Name: customization of aspergillus niger morphology through addition of talc micro particles
Uploaded: 2012-03-15T13:00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles at JoVE.com

Os autores agradecem o apoio financeiro concedido pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG), através da pesquisa colaborativa centro SFB 578 &quot;Do Gene ao Produto&quot; na Technische Universität Braunschweig, Alemanha.

1. Instalação do reator eo início do cultivo 4 cultivos de biorreatores no total são conduzidas. <ol><li> Usar uma 3 L bioreactor de tanque agitado com um volume de trabalho de 2,2 L para o cultivo de A. niger SKAn1015. </li><li> Despeje 72,6 g de glicose monohidratada no reator e preenchê-lo com 1,9 L de água deionizada. </li><li> Instale o equipamento reator, tais como 3 defletores, um dois seis pás do rotor da turbina de disco, um eletrodo de pH, uma entrada de gás com filtro de ar, um dedo de refrigeração, um resfriador de ar de exaustão com filtro de ar, um tubo de imersão para a amostragem estéreis com filtro de ar e mangueiras de entrada para empresas de médio, inóculo de ácido e base. </li><li> Autoclavar o reactor a 121 ° C durante 20 min. </li><li> Ligue o reactor com o reservatório de ácido-base (HCl 2 M, 2 M de NaOH) e as bombas correspondentes e configurar um valor de pH de 5,0 ± 0,05 com a unidade de controlo do pH. </li><li> Vincular o reactor com o sistema de resfriamento de água e colocar a camisa de aquecimentoem torno do recipiente de reactor. </li><li> Instalar o sensor de temperatura com a unidade de controlo correspondente e configurar uma temperatura de 37 ± 0,1 ° C na unidade de controlo da temperatura. </li><li> Coloque o motor agitação no topo do reator e trazê-lo em serviço com uma velocidade de agitação de 200 min -1. </li><li> Adicionar a estéril mínima de crescimento médio 11 calha uma das mangueiras de entrada estéreis (250 mL). Para a preparação médio de todos os componentes foram autoclavadas a 121 ° C durante 20 min e misturados. Para três cultivos os componentes incluem talco em pó (3MgO • 4SiO 2 • H2O) nas concentrações de 1 g / L (reactor 2), 3 g / L (reactor 3) e 10 g / L (reactor 4). Antes de usar, re-suspender as partículas micro em 50 mM de tampão de acetato de sódio (pH 6,5) e adicioná-lo ao meio estéril. Em culturas de controlo (sem partículas), substituir a suspensão de partículas micro por 50 mM de tampão de acetato de sódio (pH 6,5). </li><li> Adicionar a suspensão de esporos (inoculo) ums preparado no WUCHERPFENNIG et. ai (2011) 11 calha uma das mangueiras de entrada estéreis (50 ml), de modo que a concentração de esporos eleva-se a 1x10 6 mL -1. A inoculação marca o início do cultivo (h = 0 h). </li><li> Iniciar o arejamento com uma taxa de 1,0 L min -1. </li></ol> 2. Amostragem estéril após 24, 48 e 72 horas de cultivo <ol><li> Tome 50 ml de caldo de cultura estéril em um tubo de frasco. </li><li> Use amostra para determinação do peso da biomassa seca, β frutofuranosidase-atividade e análise microscópica. </li></ol> 3. Determinação da produção de biomassa seca após 24, 48 e 72 h de cultivo <ol><li> Amostras de biomassa estão a ser tomadas pelo menos em duplicado. </li><li> Peso um filtro de celulose com um micro escalas, após secagem no exsicador e colocar o filtro num funil de Buchner com bomba de vácuo ligada a jacto de água. </li><li> Filtrar um volume de amostra definido (por exemplo 10 mL) umand enxaguar o filtro com 10 mL de água desionizada para remover compostos de médio a partir da biomassa. </li><li> Rugas no filtro uma