Name: customization of aspergillus niger morphology through addition of talc micro particles
Uploaded: 2012-03-15T13:00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles at JoVE.com

저자들은 기꺼이 그 Technische Universität 브라운 슈 바이크, 독일에서 &#39;진에서 제품에 대한&#39;공동 연구 센터 SFB 578를 통해 독일 연구 재단 (DFG)에서 제공하는 재정 지원을 인정합니다.

1. 재배의 원자로 설치 및 시작 총 4 생물 반응기의 cultivati​​ons을 실시하고 있습니다. <ol><li> A.의 재배를 위해 2.2 L의 작동 량과 함께 3 패 흔들 탱크 생물 반응기를 사용하여 니제르 SKAn1015. </li><li> 반응기에 72.6 g의 포도당 일수화물을 붓고 1.9 L 탈이온수로 가득 채웁니다. </li><li> 이러한 세 baffles 등 원자로 설비, 두 여섯 bladed 디스크 터빈 임펠러, 산도 전극, 공기 필터와 가스 유입구, 냉각 손가락, 공기 필터와 배기 공기 냉각기, 공기 필터 멸균 샘플링을위한 침지 튜브를 설치 중간, inoculum, 산성 및 기지 및 유입 호스. </li><li> 20 분 동안 121 ° C에서 반응을 압력솥. </li><li> 산성 - 기본 저수지 (2 M HCL, 2 M NaOH) 및 해당 펌프로 반응기를 연결하고 pH의 제어 유닛과 5.0의 산도 가치 ± 0.05을 설정합니다. </li><li> 냉각 수계로 반응기를 연결하고 가열 재킷 넣어원자로 용기 주변. </li><li> 대응하는 제어 장치와 온도 센서를 설치하고 37 온도를 설정 ± 0.1 ° C의 온도 제어 장치에서. </li><li> 반응기의 정상 교반 모터에 맞는 200 분 -1의 교반 속도로 서비스에 가져다. </li><li> 멸균 최소한의 성장 매체 11 여물에게 멸균 입구 호스 (250 ML) 중 하나를 추가합니다. 매체 준비에 대한 모든 구성 요소는 20 분 동안 121 ° C에서 autoclaved 함께 섞여 있었다. 세 cultivations의 경우 구성 요소는 활석 1g / L의 농도에서 분말 (3MgO • 4SiO 2 • H 2 O) (반응 2), 3 G / L (반응 3)과 10 G / L을 (원자로 4) 등이 있습니다. 사용하기 전에는, 50 밀리미터 아세트산 나트륨 완충액 (산도 6.5)에 마이크로 입자를 다시 중지되고 멸균 매체에 추가합니다. 제어 문화권에서는 (입자 제외) 50 밀리미터 아세트산 나트륨 완충액 (산도 6.5)에 의해 마이크로 입자 현탁액을 대체합니다. </li><li> 포자 현탁액 (inoculum) 추가s은 Wucherpfennig 동부 표준시로 준비했습니다. 외 (2011) 11 그래서 여물 멸균 입구 호스 (50 ML) 중 하나에 해당 1X10 6 ML -1 포자 금액의 농도. 접종은 재배의 시작 (H = 0 H)을 표시한다. </li><li> 1.0 L 분 -1의 속도와 폭기를 시작합니다. </li></ol> 2. 멸균 24 이후 샘플링, 48 및 육성 72 H <ol><li> flacon 관에 멸균 문화 국물의 50 ML을 가져가라. </li><li> 바이오 매스 건조 중량, β-fructofuranosidase 활동 및 현미경 분석의 결정에 대한 샘플을 사용하십시오. </li></ol> 3. 24 이후 바이오 매스 건조 무게의 결정, 48 및 육성 72 H <ol><li> 바이오 매스 샘플은 적어도 중복에 촬영 예정이다. </li><li> 무게 건조기에서 건조와 연결된 물 제트 진공 펌프와 Büchner 퍼널을에 필터를 삽입 후 마이크로 비늘로 셀룰로오스 필터. </li><li> 정의된 샘플 볼륨 (예 : 10 ml) 쇼핑을 필터링ND는 바이오 매스로부터 중간 화합물을 제거하는 데 10 ML 탈이온수로 필터를 린스. </li><li> 주름 필터를 한 가운데, 유리 페트리 접시에 넣고 및 체중 비극적 (최소 24 H)까지 구획 건조기에 넣어. </li><li> 건조기에서 필터를 냉정하고 무게를 측정합니다. </li><li> 로하고 사용하는 샘플 량으로 나누어 건조 바이오 매스없이 필터의 무게 차이로 바이오 매스 건조 중량을 계산합니다. </li></ol> 4. 24 이후에 하나님 / POD-수필에 의한 β-fructofuranosidase의 세포외 효소 활동의 결정, 48 및 육성 72 H 그들과 함께 일하면서 끊임없이 얼음에 샘플을 저장합니다. <ol><li> 필터 1.5 ML 문화 서스펜션 트로프 반응 튜브에 필터를 통해 주사기로 문화 서스펜션을 눌러 셀룰로스 아세테이트 필터. 사용하기 전까지 -20 ° C에서 반응 튜브를 저장합니다. </li><li> 반응 혼합물은 20을 사용하기 위해μL 시료와 포도당으로 자당의 반응을 촉진시키기 위해서 0.05 M 인산 완충액 (산도 5.4)에 용해 1.65 미터 자당 200 μL를 추가합니다. 적어도 반응이 나와 캐리가 중복. </li><li> 가열 블록에 20 분 동안 40 ° C에서 반응 혼합물을 품어. 가열 블록에 10 분 동안 95 ° C에서 잠복기에 의해 반응을 중지합니다. 얼음에 저장하여 반응 혼합물을 냉각 4시 10 분 ° C.에 대해 13.000 g에서 원심 분리기로 농축 물을 다운 스핀 </li><li> 산도와 포도당으로 자당의 온도 의존 절단을 차지하고하려면 20 μL 탈이온수 대신에 20 μL 시료를 사용하여 빈 값을 수행. </li><li> 문화 국물에 잔류 포도당을 차지하고하려면 각 샘플에 대한 부정적인 제어를 수행. 이를 사용 20 샘플의 μL과 자당을 추가하고 같은 단계를 4.3에서 설명을 부화하기 전에 10 분 동안 95 ° C에서 가열에 의해 β-fructofuranosidase을 inactivate 위하여. </li><li> 그러한 그 샘플이 다음과 meas를 희석ured 흡착은 보정 값 범위에 있습니다. </li><li> 세중의 모든 효소 assays을 수행. 물론 마이크로 titer 접시에 2 μL 희석 샘플을 적용합니다. 대신 2 μL 시료의 10 개의 다른 체의 농도 (1 밀리미터에서 15 밀리미터까지)과 열 포도당 솔루션 2 μL를 사용하여 각함으로써 마이크로 titer 판에 대한 보정을위한 표준 범위를 적용합니다. 영점 교정은 2 μL 탈이온수 대신 2 μL 샘플을 사용하십시오. </li><li> 멀티 피펫을 사용하여 각 잘으로 시약 용액 200 μL를 추가합니다. </li><li> 상온에서 10 분 대한 혼합물을 품어. </li><li> 6 마이크로 titer 플레이트를 저장 ° 측정 (길어야 몇 시간)까지 C #. </li><li> 96 - 웰 선라이즈 마이크로 플레이트 리더와 마젤란 데이터 검색 소프트웨어를 사용하여 450 nm의에서 흡수를 측정합니다. 최대 5 초까지 혼합 시간을 설정합니다. 및 최대 1 초까지 나머지 기간. </li><li> 스프레드 시트로 결과 차트를 열고 표준 범위를 사용하여 교정 라인을 구축 : glucose 농도 = X + B 흡수 </li><li> 활동을 계산 : 활동 = (흡수는 X 희석 요인 - 빈 값) X + B </li><li> 샘플의 활동과 적절한 제외어 컨트롤의 차이를 계산하여 β-fructofuranosidase 활동을 알아내지 못했어요. </li><li> 계정 바이오 매스 건조 무게와 β-fructofuranosidase 활동 11 고려하여 다음과 같은 사용에 대한 구체적인 생산성을 계산합니다. </li></ol> 5. 