+of+blood+and+urinary+glucose.">Use of glucose oxidase, peroxidase, and o-dianisidin in determination of blood and urinary glucose.</a> The Lancet. , 270-368 (1957).</li><li>Wucherpfenning, T., Hestler, T., Krull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+engineering+-+Osmolality+and+its+effect+on+Aspergillus+niger+morphology+and+productivity.">Morphology engineering - Osmolality and its effect on Aspergillus niger morphology and productivity.</a> Microb. Cell Fact. 10, (2011).</li><li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ. , (1997).</li><li>Papagianni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+fractal+nature+of+mycelial+aggregation+in+Aspergillus+niger+submerged+cultures.">Quantification of the fractal nature of mycelial aggregation in Aspergillus niger submerged cultures.</a> Microbial Cell Factories. 5, 5 (2006).</li></ol>

Ik heb niets te onthullen.

De wijziging van schimmel morfologie interesse heeft gewekt in de biotechnologie sinds vele decennia. Verschillende studies hebben geprobeerd om gekozen procesparameters zoals de pH-waarde, het vermogen, temperatuur, medium voedingsstoffen of inoculum concentratie 1 variëren, maar last hebben van eerder onnauwkeurig en onvolledig controle van de morfologie, hoge energiekosten, remming effecten of product instabiliteit, daarentegen, de suppletie van microdeeltjes kan een nauwkeurige techniek door middel van fungale morfologie afgestemd variatie van de deeltjesgrootte en-concentratie. Dit opent nieuwe mogelijkheden om micro-deeltjes te gebruiken voor optimalisatie en voor op maat gemaakte ontwerp van een hoog producerende morfologie in de biotechnologische productie met A. niger en draadvormige micro-organismen. De digitale beeldanalyse is een makkelijk reproduceerbare methode om schimmel macro morfologie karakteriseren. Echter, de verscheidenheid van parameters voor grootte, vorm en oppervlakte kenmerkenter van morfologische structuren in de literatuur beschreven maakt snelle beoordeling van ingewikkelde schimmel morfologie. Het weergegeven aantal morfologie als een combinatie van de relevante parameters, voorkomt dit tekort en kan niet alleen worden gebruikt voor een volledige typering van morfologische structuren, maar ook voor directe correlatie met wiskundige productiviteit. Dit maakt opnieuw een inschatting van de productiviteit door gegeven morfologie en dus een aanpassing van de morfologie voor het proces moet mogelijk zijn. De morfologie getal is het mogelijk onderscheid te maken tussen verschillende pellet en pol morfologie 4,5. Voor de verdere ontwikkeling van de morfologie aantal de behandeling van de fractale dimensie lijkt te zijn veelbelovend. Een fractale dimensie geeft een meting van de complexiteit en de massa te vullen eigenschappen van een object 13 en is daarom voorbestemd voor holistische karakterisering van mycelium morfologie. De creation van een hoge producerende mycelium morfologie, echter kan leiden tot problemen met het proces prestaties vooral in grootschalige teelt, omdat de myceliumgroei formulier is eerder aangetoond dat het vertonen een veel grotere cultuur bouillon viscositeiten 2. Dit leidt tot problemen met warmte-en massaoverdracht en vorming van stilstaand niet gemengde gebieden, die een hoog vermogen en om de teelt duurder een Inherent. Daarom tussen schimmel morfologie en kweekvloeistof viscositeit moet worden gehouden bij het veranderen van de morfologie en worden opgenomen in andere modellen.