vez no meio, colocá-lo numa placa de Petri de vidro e colocá-lo em um secador de compartimento até constância de peso (pelo menos 24 h). </li><li> Arrefecer o filtro num exsicador e medir o peso. </li><li> Calcular o peso de biomassa seca como a diferença entre o peso do filtro com e sem biomassa seca dividida pelo volume da amostra utilizada. </li></ol> 4. Determinação da atividade enzimática extracelular de β-frutofuranosidase por DEUS / POD-ensaio após 24, 48 e 72 h de cultivo Armazenar as amostras em gelo constantemente enquanto trabalhava com eles. <ol><li> Filtrar 1,5 mL de suspensão de cultura calha um filtro de acetato de celulose, pressionando a suspensão de cultura com uma seringa através do filtro para um tubo de reacção. Armazenar o tubo de reacção a -20 ° C até utilização. </li><li> Para utilizar a mistura de reacção 20amostra uL e adicionar 200 uL de 1,65 M de sacarose dissolvido em tampão fosfato 0,05 M (pH 5,4) para iniciar a reacção a partir de sacarose em glicose. Cary a cabo a reacção, pelo menos, em duplicado. </li><li> Incubar a mistura de reacção a 40 ° C durante 20 min num bloco de aquecimento. Parar a reacção por incubação a 95 ° C durante 10 min num bloco de aquecimento. Arrefece-se a mistura de reacção por armazená-lo em gelo e girar para baixo a água condensada por centrifugação a 13,000 g durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Para explicar o pH e clivagem dependente da temperatura, de sacarose em glicose, efectuar um valor em branco, usando água de 20 uL deionizada em vez de 20 uL de amostra. </li><li> Para ter em conta para a glucose residual no caldo de cultura, efectuar um controlo negativo para cada amostra. Para esse fim uL utilização 20 da amostra e inactivar β frutofuranosidase-por aquecimento a 95 ° C durante 10 min antes de adicionar a sacarose e incubar como descrito no passo 4.3. </li><li> Diluir as amostras de tal modo que as medi seguintesured adsorção está na gama de valor calibrado. </li><li> Realizar todos os ensaios enzimáticos em triplicata. Aplicar 2 uL de amostra diluída numa placa de micro titulação bem. Aplicar uma gama padrão para a calibração na placa de titulação por cada micro usando 2 ul de soluções de glicose dez, com dez concentrações sabem diferente (a partir de 1 mM a 15 mM) em vez de 2 amostra uL. Para a zero pontos de calibração usar 2 uL de água deionizada em vez de 2 uL da amostra. </li><li> Adicionar 200 uL da solução de reagente a cada poço utilizando uma pipeta multi. </li><li> Incubar a mistura durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Armazenar a placa de micro titulação a 6 ° C até a medição (algumas horas no máximo). </li><li> Medir a absorção a 450 nm utilizando um de 96 poços Sunrise leitor de placas de micro eo Magellan software de recuperação de dados. Defina o tempo de mistura de até 5 seg. eo período de descanso até 1 seg. </li><li> Abra o gráfico resultado com uma planilha e construir uma curva de calibração usando a escala padrão: glucose = concentração uma absorção X + b </li><li> Calcular a atividade: atividade = (absorção valor X fator de diluição em branco) X a + b </li><li> Compreenda-se a actividade β frutofuranosidase-através do cálculo da diferença entre as actividades da amostra e do controlo negativa adequada. </li><li> Calcule a produtividade específica para o uso seguinte, tendo em conta o peso da biomassa seca e β frutofuranosidase-atividade 11. </li></ol> 5. Microscopia e Análise de Imagem automática após 72 h de cultivo <ol><li> O local de cerca de 3 mL de suspensão de