재배의 72 H 후 현미경 및 자동 이미지 분석 <ol><li> 장소 3시 경이 ML 문화 플라스틱 배양 접시에있는 서스펜션과형태학의 구조 분리 때까지 생리 나트륨 염화물 솔루션을 희석. </li><li> 통합 또는 연결된 카메라를 갖추고 현미경 페트리 접시를, ...을 놓다. 샘플 당 형태학의 구조의 약 100 이미지 (그림 2)를 습득하고 저장합니다. 각 이미지에 적어도 하나의 개체가 완벽하게 묘사하는 것을주의하십시오. </li><li> 영상 처리 프로그램 ImageJ 12과 동일한 샘플의 모든 이미지를 엽니다. 프로세스 도구를 사용하여 흑백합니다 (그림 2) &quot;바이너리 만들기&quot;로 이미지를 변환합니다. 이미지의 전체 시리즈에 명령을 적용하기 위해 다음과 같이 매크로 코드를 사용합니다. 실행 (, 바이너리 만들기 &quot;) </li><li> 다시 ImageJ와 가공 바이너리 이미지를 엽니다. 도형 요소 Feret의 직경, 투영 면적, 둘레, 순환성, 화면 비율, 분석 도구 &quot;세트 측정&quot;와 모든 이미지에 대한 진원도 숙녀 단합을 계산합니다. 세리에 명령을 적용하기위한이미지 초밖에은 다음과 같이 매크로 코드를 사용합니다. ( &quot;8 비트&quot;) 실행; ( &quot;바이너리 만들기&quot;) 실행; ( &quot;설정 규모 ...&quot;, &quot;거리 = X 알려져 = 1000 픽셀 = 1 단위 = μm의 세계&quot;)를 실행; ( &quot;세트 측정 ...&quot;, &quot;지역 경계 형상 feret의 제한 표시 = 없음 진수 = 3를 리디렉션&quot;) 실행; ( &quot;입자를 분석 ...&quot;, &quot;크기 = 10,000 - 무한대의 순환성 = 0.00-1.00 쇼 = 디스플레이 개요&quot;) 실행; 눈금 막대를 가로질러 직선을 구축하여 1000 μm의에 연결합니다 픽셀의 개수로서 X를 결정합니다. μm의의 눈금 막대의 길이 직선의 픽셀 수를 상관 관계. </li><li> 스프레드 시트에있는 각 이미지에 대한 형상 계수 값을 포함하는 결과 차트를 엽니다. 각 이미지에 대해 다음과 형태론 번호를 계산합니다. <img alt="등식 1" src="/files/ftp_upload/4023/4023eq1.jpg" /></li><li> 가치와 계정에 한 샘플의 모든 이미지 복용 형태론 번호에 대한 표준 편차 계산. </lI&gt; <li> 구체적인 생산성과 형태론 번호의 그래픽 상관 관계에 대한 그래프와 데이터 분석 프로그램을 사용하여 수학적 회귀하여 수학적 관계를 결정합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 활석 마이크로 입자 대답 외에 통해 니제르 SKAn 1,015 형태는 진정한 펠렛의 형태에서 분산된 심지어 mycelial 형태로 변경됩니다. 펠렛의 형태는 표준 조건에서 전시되는 반면 mycelial 형태도 활석 마이크로 입자의 10 G / L (그림 4).와 매체의 보완으로 만들어집니다. 동시에 β-fructofuranosidase의 활동은 3 배 3-5 주위에 증가한다. 1 또는 3 G / 활석 가루의 L의 보완이 두 배 fructofuranosidase 활동 (그림 4.)으로 분산된 형태로 안내합니다. 마이크로 입자 부양 형태는 종합적 Mor로 표현할 수자동 이미지 분석에 의해 결정 매개 변수를 사용하여 계산할 수 phology 번호입니다. 동그란 부드러운 알약은 미세한 이미지에서 완벽한 동그라미로 표시됩니다. 이러한 입자 형태론 번호는 1 값을 갖습니다. mycelial 형태의 작은 조각은 0 형태론 번호를하였으며 한 차원 라인으로 단순화 할 수 있습니다. 길쭉한 불규칙 알약이나 대단히 짧은 시간과 같은 모든 중간 형태학의 양식에 따라서 0과 1 사이의 값을 가질 것이다. 비교적 큰 입자는 다소 낮은 형태론 번호 11의 큰 표면 또는 신장된 입자와 높은, 곰팡이 입자가 높아집니다. 표준 조건에서 반응기 1의 형태 전시물 0.8 주변 형태론 번호를. 10g / L 활석 가루와 원자로 4의 형태 0.1 주변 MN 있습니다. 1과 3g / L의 활석 분말 농도와 원자로 2, 3에 대한 형태론 번호는 분산된 모토를 보여주는 이러한 극단 사이에 놓여학문의 뜻. 마이크로 입자 종속 형태가 밀접 β-fructofuranosidase의 생산성과 관련이 있기 때문에, 그림 5와 비슷한 형태론 번호와 생산성 수학적 상관 관계가 얻어진다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig1.jpg" /> 그림 1. 실험 설계 및 분석 절차의 전체 구조. A. 니제르는 72 H을위한 탱크 생물 반응기를 흔들 3 패에 (마이크로 입자와 함께 또는없이) 재배된다. 24 후 48 72헥타르 샘플은 다시 구체적인 생산성의 계산에 사용되는 바이오 매스 건조 무게와 β-fructofuranosidase 활동의 결정에 대해 영향력을 행사합니다. 48 H 후 곰팡이 형태는 현미경으로 검사하고 디지털 이미지 분석의 특징. 이미지 분석 관련 매개 변수는 수학 구체적인 생산성과 상호입니다 형태론 번호로 결합됩니다. <img고도 = &quot;그림 2&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/4023/4023fig2.jpg&quot;/&gt; 그림 2. A.에서 형태학의 구조를 현미경으로 생성된 이미지에 대한 이미지 처리의 단계 니제르. 1 단계 : 현미경에 의한 이미지 수집. 2 단계 : 이미지 개선에 필요한 경우. 3 단계 : 이미지 binarization, ImageJ에서 생성된 흑백 (이진) 이미지입니다. 4 단계 : 이진 이미지를 처리​​하고 불필요한 개체가 지워집니다. 5 단계 : 형태학의 분석은 오픈 소스 프로그램 ImageJ의 &quot;입자 분석&quot;기능과 함께 진행됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig3.jpg" /> 그림 3. A. 여러 형태학의 형태 부가 마이크로 입자의 농도에 의존 니제르. 마이크로 입자로 증가 농도는 펠렛의 크기가 정확하게 작은 코어 쉘 알약, 작은 양떼와도 자유롭게 분산 균사체로 감소 수 추가했습니다. 으로의 형태론 공학서브 머 지드 문화에 마이크로 입자 보완하여 pergillus 니제르 SKAn1015. 없이 microparticles (A), 10 MG / L (B), 0.1 g / L (C) 0.2 G / L (D), 0.3 g / L (E), 0.6 g / L (F), 1.0 g / L (G), 1.5 g / L (H), 2.0 g / L (I), 2.5 g / L (J), 3.0 g / L (K), 3.5 g / L (L), 4.0 g / L (M G / L (Q), 20 G / L (R), 30 G / L (S)과), 4.5 g / L (N), 5.0 g / L (O), 10 G / L (P), 15 40~50그램 / L (T). 이미지가 재배의 72 H 후 가벼운 현미경으로 찍은 것들. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig4.jpg" /> 그림 4.의 의존도에서 Fructofuranosidase 활동 활석 마이크로 입자 농도 1g / L (반응 2), 3 G / L (반응 3)과 10 G / L (원자로 4). 반응기 1은 마이크로 입자로 보충되지 않으며 현재 재배가 표준 조건 하에서 진행됩니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig5.jpg" /> 그림 5. 형태론 대표 좋은 상관 관계 (R 2 = 0.91)숫자와 구체적인 생산성. 형태론 번호는 특정 생산성 (종좌표)에 대해 (가로 좌표)를 꾸몄다됩니다. 비선형 회귀는 기하 급수적인 상관 관계를 얻을.