Table of Equipment:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			Equipment</td>
			<td>
			Company</td>
			<td>
			Catalogue Number/model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			autoclave</td>
			<td>
			Systec</td>
			<td>
			V150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			B&uuml;chner funnel (plastic)</td>
			<td>
			VWR</td>
			<td>
			-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			cellulose filter (for biomass dry weight)</td>
			<td>
			Sartorius Stedim Biotech</td>
			<td>
			Filter Discs Grade 389</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			cellulose acetate filter (for air filtration at reactor)</td>
			<td>
			Sartorius stedim biotech</td>
			<td>
			Midisart 200 PTFE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			cellulose acetate filter (for enzyme activity)</td>
			<td>
			Sartorius Stedim Biotech</td>
			<td>
			Midisart NML</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			centrifuge</td>
			<td>
			Eppendorf</td>
			<td>
			Centrifuge 5415R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			centrifuge</td>
			<td>
			Heraeus</td>
			<td>
			Biofuge fresco</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			centrifuge</td>
			<td>
			Heraeus sepatech</td>
			<td>
			Varifuge 3.0R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			compartment dryer (105 &deg;C)</td>
			<td>
			Heraeus</td>
			<td>
			Kelvitran t</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			control unit (temperature)</td>
			<td>
			Jumo</td>
			<td>
			Jumo iTron 08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			control unit (pH-value)</td>
			<td>
			meredos</td>
			<td>
			pH Control 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			desiccator</td>
			<td>
			Duran</td>
			<td>
			Vacuum stable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Falcon tubes</td>
			<td>
			Omnilab</td>
			<td>
			FALC352070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			heating block 40 &deg;C</td>
			<td>
			Biometra</td>
			<td>
			TB1 Thermoblock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			heating block 95 &deg;C</td>
			<td>
			HLC</td>
			<td>
			HBT 130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro plate reader</td>
			<td>
			Tecan</td>
			<td>
			Sunrise-Microplate-Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro scales</td>
			<td>
			Sartorius</td>
			<td>
			CP 225</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			microscope (digital inverted)</td>
			<td>
			AMG</td>
			<td>
			EVOS xl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro pipettes and tips (different sizes)</td>
			<td>
			Omnilab</td>
			<td>
			5283303
			5283298 
			5283299 
			5283300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro titer plate</td>
			<td>
			Nunc</td>
			<td>
			MaxiSorp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			multi pipette and tips</td>
			<td>
			Eppendorf/ Omnilab</td>
			<td>
			5283611/ 5283611</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			pH-electrode</td>
			<td>
			Schott</td>
			<td>
			pH-Meter CG840</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			reaction tubes</td>
			<td>
			Roth</td>
			<td>
			E518.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			scale</td>
			<td>
			Sartorius</td>
			<td>
			CP 3202 S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			stirred tank bioreactor with equipment</td>
			<td>
			Applikon Biotechnology</td>
			<td>
			2L Bioreactor set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			syringe</td>
			<td>
			Eppendorf</td>
			<td>
			Combitips Plus 5 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table of Reagents:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			Name of the reagent</td>
			<td>
			Company </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Acetic acid</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Disodium hydrogen phosphate</td>
			<td>
			Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Ethanol (95%)</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glucose monohydrate, (&alpha;-D-)</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glucose oxidase (Typ II from Aspergillus niger)</td>
			<td>
			Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Hydrochloride acid (37 % w/v)</td>
			<td>
			Fiedel-de Ha&euml;n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Hydrous magnesium silicate</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Monopotassium phosphate</td>
			<td>
			Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			o-dianoisidine dihydrochloride</td>
			<td>
			Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Peroxidase (Typ II from horseradish)</td>
			<td>
			Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sodium acetate</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sodium hydroxide</td>
			<td>
			Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sucrose, D-(+)</td>
			<td>
			Fluka</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Water (deionized)</td>
			<td>
			-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table of Solutions and Medium Composition:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			Solution</td>
			<td>
			Components</td>
			<td>
			Amount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			50 mM sodium acetate buffer (pH 6.5)</td>
			<td>
			Sodium acetate
			Bring to volume with deionized water
			Adjust at pH 6.5 with acetic acid</td>
			<td>
			4.1 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M monopotassium phosphate solution</td>
			<td>
			Monopotassium phosphate
			Bring to volume with deionized water</td>
			<td>
			6.805 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M disodium hydrogen phosphate solution</td>
			<td>
			Disodium hydrogen phosphate
			Bring to volume with deionized water</td>
			<td>
			7.1 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M phosphate buffer (pH 7.0)</td>
			<td>
			0.05 M disodium hydrogen phosphate solution
			Bring to volume with 0.05 M monopotassium phosphate solution</td>
			<td>
			61.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M phosphate buffer (pH 5.4)</td>
			<td>
			0.05M disodium hydrogen phosphate solution
			Bring to volume with 0.05 M monopotassium phosphate solution</td>
			<td>
			3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			1.65 M sucrose solution</td>
			<td>
			D-(+)-sucrose
			Bring to volume with phosphate buffer (pH 5.4)</td>
			<td>
			564.8 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			reagent solution</td>
			<td>
			o-Dianisidin-Dihydrochlorid
			Ethanol (95%)</td>
			<td>
			25 mg
			10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glucose reagent solution</td>
			<td>
			Glucose oxidase
			Peroxidase
			Phosphate buffer (pH 7.0)
			reagent solution</td>
			<td>
			10.5 mg
			3 mg
			90 mL
			10 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

customization of aspergillus niger morphology through addition of talc micro particles