cultura numa placa de Petri de plástico ediluí-los com uma solução fisiológica de cloreto de sódio até que as estruturas morfológicas são separadas. </li><li> Situar a placa de Petri sob um microscópio, que possui uma câmera integrada ou conectados. Adquirir e guardar a cerca de 100 imagens (Figura 2) das estruturas morfológicas por amostra. Preste atenção que, em cada imagem, pelo menos, um objeto é completamente retratado. </li><li> Abra todas as imagens de uma mesma amostra com o programa de processamento de imagens ImageJ 12. Converta as imagens a preto e branco, usando a ferramenta do processo &quot;Faça Binário&quot; (Figura 2). Para aplicar o comando para toda a série de imagens utilizar um código de macro como se segue. executado (, Fazer Binário &quot;) </li><li> Abra as imagens binárias processados ​​com ImageJ novamente. Calcule o diâmetro da forma fatores Feret, a área projetada, perímetro, circularidade, proporção, solidez circularidade und para cada imagem com a analisar &quot;Medição Set&quot; ferramenta. Para aplicar o comando para um series de imagens utilizar um código de macro como se segue. executado (&quot;8 bits&quot;); executado (&quot;Make Binary&quot;); executado (&quot;Scale Set ...&quot;, &quot;distância = X = conhecido pixels 1000 = 1 unidade = mM global&quot;); executado (&quot;Medidas definir ...&quot;, &quot;Exibir área de forma perímetro Féret limite redirect = decimal Nenhum = 3&quot;); executado (&quot;Analisar Partículas ...&quot;, &quot;size = circularidade 10000-Infinito = mostrar = 0,00-1,00 Esboços display&quot;); Determine X como o número de pixels que se correlaciona a 1000 mM através da construção de uma linha reta através de uma barra de escala. Correlacionar o número de pixels da linha recta com o comprimento da barra de escala na uM. </li><li> Abra o gráfico de resultado contendo valores de fator de forma para cada imagem com uma planilha. Calcular um número Morfologia como segue, para cada imagem. <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/4023/4023eq1.jpg" /></li><li> Calcular o valor médio eo desvio padrão para o número Morfologia tendo em conta todas as imagens de uma amostra. </li&gt; <li> Usar uma representação gráfica e um programa de análise de dados para a correlação gráfica do número morfologia com a produtividade específica e determinar a relação matemática por regressão matemática. </li></ol> 6. Os resultados representativos Através da adição de talco micro partículas A. niger skan 1015 morfologia é alterada de uma morfologia pelete verdadeiro para uma morfologia dispersa ou mesmo micelial. Considerando que a morfologia pelete é exposto em condições padrão uma morfologia micelial é criado por suplementação de meio com 10 g / L de micro partículas de talco (Figura 4.). Paralelamente a atividade de β-frutofuranosidase aumenta cerca de 3 3-5 vezes. A suplementação de 1 ou 3 g / L de pó de talco conduz a uma morfologia dispersa, com uma actividade frutofuranosidase duplicou (Figura 4.). A morfologia das partículas micro dependente pode ser amplamente descritos pela MorNúmero phology que pode ser calculado usando os parâmetros determinados por análise de imagem automático. Pelotas perfeitamente redonda e lisa vai em imagens microscópicas aparecem como círculos perfeitos. Para tais partículas o número Morfologia tem um valor de 1. O menor fragmento de morfologia micelial pode ser simplificada como uma linha unidimensional rendendo um número Morfologia de 0. Todas as formas intermédias morfológicas como peletes irregulares alongadas ou