<ol>
	<li>Wucherpfennig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Applied Microbiology. 72, 89-136 (2010).</li><li>Driouch, H., H&#228;nsch, R., Wucherpfennig, T., Krull, R., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+enzyme+production+by+bio-pellets+of+Aspergillus+niger:+Targeted+morphology+engineering+using+titanate+microparticles.">Improved enzyme production by bio-pellets of Aspergillus niger: Targeted morphology engineering using titanate microparticles.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109, 462-471 (2012).</li><li>Driouch, H., Roth, A., Dersch, P., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+bioprocess+for+production+of+fructofuranosidase+by+recombinant+Aspergillus+niger.">Optimized bioprocess for production of fructofuranosidase by recombinant Aspergillus niger.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 87, 2011-2024 (2010).</li><li>Driouch, H., Roth, A., Dersch, P., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+fungi+in+good+shape:+Microparticles+for+tailor-made+fungal+morphology+and+enhanced+enzyme+production.">Filamentous fungi in good shape: Microparticles for tailor-made fungal morphology and enhanced enzyme production.</a> Bioengineered Bugs. 2, 100-104 (2011).</li><li>Driouch, H., Sommer, B., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+engineering+of+Aspergillus+niger+for+improved+enzyme+production.">Morphology engineering of Aspergillus niger for improved enzyme production.</a> Biotechnology and Bioengineering. 105, 1058-1068 (2010).</li><li>Kaup, B. -. A., Ehrich, K., Pescheck, M., Schrader, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microparticle-enhanced+cultivation+of+filamentous+microorganisms:+Increased+chloroperoxidase+formation+by+Caldariomyces+fumago+as+an+example.">Microparticle-enhanced cultivation of filamentous microorganisms: Increased chloroperoxidase formation by Caldariomyces fumago as an example.</a> Biotechnology and Bioengineering. 99, 491-498 (2008).</li><li>Hirayama, M., Sumi, N., Hidaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+fructooligosaccharide-producing+beta-fructofuranosidase+from+Aspergillus+niger+ATCC+20611.">Purification and characterization of a fructooligosaccharide-producing beta-fructofuranosidase from Aspergillus niger ATCC 20611.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 53, 667-673 (2006).</li><li>Rajoka, M. 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나는 공개 할게 없다.