De filamenteuze schimmel A. niger is een veel gebruikte stam in een groot aantal industriële processen voedsel farmaceutische industrie. Een van de meest interessante vaak ongecontroleerde eigenschappen van deze draadvormige organisme is het complex morfologie. Het varieert van dichte bolvormige pellets viskeuze mycelia (figuur 1). Verschillende procesparameters en ingrediënten bekend schimmel morfologie een beïnvloeden. Sinds optimale productiviteit hangt sterk samen met een specifieke morfologische vorm, de schimmel morfologie is vaak de bottleneck van de productiviteit in de industriële productie. Een eenvoudig en elegante aanpak om precies morfologische vorm is de toevoeging van anorganische onoplosbare microdeeltjes (zoals waterhoudend magnesiumsilicaat, aluminium-oxide of titaansilicaat oxide) aan het kweekmedium bijdragen tot toegenomen enzymproductie 2-6. Aangezien er een obvious correlatie tussen micro-deeltjes afhankelijk van de morfologie en de productie van enzymen is het wenselijk om wiskundig te koppelen van de productiviteit en morfologische uitstraling. Daarom is een nauwkeurige kwantitatieve en holistische morfologische beschrijving is gericht. Zo we een methode voor het genereren en karakteriseren micro deeltjes afhankelijk morfologische structuren en schimmels morfologie correleren met productiviteit (figuur 1) die mogelijk bijdraagt ​​tot een beter begrip van de morfogenese van organismen draadvormige. De recombinante stam A. niger SKAn1015 wordt gekweekt gedurende 72 uur in een 3 L geroerde tank bioreactor. Door toevoeging van talk microdeeltjes in concentraties van 1 g / L, 3 g / l en 10 g / L vóór de inoculatie verschillende morfologische structuren is reproduceerbaar gegenereerd. Steriele monsters genomen na 24, 48 en 72 uur voor de bepaling van de groei vooruitgang en activiteit van de geproduceerde enzym. Degevormde product is de hoge waarde enzym β-fructofuranosidase, een belangrijke biokatalysator voor de neo-suiker vorming in voedings-en farmaceutische industrie, die katalyseert onder andere de reactie van sucrose in glucose 7-9. Daarom is de kwantificering van glucose na toevoeging sucrose houdt de hoeveelheid geproduceerd β-fructofuranosidase. Glucose kwantificering van een GOD / POD-test 10, die is aangepast voor hoge doorvoer analyse in 96-well micro titer platen. Schimmel morfologie na 72 uur wordt onderzocht onder de microscoop en wordt gekenmerkt door digitale beeldanalyse. Daarbij worden deeltjesvorm factoren voor schimmelinfecties macro-morfologie, zoals een diameter van Feret&#39;s, geprojecteerde oppervlakte, omtrek, circulariteit, aspect ratio, rondheid und stevigheid berekend met de open source beeldbewerkingsprogramma ImageJ. Relevante parameters worden gecombineerd om een dimensieloos getal Morfologie (Mn) 11 die een uitgebreid karakterisering van steltfungale morfologie. De nauwe correlatie van de morfologie aantal en de productiviteit worden gemarkeerd door wiskundige regressie.

Watch this Scientific Journal Video about Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles at JoVE.com

Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles

Een methode om nauwkeurig te genereren en om volledig te karakteriseren morfologie van filamenteuze schimmel<em&gt; Aspergillus niger</em&gt; Beschreven, waardoor de mathematische verband morfologische uiterlijk en productiviteit.

Aanpassing van Aspergillus niger Morfologie door toevoeging van talk micro-deeltjes

The filamentous fungus A. niger is a widely used strain in a broad range of industrial processes from food to pharmaceutical industry. One of the most ...