aglomerados, por conseguinte, ter valores entre 0 e 1. Partículas relativamente grandes irá resultar em um alto, partículas fúngicas com uma grande superfície ou partículas alongadas, em um número de Morfologia bastante baixo 11. Em condições normais, o morfologia em reator 1 exibe um número em torno de 0,8 Morfologia. A morfologia no reactor 4 com 10 g / L de talco em pó possui um Mn cerca de 0,1. O número de Morfologia para os reactores 2 e 3, com concentrações de pó de talco de 1 e 3 g / L, situa-se entre estes extremos, demonstrando uma morfo dispersologia. Uma vez que a morfologia de partícula micro dependente está intimamente relacionado com a produtividade β frutofuranosidase, uma correlação matemática do número Morfologia e produtividade semelhante à Figura 5 é obtido. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema geral do desenho experimental e do procedimento analítico. A. niger é cultivada (com ou sem micro-partículas) em um L 3 agitada bioreactor tanque durante 72 h. Após 24, 48 e 72 ha amostra é levada para a determinação do peso de biomassa seca e β frutofuranosidase-actividade, o que novamente são utilizados para o cálculo da produtividade específica. Após 48 h, a morfologia fúngica é examinada ao microscópio e caracterizado por análise de imagem digital. Parâmetros relevantes da análise de imagem são combinados para um número de Morfologia, que é matemático correlacionada com a produtividade específica. <imgalt = &quot;Figura 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4023/4023fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. Passos de processamento de imagem para imagens geradas por microscopia de estruturas morfológicas de A. niger. Passo 1: aquisição de imagens por microscópio. Passo 2: melhoria da imagem, se necessário. Passo 3: binarização da imagem, em preto-e-branco (binário) gerado no ImageJ. Passo 4: a imagem binária é processado por objecto e indesejada são apagadas. Etapa 5: análise morfológica é realizada com o &quot;Analisar partículas&quot; função do open source programa ImageJ. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig3.jpg" /> Figura 3. Diferentes formas morfológicas de A. niger dependente da concentração de micro-partículas agregado. Com o aumento da concentração de micro-partículas adicionado o tamanho pelete pode ser precisamente decresceu para pequenas core-shell pelotas, rebanhos pequenos e micélio mesmo livremente dispersa. Morfologia da engenharia comopergillus niger SKAn1015 por micro partículas suplementação em cultura submersa. Sem micropartículas (A), 10 mg / L (B), 0,1 g / L (C), 0,2 g / L (D), 0,3 g / L (E), 0,6 g / L (F), 1,0 g / L (G), 1,5 g / L (H), 2,0 g / L (I), 2,5 g / L (J), 3,0 g / L (K), 3,5 g / L (L), 4,0 g / L (M ), 4,5 g / L (N), 5,0 g / L (O), 10 g / L (P), 15 g / L (Q), 20 g / L (R), 30 g / L (S) e 40-50 g / L (T). Imagens foram feitas por microscopia de luz após 72 h de cultivo. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig4.jpg" /> Figura 4. Actividade frutofuranosidase na dependência de talco micro partículas concentração de 1 g / L (reactor 2), 3 g / L (reactor 3) e 10 g / L (reactor 4). Reactor 1 não é suplementado com micro-partículas, aqui o cultivo é conduzido sob condições padrão. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig5.jpg" /> Figura 5. Boa correlação representativas (R 2 = 0,91) do Morfologianúmero ea produtividade específica. O número de Morfologia é traçada (abcissas) contra a produtividade específica (ordenada). Regressão não linear produz a correlação exponencial.