곰팡이 형태의 수정은 여러 수십 년 이래 생명 공학에 관심이있다. 다른 연구와 같은 산도 값, 전원 입력, 온도, 중간 영양분이나 inoculum 농도 일 선정 프로세스 매개 변수를 다양려고했는데, 반대로 형태의 다소 부정확할 및 불완전한 제어, 높은 에너지 비용, 억제 효과 또는 제품 불안정성에서 고생했습니다 마이크로 입자의 보완은 입자 크기와 농도의 미세 조정 변형을 통해 곰팡이 형태의 정밀한 엔지니어링이 가능합니다. 이것은 새로운 가능성을가 A와 biotechnological 생산 최적화 및 높은 생산 형태의 맞춤형 설계를위한 마이크로 입자를 사용하는 열립니다 니제르와 다른 filamentous 미생물. 디지털 이미지 분석은 곰팡이 매크로 형태를 특성화하기 쉽게 재현할 방법입니다. 그러나, 크기, 모양 및 표면 charac에 대한 매개 변수의 종류문학에서 설명한 형태학의 구조 ter가 복잡 곰팡이 형태의 신속한 평가를 만듭니다. 관련 매개 변수의 조합으로서 제시 형태론 번호,이 결핍을 방지하고 형태학의 구조의 포괄적인 특성화를 위해뿐만 아니라 생산성과 직접 수학적 상관 관계를위한뿐만 아니라 사용할 수 있습니다. 이것은 다시 가능한 필요한 프로세스에 주어진 형태이므로 형태의 정의에 의해 생산성 추정을 렌더링. 형태론 번호를 사용하면, 그것은 각종 펠렛과 덩어리의 morphologies 4,5 구분할 수 있습니다. 형태론 번호의 앞으로의 개발을위한 프랙탈 차원의 배려가 유망한 것으로 보인다. 프랙탈 차원은 객체 13 속성을 채울 복잡 성과 질량 측정을 제공하므로 mycelial 형태의 전체적인 특성화를 위해 predestinated됩니다. CRmycelial 성장 형태는 이전에 훨씬 더 문화 국물의 viscosities에게 2를 전시하기 위해 표시 되었기 때문에 높은 생산 mycelial 형태의 eation 그러나, 특히 대규모 재배의 공정 성능 문제로 이어질 수도 있습니다. 이것은 열 및 대량 전송 및 높은 전원 입력과 1을 작동 재배보다 비싼 확인을 필요로 활기가 아닌 혼합 지대의 형성에 문제가 발생합니다. 형태 변경 및 추가 모델에 통합되면 따라서 곰팡이 형태와 문화 국물의 점도의 관계가 고려되어야한다.