customization-aspergillus-niger-morphology-through-addition-talc

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient expression of effectors. Packaging lentiviral expression constructs into pseudoviral particles, however, enables up to 100% transduction, even with difficult-to-transfect cells, such as primary, stem, and differentiated cells. Moreover, the lentiviral delivery does not produce the specific cellular responses typically associated with chemical transfections, such as cell death resulting from toxicity of the transfection reagent 1, 2. When transduced into target cells, the lentiviral construct integrates into genomic DNA and provides stable expression of the small hairpin RNA (shRNA), cDNA, microRNA or reporter gene 3, 4. Target cells stably expressing the effector molecule can be isolated using a selectable marker contained in the expression vector construct such as puromycin or GFP. After pseudoviral particles infect target cells, they cannot replicate within target cells because the viral structural genes are absent and the long terminal repeats (LTRs) are designed to be self-inactivating upon transduction 5, 6.
There are three main components necessary for efficient lentiviral packaging 1, 5, 6, 7. 
1. The lentiviral expression vector that contains some of the genetic elements required for packaging, stable integration of the viral expression construct into genomic DNA, and expression of the effector or reporter. 
2. The lentiviral packaging plasmids that provide the proteins essential for transcription and packaging of an RNA copy of the expression construct into recombinant pseudoviral particles. This protocol uses the pPACK plasmids (SBI) that encode for gag, pol, and rev from the HIV or FIV genome and Vesicular Stomatitis Virus g protein (VSV-G) for the viral coat protein. 
3. 293TN producer cells (derived from HEK293 cells) that express the SV40 large T antigen, which is required for high-titer lentiviral production and a neomycin resistance gene, useful for reselecting the cells for maintenance.
An overview of the viral production protocol can be seen in Figure 1. Viral production starts by co-transfecting 293TN producer cells with the lentiviral expression vector and the packaging plasmids. Viral particles are secreted into the media. After 48-72 hours the cell culture media is harvested. Cellular debris is removed from the cell culture media, and the viral particles are precipitated by centrifugation with PEG-it for concentration. Produced lentiviral particles are then titered and can be used to transduce target cells. Details of viral titering are not included in this protocol, but can be found at:
<a href="http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf</a> 8.
This protocol has been optimized using the specific products indicated. Other reagents may be substituted, but the same results cannot be guaranteed.

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Lentiviral expression vectors are the most effective vehicles for stably expressing different effector molecules or reporter constructs in dividing and non-dividing mammalian cells and whole organisms. Here we provide a protocol on how to package lentivector expression constructs in pseudoviral particles and to transduce target cells using the pseudoviral particles.

Verpakking HIV-of FIV-based Lentivector expressie constructen en transductie van VSV-G pseudogetypeerde virale deeltjes

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Detectie van TL Nanoparticle Interacties met Primary Immune celtypes door flowcytometrie

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or specific treatments for the disease caused by these viruses, and work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories, significantly limiting the research on these viruses. Lifecycle modeling systems model the virus lifecycle under biosafety level 2 conditions; however, until recently such systems have been limited to either individual aspects of the virus lifecycle, or a single infectious cycle. Tetracistronic minigenomes, which consist of Ebola virus non-coding regions, a reporter gene, and three Ebola virus genes involved in morphogenesis, budding, and entry (VP40, GP1,2, and VP24), can be used to produce replication and transcription-competent virus-like particles (trVLPs) containing these minigenomes. These trVLPs can continuously infect cells expressing the Ebola virus proteins responsible for genome replication and transcription, allowing us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions. Importantly, the viral components of this systems are solely derived from Ebola virus and not from other viruses (as is, for example, the case in systems using pseudotyped viruses), and VP40, GP1,2 and VP24 are not overexpressed in this system, making it ideally suited for studying morphogenesis, budding and entry, although other aspects of the virus lifecycle such as genome replication and transcription can also be modeled with this system. Therefore, the tetracistronic trVLP assay represents the most comprehensive lifecycle modeling system available for Ebola viruses, and has tremendous potential for use in investigating the biology of Ebola viruses in future. Here, we provide detailed information on the use of this system, as well as on expected results.

Work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories. Tetracistronic minigenome-containing replication and transcription-competent virus like particles (trVLPs) represent a lifecycle modeling system that allows us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions, relying exclusively on Ebola virus components.

Het modelleren van de levenscyclus van Ebola Virus onder Biosafety Level 2 Voorwaarden met het virus-achtige deeltjes die Tetracistronic minigenomen

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

Optimalisatie van een kwantitatieve micro-neutralisatie assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase reporter, using a simple transfection procedure of the widely available HEK-293T cell line. Once formed and released from producer cells, these pseudovirions incorporate a luciferase reporter gene. Since they only contain the heterologous coronavirus spike protein on their surface, the particles behave like their native coronavirus counterparts for entry steps. As such, they are the excellent surrogates of native virions for studying viral entry into host cells. Upon successful entry and infection into target cells, the luciferase reporter gets integrated into the host cell genome and is expressed. Using a simple luciferase assay, transduced cells can be easily quantified. An important advantage of the procedure is that it can be performed in biosafety level 2 (BSL-2) facilities instead of BSL-3 facilities required for work with highly pathogenic coronaviruses such as Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV). Another benefit comes from its versatility as it can be applied to envelope proteins belonging to all three classes of viral fusion proteins, such as the class I influenza hemagglutinin (HA) and Ebola virus glycoprotein (GP), the class II Semliki forest virus E1 protein, or the class III vesicular stomatitis virus G glycoprotein. A limitation of the methodology is that it can only recapitulate virus entry steps mediated by the envelope protein being investigated. For studying other viral life cycle steps, other methods are required. Examples of the many applications these pseudotype particles can be used in include investigation of host cell susceptibility and tropism and testing the effects of virus entry inhibitors to dissect viral entry pathways used.