<ol>
	<li>Wucherpfennig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Applied Microbiology. 72, 89-136 (2010).</li><li>Driouch, H., H&#228;nsch, R., Wucherpfennig, T., Krull, R., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+enzyme+production+by+bio-pellets+of+Aspergillus+niger:+Targeted+morphology+engineering+using+titanate+microparticles.">Improved enzyme production by bio-pellets of Aspergillus niger: Targeted morphology engineering using titanate microparticles.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109, 462-471 (2012).</li><li>Driouch, H., Roth, A., Dersch, P., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+bioprocess+for+production+of+fructofuranosidase+by+recombinant+Aspergillus+niger.">Optimized bioprocess for production of fructofuranosidase by recombinant Aspergillus niger.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 87, 2011-2024 (2010).</li><li>Driouch, H., Roth, A., Dersch, P., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+fungi+in+good+shape:+Microparticles+for+tailor-made+fungal+morphology+and+enhanced+enzyme+production.">Filamentous fungi in good shape: Microparticles for tailor-made fungal morphology and enhanced enzyme production.</a> Bioengineered Bugs. 2, 100-104 (2011).</li><li>Driouch, H., Sommer, B., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+engineering+of+Aspergillus+niger+for+improved+enzyme+production.">Morphology engineering of Aspergillus niger for improved enzyme production.</a> Biotechnology and Bioengineering. 105, 1058-1068 (2010).</li><li>Kaup, B. -. A., Ehrich, K., Pescheck, M., Schrader, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microparticle-enhanced+cultivation+of+filamentous+microorganisms:+Increased+chloroperoxidase+formation+by+Caldariomyces+fumago+as+an+example.">Microparticle-enhanced cultivation of filamentous microorganisms: Increased chloroperoxidase formation by Caldariomyces fumago as an example.</a> Biotechnology and Bioengineering. 99, 491-498 (2008).</li><li>Hirayama, M., Sumi, N., Hidaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+fructooligosaccharide-producing+beta-fructofuranosidase+from+Aspergillus+niger+ATCC+20611.">Purification and characterization of a fructooligosaccharide-producing beta-fructofuranosidase from Aspergillus niger ATCC 20611.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 53, 667-673 (2006).</li><li>Rajoka, M. I., Yasmeen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+productivity+of+beta-fructofuranosidase+by+a+derepressed+mutant+of+Aspergillus+niger+form+conventional+and+non-conventional+substrates.">Improved productivity of beta-fructofuranosidase by a derepressed mutant of Aspergillus niger form conventional and non-conventional substrates.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 21, 471-478 (2005).</li><li>Zuccaro, A., G&#195;&#182;tze, S., Kneip, S., Dersch, P., Seibel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailor-made+fructooligosaccharides+by+a+combination+of+substrate+and+genetic+engineering.">Tailor-made fructooligosaccharides by a combination of substrate and genetic engineering.</a> ChemBioChem. 9, 143-149 (2008).</li><li>Huggett, A. S. G., Nixon, D. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ. , (1997).</li><li>Papagianni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+fractal+nature+of+mycelial+aggregation+in+Aspergillus+niger+submerged+cultures.">Quantification of the fractal nature of mycelial aggregation in Aspergillus niger submerged cultures.</a> Microbial Cell Factories. 5, 5 (2006).</li></ol>

Não tenho nada para revelar.

A modificação da morfologia fúngica tem sido de interesse em biotecnologia desde há várias décadas. Diferentes estudos têm tentado variar os parâmetros do processo seleccionados tais como o valor de pH, de entrada de alimentação, temperatura, nutrientes médio ou concentração de inóculo 1, mas sofrem de controlo em vez imprecisa e incompleta da morfologia, elevados custos de energia, efeitos de inibição ou instabilidade do produto, em contraste, a suplementação de micro partículas permite uma engenharia precisa da morfologia fúngica através afinadas variação do tamanho de partícula e da concentração. Isso abre novas possibilidades de usar micro-partículas para otimização e de tailor-made de design da morfologia produção de alta na produção biotecnológica com A. niger e outros microorganismos filamentosos. A análise de imagem digital é um método reprodutível fácil de caracterizar a morfologia macro fungos. No entanto, a variedade de parâmetros para carac tamanho, forma e superfícieter de estruturas morfológicas descritas na literatura torna rápida avaliação da morfologia fúngica complicada. O número de Morfologia apresentado como uma combinação de parâmetros relevantes, evita esta deficiência, e pode ser usado não só para a caracterização completa de estruturas morfológicas, mas também para correlação matemática directo com a produtividade. Isso torna novamente uma estimativa de produtividade por meio da morfologia dado e, portanto, uma personalização da morfologia para o processo precisa possível. Usando o número Morfologia, é possível distinguir entre vários pelete e morfologias clump 4,5. Para o desenvolvimento ainda maior do número de Morfologia da consideração da dimensão fractal parece ser promissor. Uma dimensão fractal dá uma medida da complexidade e de massa de enchimento propriedades de um objecto 13 e é, por conseguinte, predestinados para a caracterização da morfologia global micelial. A creation de uma morfologia produção de alta micelial, no entanto, podem conduzir a problemas com o desempenho do processo especialmente no cultivo em larga escala, porque a forma de crescimento micelial foi previamente demonstrado que exibem viscosidades caldo de cultura muito maiores 2. Isto conduz a problemas com a transferência de calor e massa e formação de zonas não estagnadas mistos, as quais requerem uma entrada maior potência e tornar a cultura mais caro para operar 1. Por conseguinte, a relação entre a morfologia fúngica e viscosidade caldo de cultura deve ser considerada quando se muda a morfologia e ser incorporados em modelos adicionais.