Table of Equipment:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			Equipment</td>
			<td>
			Company</td>
			<td>
			Catalogue Number/model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			autoclave</td>
			<td>
			Systec</td>
			<td>
			V150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			B&uuml;chner funnel (plastic)</td>
			<td>
			VWR</td>
			<td>
			-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			cellulose filter (for biomass dry weight)</td>
			<td>
			Sartorius Stedim Biotech</td>
			<td>
			Filter Discs Grade 389</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			cellulose acetate filter (for air filtration at reactor)</td>
			<td>
			Sartorius stedim biotech</td>
			<td>
			Midisart 200 PTFE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			cellulose acetate filter (for enzyme activity)</td>
			<td>
			Sartorius Stedim Biotech</td>
			<td>
			Midisart NML</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			centrifuge</td>
			<td>
			Eppendorf</td>
			<td>
			Centrifuge 5415R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			centrifuge</td>
			<td>
			Heraeus</td>
			<td>
			Biofuge fresco</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			centrifuge</td>
			<td>
			Heraeus sepatech</td>
			<td>
			Varifuge 3.0R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			compartment dryer (105 &deg;C)</td>
			<td>
			Heraeus</td>
			<td>
			Kelvitran t</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			control unit (temperature)</td>
			<td>
			Jumo</td>
			<td>
			Jumo iTron 08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			control unit (pH-value)</td>
			<td>
			meredos</td>
			<td>
			pH Control 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			desiccator</td>
			<td>
			Duran</td>
			<td>
			Vacuum stable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Falcon tubes</td>
			<td>
			Omnilab</td>
			<td>
			FALC352070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			heating block 40 &deg;C</td>
			<td>
			Biometra</td>
			<td>
			TB1 Thermoblock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			heating block 95 &deg;C</td>
			<td>
			HLC</td>
			<td>
			HBT 130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro plate reader</td>
			<td>
			Tecan</td>
			<td>
			Sunrise-Microplate-Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro scales</td>
			<td>
			Sartorius</td>
			<td>
			CP 225</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			microscope (digital inverted)</td>
			<td>
			AMG</td>
			<td>
			EVOS xl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro pipettes and tips (different sizes)</td>
			<td>
			Omnilab</td>
			<td>
			5283303
			5283298 
			5283299 
			5283300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro titer plate</td>
			<td>
			Nunc</td>
			<td>
			MaxiSorp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			multi pipette and tips</td>
			<td>
			Eppendorf/ Omnilab</td>
			<td>
			5283611/ 5283611</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			pH-electrode</td>
			<td>
			Schott</td>
			<td>
			pH-Meter CG840</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			reaction tubes</td>
			<td>
			Roth</td>
			<td>
			E518.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			scale</td>
			<td>
			Sartorius</td>
			<td>
			CP 3202 S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			stirred tank bioreactor with equipment</td>
			<td>
			Applikon Biotechnology</td>
			<td>
			2L Bioreactor set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			syringe</td>
			<td>
			Eppendorf</td>
			<td>
			Combitips Plus 5 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table of Reagents:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			Name of the reagent</td>
			<td>
			Company </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Acetic acid</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Disodium hydrogen phosphate</td>
			<td>
			Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Ethanol (95%)</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glucose monohydrate, (&alpha;-D-)</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glucose oxidase (Typ II from Aspergillus niger)</td>
			<td>
			Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Hydrochloride acid (37 % w/v)</td>
			<td>
			Fiedel-de Ha&euml;n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Hydrous magnesium silicate</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Monopotassium phosphate</td>
			<td>
			Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			o-dianoisidine dihydrochloride</td>
			<td>
			Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Peroxidase (Typ II from horseradish)</td>
			<td>
			Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sodium acetate</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sodium hydroxide</td>
			<td>
			Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sucrose, D-(+)</td>
			<td>
			Fluka</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Water (deionized)</td>
			<td>
			-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table of Solutions and Medium Composition:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			Solution</td>
			<td>
			Components</td>
			<td>
			Amount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			50 mM sodium acetate buffer (pH 6.5)</td>
			<td>
			Sodium acetate
			Bring to volume with deionized water
			Adjust at pH 6.5 with acetic acid</td>
			<td>
			4.1 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M monopotassium phosphate solution</td>
			<td>
			Monopotassium phosphate
			Bring to volume with deionized water</td>
			<td>
			6.805 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M disodium hydrogen phosphate solution</td>
			<td>
			Disodium hydrogen phosphate
			Bring to volume with deionized water</td>
			<td>
			7.1 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M phosphate buffer (pH 7.0)</td>
			<td>
			0.05 M disodium hydrogen phosphate solution
			Bring to volume with 0.05 M monopotassium phosphate solution</td>
			<td>
			61.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M phosphate buffer (pH 5.4)</td>
			<td>
			0.05M disodium hydrogen phosphate solution
			Bring to volume with 0.05 M monopotassium phosphate solution</td>
			<td>
			3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			1.65 M sucrose solution</td>
			<td>
			D-(+)-sucrose
			Bring to volume with phosphate buffer (pH 5.4)</td>
			<td>
			564.8 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			reagent solution</td>
			<td>
			o-Dianisidin-Dihydrochlorid
			Ethanol (95%)</td>
			<td>
			25 mg
			10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glucose reagent solution</td>
			<td>
			Glucose oxidase
			Peroxidase
			Phosphate buffer (pH 7.0)
			reagent solution</td>
			<td>
			10.5 mg
			3 mg
			90 mL
			10 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