Here, we present a protocol to generate pseudotyped particles in a BSL-2 setting incorporating the spike protein of the highly pathogenic viruses Middle East respiratory syndrome and severe acute respiratory syndrome coronaviruses. These pseudotyped particles contain a luciferase reporter gene allowing quantification of virus entry into target host cells.

Productie van Pseudotyped deeltjes te bestuderen van hoogpathogene Coronaviruses in een omgeving van bioveiligheid niveau 2

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

Meten van fagocytose van Aspergillus fumigatus conidia door menselijke leukocyten met behulp van Flowcytometrie

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

Productie van Hoogtiter infectieuze influenza pseudo-getypte deeltjes met envelop glycoproteïnen van hoogpathogene H5N1 en aviaire H7N9 virussen

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is responsible for altering infection for many of these viruses. Thus, characterizing the nature of virus-bacteria binding is a foundational step needed for elucidating the mechanism(s) by which bacteria alter viral infection. For human norovirus, commensal bacteria enhance B cell infection. The virus directly binds to these bacteria, indicating that this direct interaction is involved in the mechanism of infection enhancement. A variety of techniques can be used to quantify interactions between bacteria and viruses including scintillation counting of radiolabeled viruses and polymerase chain reaction (PCR). Both methods require the use of live virus, which may need to be generated in the laboratory. Currently, none of the established in vitro culture systems available for human norovirus are robust enough to allow for generation of highly concentrated viral stocks. In lieu of live virus, virus-like particles (VLPs) have been used to characterize the interactions between norovirus and bacteria. Herein a flow cytometry method is described with uses virus specific antibodies to quantify VLP binding to gram-negative and gram-positive bacteria. Inclusion of both bacteria only and isotype controls allowed for optimization of the assay to reduce background antibody binding and accurate quantification of VLP attachment to the bacteria tested. High VLP:bacterium ratios result in VLPs binding to large percentages of the bacterial population. However, when VLP quantities are decreased, the percent of bacteria bound also decreases. Ultimately, this method can be employed in future experiments elucidating the specific conditions and structural components that regulate norovirus:bacterial interactions.

The goal of this protocol is to quantify binding of the eukaryotic pathogen human norovirus to bacteria. After performing an initial virus-bacterium attachment assay, flow cytometry is used to detect virally-bound bacteria within the population.

Kwantificeren van menselijke Norovirus Virus-achtige deeltjes binding aan commensale bacteriën met behulp van Flow Cytometrie

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

Infectie van zebravislarven met Aspergillus-sporen voor analyse van gastheer-pathogene interacties

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular deoxyribonucleic acid (ecDNA) is released during different forms of cell death including apoptosis, necrosis, necroptosis, neutrophil extracellular traps (NETs) and pyroptosis. Measurement of this cell death is time consuming with several different biomarkers required to identify the different biochemical forms of cell death. Measurement of ecDNA is generally conducted in serum and urine as a surrogate for renal damage, not in the actual target organ where the pathological injury occurs. The current difficulty in investigating ecDNA in the kidney is the lack of methods for formalin fixed paraffin embedded tissue (FFPE) both experimentally and in archived human kidney biopsies. This protocol provides a summary of the steps required to stain for ecDNA in FFPE tissue (both human and murine), quench autofluorescence and measure the ecDNA in the resulting images using a machine learning tool from the publicly available open source ImageJ plugin trainable Weka segmentation. Trainable Weka segmentation is applied to ecDNA within the glomeruli where the program learns to classify ecDNA. This classifier is applied to subsequent acquired kidney images, reducing the need for manual annotations of each individual image. The adaptability of the trainable Weka segmentation is demonstrated further in kidney tissue from experimental murine anti-MPO glomerulonephritis (GN), to identify NETs and ecMPO, common pathological contributors to anti-MPO GN. This method provides objective analysis of ecDNA in kidney tissue that demonstrates clearly the efficacy in which the trainable Weka segmentation program can distinguish ecDNA between healthy normal kidney tissue and diseased kidney tissue. This protocol can easily be adapted to identify ecDNA, NETs and ecMPO in other organs.

Extracellular DNA (ecDNA) released during cell death is proinflammatory and contributes to inflammation. Measurement of ecDNA at the site of injury can determine the efficacy of therapeutic treatment in the target organ. This protocol describes the use of a machine learning tool to automate measurement of ecDNA in kidney tissue.

Begeleide machine learning voor semi-kwantificering van extracellulair DNA in Glomerulonephritis

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...