Table of Equipment:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			Equipment</td>
			<td>
			Company</td>
			<td>
			Catalogue Number/model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			autoclave</td>
			<td>
			Systec</td>
			<td>
			V150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			B&uuml;chner funnel (plastic)</td>
			<td>
			VWR</td>
			<td>
			-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			cellulose filter (for biomass dry weight)</td>
			<td>
			Sartorius Stedim Biotech</td>
			<td>
			Filter Discs Grade 389</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			cellulose acetate filter (for air filtration at reactor)</td>
			<td>
			Sartorius stedim biotech</td>
			<td>
			Midisart 200 PTFE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			cellulose acetate filter (for enzyme activity)</td>
			<td>
			Sartorius Stedim Biotech</td>
			<td>
			Midisart NML</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			centrifuge</td>
			<td>
			Eppendorf</td>
			<td>
			Centrifuge 5415R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			centrifuge</td>
			<td>
			Heraeus</td>
			<td>
			Biofuge fresco</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			centrifuge</td>
			<td>
			Heraeus sepatech</td>
			<td>
			Varifuge 3.0R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			compartment dryer (105 &deg;C)</td>
			<td>
			Heraeus</td>
			<td>
			Kelvitran t</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			control unit (temperature)</td>
			<td>
			Jumo</td>
			<td>
			Jumo iTron 08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			control unit (pH-value)</td>
			<td>
			meredos</td>
			<td>
			pH Control 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			desiccator</td>
			<td>
			Duran</td>
			<td>
			Vacuum stable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Falcon tubes</td>
			<td>
			Omnilab</td>
			<td>
			FALC352070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			heating block 40 &deg;C</td>
			<td>
			Biometra</td>
			<td>
			TB1 Thermoblock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			heating block 95 &deg;C</td>
			<td>
			HLC</td>
			<td>
			HBT 130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro plate reader</td>
			<td>
			Tecan</td>
			<td>
			Sunrise-Microplate-Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro scales</td>
			<td>
			Sartorius</td>
			<td>
			CP 225</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			microscope (digital inverted)</td>
			<td>
			AMG</td>
			<td>
			EVOS xl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro pipettes and tips (different sizes)</td>
			<td>
			Omnilab</td>
			<td>
			5283303
			5283298 
			5283299 
			5283300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro titer plate</td>
			<td>
			Nunc</td>
			<td>
			MaxiSorp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			multi pipette and tips</td>
			<td>
			Eppendorf/ Omnilab</td>
			<td>
			5283611/ 5283611</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			pH-electrode</td>
			<td>
			Schott</td>
			<td>
			pH-Meter CG840</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			reaction tubes</td>
			<td>
			Roth</td>
			<td>
			E518.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			scale</td>
			<td>
			Sartorius</td>
			<td>
			CP 3202 S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			stirred tank bioreactor with equipment</td>
			<td>
			Applikon Biotechnology</td>
			<td>
			2L Bioreactor set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			syringe</td>
			<td>
			Eppendorf</td>
			<td>
			Combitips Plus 5 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table of Reagents:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			Name of the reagent</td>
			<td>
			Company </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Acetic acid</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Disodium hydrogen phosphate</td>
			<td>
			Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Ethanol (95%)</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glucose monohydrate, (&alpha;-D-)</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glucose oxidase (Typ II from Aspergillus niger)</td>
			<td>
			Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Hydrochloride acid (37 % w/v)</td>
			<td>
			Fiedel-de Ha&euml;n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Hydrous magnesium silicate</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Monopotassium phosphate</td>