customization of aspergillus niger morphology through addition of talc micro particles

사상균의 A. 니제르 음식에서 제약 산업에 대한 산업 공정의 넓은 범위에서 널리 사용되는 변형입니다. 이 filamentous 유기체의 가장 흥미로운 종종 지나치게 특성 중 하나는 복잡한 형태입니다. 그것은 울창한 구형 여럿 점성 mycelia (그림 1)의 범위. 다양한 공정 파라미터 및 재료 곰팡이 형태 1에 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다. 최적의 생산성이 특정 형태학의 양식을 통해 강력하게 상호 있기 때문에, 곰팡이 형태는 종종 산업 생산에서 생산성의 병목 현상을 나타냅니다. 정확하게 형태학의 모양을 제어하는 직선 전달하고 우아한 접근은 증가 효소 생산 2-6에 기여 문화 매체에 대한 무기 불용성 마이크로 입자 (함수의 마그네슘 실리 케이트, 알루미늄 산화물이나 티타늄 실리 케이트 산화물 등)의 추가이다. obv가 있기 때문에마이크로 입자 의존 형태와 효소 생산 사이에 빚을내는 간 상관 관계는 수학적으로 생산성과 형태학의 모양을 연결하는 것이 바람직하다. 따라서 양적 정확하고 전체적인 형태학의 설명으로 타겟팅됩니다. 따라서, 우리는 생성 및 특성을 미세 입자 종속 형태학의 구조를 그리고 아마도 filamentous 미생물의 morphogenesis의 더 나은 이해에 기여 생산성 (그림 1)과 곰팡이 형태 신원을 확인하도록하는 방법을 제시한다. 재조합 변형 A. 니제르 SKAn1015는 탱크 생물 반응기를 흔들 3 패 72 H 위해 재배한다. G / L 이전에 접종 1 G / L, 3 G / L와 10의 농도의 활석 마이크로 입자 외에으로 형태학의 구조의 다양한 reproducibly 생성됩니다. 멸균 샘플은 생산 효소의 성장 진행 및 활동의 결정 24, 48, 72 시간 후에 촬영됩니다.형성된 제품은 높은 가치 효소 β-fructofuranosidase, 음식이나 타인 간의 포도당 7-9으로 자당의 반응을 catalyzes 제약 업계에서 네오 설탕 형성을위한 중요한 생체 촉매이다. 따라서 자당를 추가한 후 포도당의 양을 정함은 생산되는 β-fructofuranosidase의 양을 의미합니다. 포도당 부량는 96 - 웰 마이크로 titer 플레이트의 높은 처리량 분석을 위해 수정됩니다 갓 / POD-검정 10,에 의해 이루어집니다. 72시간 후 곰팡이 형태는 현미경으로 검사하고 디지털 이미지 분석이 특징입니다. 그럼으로써 Feret의 직경과 같은 곰팡이 매크로 형태, 예상 면적, 둘레, 순환성, 화면 비율, 진원도 숙녀 단합을위한 입자 형상 요소는 오픈 소스 영상 처리 프로그램 ImageJ로 계산됩니다. 관련 매개 변수의 종합적인 특성을 가능하게 무차 형태론 번호 (MN) 11에 결합되어곰팡이 형태. 형태론 번호와 생산성의 긴밀한 상관 관계는 수학적 회귀으로 강조 표시됩니다.

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Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles

정확하게 생성하고 종합적으로 사상균의 형태와 성격 방법<em&gt; Aspergillus 니제르</em&gt;는 형태학의 모양과 생산성의 수학적 상관 관계를 허용하는 설명되어 있습니다.