			<td>
			Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			o-dianoisidine dihydrochloride</td>
			<td>
			Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Peroxidase (Typ II from horseradish)</td>
			<td>
			Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sodium acetate</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sodium hydroxide</td>
			<td>
			Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sucrose, D-(+)</td>
			<td>
			Fluka</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Water (deionized)</td>
			<td>
			-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table of Solutions and Medium Composition:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			Solution</td>
			<td>
			Components</td>
			<td>
			Amount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			50 mM sodium acetate buffer (pH 6.5)</td>
			<td>
			Sodium acetate
			Bring to volume with deionized water
			Adjust at pH 6.5 with acetic acid</td>
			<td>
			4.1 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M monopotassium phosphate solution</td>
			<td>
			Monopotassium phosphate
			Bring to volume with deionized water</td>
			<td>
			6.805 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M disodium hydrogen phosphate solution</td>
			<td>
			Disodium hydrogen phosphate
			Bring to volume with deionized water</td>
			<td>
			7.1 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M phosphate buffer (pH 7.0)</td>
			<td>
			0.05 M disodium hydrogen phosphate solution
			Bring to volume with 0.05 M monopotassium phosphate solution</td>
			<td>
			61.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M phosphate buffer (pH 5.4)</td>
			<td>
			0.05M disodium hydrogen phosphate solution
			Bring to volume with 0.05 M monopotassium phosphate solution</td>
			<td>
			3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			1.65 M sucrose solution</td>
			<td>
			D-(+)-sucrose
			Bring to volume with phosphate buffer (pH 5.4)</td>
			<td>
			564.8 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			reagent solution</td>
			<td>
			o-Dianisidin-Dihydrochlorid
			Ethanol (95%)</td>
			<td>
			25 mg
			10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glucose reagent solution</td>
			<td>
			Glucose oxidase
			Peroxidase
			Phosphate buffer (pH 7.0)
			reagent solution</td>
			<td>
			10.5 mg
			3 mg
			90 mL
			10 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

customization of aspergillus niger morphology through addition of talc micro particles

O fungo filamentoso A. niger é uma estirpe amplamente utilizado em uma ampla variedade de processos industriais de alimentos para a indústria farmacêutica. Uma das características mais intrigantes e muitas vezes incontrolável deste organismo filamentoso é a sua morfologia complexa. Ele varia de densas pelotas esféricas para micélios viscoso (Figura 1). Vários parâmetros de processo e ingredientes são conhecidos por influenciar morfologia fúngica 1. Dado que a produtividade ideal se correlaciona fortemente com uma forma específica morfológica, a morfologia de fungos freqüentemente representa o gargalo da produtividade na produção industrial. Uma abordagem para a frente e elegante para controlar com precisão a forma morfológica é a adição de inorgânicos insolúveis micro partículas (como silicato de magnésio hidratado, óxido de alumínio ou óxido de titânio de silicato) ao meio de cultura que contribui para a produção da enzima aumentado 2-6. Uma vez que existe uma obvUSIO correlação entre a morfologia da partícula micro dependente e produção da enzima que é desejável para matematicamente ligar a produtividade ea aparência morfológica. Portanto, uma descrição precisa e holística quantitativa morfológica se destina. Assim, apresentamos um método para gerar e caracterizar micro partículas dependentes estruturas morfológicas e correlacionar morfologia fúngica com a produtividade (Figura 1), que possivelmente contribui para uma melhor compreensão da morfogénese de microrganismos filamentosos. A estirpe recombinante A. niger SKAn1015 é cultivada por 72 h em um biorreator agitado L 3 tanque. Por adição de partículas de talco micro, em concentrações de 1 g / L, 3 g / L e 10 g / L antes da inoculação de uma variedade de estruturas morfológicas é reprodutivelmente gerado. As amostras estéreis são tomadas após 24, 48 e 72 horas para