의 정의 Aspergillus 니제르</em활석 마이크로 입자의 추가를 통해> 형태론

The filamentous fungus A. niger is a widely used strain in a broad range of industrial processes from food to pharmaceutical industry. One of the most ...

customization-aspergillus-niger-morphology-through-addition-talc

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient expression of effectors. Packaging lentiviral expression constructs into pseudoviral particles, however, enables up to 100% transduction, even with difficult-to-transfect cells, such as primary, stem, and differentiated cells. Moreover, the lentiviral delivery does not produce the specific cellular responses typically associated with chemical transfections, such as cell death resulting from toxicity of the transfection reagent 1, 2. When transduced into target cells, the lentiviral construct integrates into genomic DNA and provides stable expression of the small hairpin RNA (shRNA), cDNA, microRNA or reporter gene 3, 4. Target cells stably expressing the effector molecule can be isolated using a selectable marker contained in the expression vector construct such as puromycin or GFP. After pseudoviral particles infect target cells, they cannot replicate within target cells because the viral structural genes are absent and the long terminal repeats (LTRs) are designed to be self-inactivating upon transduction 5, 6.
There are three main components necessary for efficient lentiviral packaging 1, 5, 6, 7. 
1. The lentiviral expression vector that contains some of the genetic elements required for packaging, stable integration of the viral expression construct into genomic DNA, and expression of the effector or reporter. 
2. The lentiviral packaging plasmids that provide the proteins essential for transcription and packaging of an RNA copy of the expression construct into recombinant pseudoviral particles. This protocol uses the pPACK plasmids (SBI) that encode for gag, pol, and rev from the HIV or FIV genome and Vesicular Stomatitis Virus g protein (VSV-G) for the viral coat protein. 
3. 293TN producer cells (derived from HEK293 cells) that express the SV40 large T antigen, which is required for high-titer lentiviral production and a neomycin resistance gene, useful for reselecting the cells for maintenance.
An overview of the viral production protocol can be seen in Figure 1. Viral production starts by co-transfecting 293TN producer cells with the lentiviral expression vector and the packaging plasmids. Viral particles are secreted into the media. After 48-72 hours the cell culture media is harvested. Cellular debris is removed from the cell culture media, and the viral particles are precipitated by centrifugation with PEG-it for concentration. Produced lentiviral particles are then titered and can be used to transduce target cells. Details of viral titering are not included in this protocol, but can be found at:
<a href="http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf</a> 8.
This protocol has been optimized using the specific products indicated. Other reagents may be substituted, but the same results cannot be guaranteed.

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Lentiviral expression vectors are the most effective vehicles for stably expressing different effector molecules or reporter constructs in dividing and non-dividing mammalian cells and whole organisms. Here we provide a protocol on how to package lentivector expression constructs in pseudoviral particles and to transduce target cells using the pseudoviral particles.

포장 HIV 또는 FIV 기반 Lentivector 식 구조 및 VSV-G Pseudotyped 바이러스성 입자의 형질 도입

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

연구

면역학 및 감염병학

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

유동 세포 계측법에 의해 주요 면역 세포 모집단과 형광 나노 입자의 상호 작용의 검출

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or specific treatments for the disease caused by these viruses, and work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories, significantly limiting the research on these viruses. Lifecycle modeling systems model the virus lifecycle under biosafety level 2 conditions; however, until recently such systems have been limited to either individual aspects of the virus lifecycle, or a single infectious cycle. Tetracistronic minigenomes, which consist of Ebola virus non-coding regions, a reporter gene, and three Ebola virus genes involved in morphogenesis, budding, and entry (VP40, GP1,2, and VP24), can be used to produce replication and transcription-competent virus-like particles (trVLPs) containing these minigenomes. These trVLPs can continuously infect cells expressing the Ebola virus proteins responsible for genome replication and transcription, allowing us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions. Importantly, the viral components of this systems are solely derived from Ebola virus and not from other viruses (as is, for example, the case in systems using pseudotyped viruses), and VP40, GP1,2 and VP24 are not overexpressed in this system, making it ideally suited for studying morphogenesis, budding and entry, although other aspects of the virus lifecycle such as genome replication and transcription can also be modeled with this system. Therefore, the tetracistronic trVLP assay represents the most comprehensive lifecycle modeling system available for Ebola viruses, and has tremendous potential for use in investigating the biology of Ebola viruses in future. Here, we provide detailed information on the use of this system, as well as on expected results.

Work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories. Tetracistronic minigenome-containing replication and transcription-competent virus like particles (trVLPs) represent a lifecycle modeling system that allows us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions, relying exclusively on Ebola virus components.

Tetracistronic Minigenomes를 포함하는 바이러스 입자와 바이오 안전성 수준이 조건에서 에볼라 바이러스의 수명주기를 모델링

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

정량적 마이크로 중화 분석의 최적화

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase reporter, using a simple transfection procedure of the widely available HEK-293T cell line. Once formed and released from producer cells, these pseudovirions incorporate a luciferase reporter gene. Since they only contain the heterologous coronavirus spike protein on their surface, the particles behave like their native coronavirus counterparts for entry steps. As such, they are the excellent surrogates of native virions for studying viral entry into host cells. Upon successful entry and infection into target cells, the luciferase reporter gets integrated into the host cell genome and is expressed. Using a simple luciferase assay, transduced cells can be easily quantified. An important advantage of the procedure is that it can be performed in biosafety level 2 (BSL-2) facilities instead of BSL-3 facilities required for work with highly pathogenic coronaviruses such as Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV). Another benefit comes from its versatility as it can be applied to envelope proteins belonging to all three classes of viral fusion proteins, such as the class I influenza hemagglutinin (HA) and Ebola virus glycoprotein (GP), the class II Semliki forest virus E1 protein, or the class III vesicular stomatitis virus G glycoprotein. A limitation of the methodology is that it can only recapitulate virus entry steps mediated by the envelope protein being investigated. For studying other viral life cycle steps, other methods are required. Examples of the many applications these pseudotype particles can be used in include investigation of host cell susceptibility and tropism and testing the effects of virus entry inhibitors to dissect viral entry pathways used.

Here, we present a protocol to generate pseudotyped particles in a BSL-2 setting incorporating the spike protein of the highly pathogenic viruses Middle East respiratory syndrome and severe acute respiratory syndrome coronaviruses. These pseudotyped particles contain a luciferase reporter gene allowing quantification of virus entry into target host cells.

Biosafety 수준 2 설정에 높게 병원 성 Coronaviruses 공부 Pseudotyped 입자의 생산

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

유세포 측정을 사용하여 인간 백혈구에 의한 아스퍼질러스 훈증 코니디아의 식세포증 측정

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

고병원성 H5N1 및 조류 H7N9 바이러스의 엔벨로프 당단백질을 가진 고적퇴력 감염성 인플루엔자 슈도타입 입자 의 생산

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is responsible for altering infection for many of these viruses. Thus, characterizing the nature of virus-bacteria binding is a foundational step needed for elucidating the mechanism(s) by which bacteria alter viral infection. For human norovirus, commensal bacteria enhance B cell infection. The virus directly binds to these bacteria, indicating that this direct interaction is involved in the mechanism of infection enhancement. A variety of techniques can be used to quantify interactions between bacteria and viruses including scintillation counting of radiolabeled viruses and polymerase chain reaction (PCR). Both methods require the use of live virus, which may need to be generated in the laboratory. Currently, none of the established in vitro culture systems available for human norovirus are robust enough to allow for generation of highly concentrated viral stocks. In lieu of live virus, virus-like particles (VLPs) have been used to characterize the interactions between norovirus and bacteria. Herein a flow cytometry method is described with uses virus specific antibodies to quantify VLP binding to gram-negative and gram-positive bacteria. Inclusion of both bacteria only and isotype controls allowed for optimization of the assay to reduce background antibody binding and accurate quantification of VLP attachment to the bacteria tested. High VLP:bacterium ratios result in VLPs binding to large percentages of the bacterial population. However, when VLP quantities are decreased, the percent of bacteria bound also decreases. Ultimately, this method can be employed in future experiments elucidating the specific conditions and structural components that regulate norovirus:bacterial interactions.

The goal of this protocol is to quantify binding of the eukaryotic pathogen human norovirus to bacteria. After performing an initial virus-bacterium attachment assay, flow cytometry is used to detect virally-bound bacteria within the population.

유세포측정을 사용하여 공생 균에 결합하는 인간 노로바이러스 바이러스와 같은 입자 정량화

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

호스트 병원체 상호 작용의 분석을 위한 아스퍼질러스 포자를 가진 얼룩말 물고기 애벌레의 감염

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular deoxyribonucleic acid (ecDNA) is released during different forms of cell death including apoptosis, necrosis, necroptosis, neutrophil extracellular traps (NETs) and pyroptosis. Measurement of this cell death is time consuming with several different biomarkers required to identify the different biochemical forms of cell death. Measurement of ecDNA is generally conducted in serum and urine as a surrogate for renal damage, not in the actual target organ where the pathological injury occurs. The current difficulty in investigating ecDNA in the kidney is the lack of methods for formalin fixed paraffin embedded tissue (FFPE) both experimentally and in archived human kidney biopsies. This protocol provides a summary of the steps required to stain for ecDNA in FFPE tissue (both human and murine), quench autofluorescence and measure the ecDNA in the resulting images using a machine learning tool from the publicly available open source ImageJ plugin trainable Weka segmentation. Trainable Weka segmentation is applied to ecDNA within the glomeruli where the program learns to classify ecDNA. This classifier is applied to subsequent acquired kidney images, reducing the need for manual annotations of each individual image. The adaptability of the trainable Weka segmentation is demonstrated further in kidney tissue from experimental murine anti-MPO glomerulonephritis (GN), to identify NETs and ecMPO, common pathological contributors to anti-MPO GN. This method provides objective analysis of ecDNA in kidney tissue that demonstrates clearly the efficacy in which the trainable Weka segmentation program can distinguish ecDNA between healthy normal kidney tissue and diseased kidney tissue. This protocol can easily be adapted to identify ecDNA, NETs and ecMPO in other organs.

Extracellular DNA (ecDNA) released during cell death is proinflammatory and contributes to inflammation. Measurement of ecDNA at the site of injury can determine the efficacy of therapeutic treatment in the target organ. This protocol describes the use of a machine learning tool to automate measurement of ecDNA in kidney tissue.

글로메룰로네프염의 세포외 DNA의 반정화를 위한 감독된 기계 학습

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

의 정의 Aspergillus 니제르 형태론