determinação do progresso o crescimento ea actividade da enzima produzida. Oproduto formado é a enzima de alto valor β frutofuranosidase-, um biocatalisador importante para a formação de neo-açúcar em alimentos ou na indústria farmacêutica, que catalisa a reacção entre outros, de sacarose a glucose 7-9. Portanto, a quantificação da glucose após a adição de sacarose implica a quantidade de produzidos β frutofuranosidase. Quantificação da glicose é feita por um GOD / POD-Assay 10, que é modificado para alto rendimento análise em placas de 96 poços de micro titulação. Morfologia fúngica após 72 horas é examinada ao microscópio e caracterizado por análise de imagem digital. Ao fazê-lo, os fatores de partículas forma de morfologia macro fungos como diâmetro Feret, a área projetada, perímetro, circularidade, proporção, solidez und circularidade são calculados com o open source de processamento de imagem programa ImageJ. Parâmetros relevantes são combinados para um número adimensional Morfologia (Mn) 11, que permite uma caracterização completa demorfologia fúngica. A estreita relação do número de Morfologia e produtividade são realçados por regressão matemática.

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Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles

Um método para gerar e precisamente para caracterizar de forma abrangente morfologia do fungo filamentoso<em&gt; Aspergillus niger</em&gt; É descrito, que permite que a correlação matemática da aparência morfológica e produtividade.

Personalização da Aspergillus niger Morfologia através da adição de partículas de talco Micro

The filamentous fungus A. niger is a widely used strain in a broad range of industrial processes from food to pharmaceutical industry. One of the most ...

customization-aspergillus-niger-morphology-through-addition-talc

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient expression of effectors. Packaging lentiviral expression constructs into pseudoviral particles, however, enables up to 100% transduction, even with difficult-to-transfect cells, such as primary, stem, and differentiated cells. Moreover, the lentiviral delivery does not produce the specific cellular responses typically associated with chemical transfections, such as cell death resulting from toxicity of the transfection reagent 1, 2. When transduced into target cells, the lentiviral construct integrates into genomic DNA and provides stable expression of the small hairpin RNA (shRNA), cDNA, microRNA or reporter gene 3, 4. Target cells stably expressing the effector molecule can be isolated using a selectable marker contained in the expression vector construct such as puromycin or GFP. After pseudoviral particles infect target cells, they cannot replicate within target cells because the viral structural genes are absent and the long terminal repeats (LTRs) are designed to be self-inactivating upon transduction 5, 6.
There are three main components necessary for efficient lentiviral packaging 1, 5, 6, 7. 
1. The lentiviral expression vector that contains some of the genetic elements required for packaging, stable integration of the viral expression construct into genomic DNA, and expression of the effector or reporter. 
2. The lentiviral packaging plasmids that provide the proteins essential for transcription and packaging of an RNA copy of the expression construct into recombinant pseudoviral particles. This protocol uses the pPACK plasmids (SBI) that encode for gag, pol, and rev from the HIV or FIV genome and Vesicular Stomatitis Virus g protein (VSV-G) for the viral coat protein. 
3. 293TN producer cells (derived from HEK293 cells) that express the SV40 large T antigen, which is required for high-titer lentiviral production and a neomycin resistance gene, useful for reselecting the cells for maintenance.
An overview of the viral production protocol can be seen in Figure 1. Viral production starts by co-transfecting 293TN producer cells with the lentiviral expression vector and the packaging plasmids. Viral particles are secreted into the media. After 48-72 hours the cell culture media is harvested. Cellular debris is removed from the cell culture media, and the viral particles are precipitated by centrifugation with PEG-it for concentration. Produced lentiviral particles are then titered and can be used to transduce target cells. Details of viral titering are not included in this protocol, but can be found at:
<a href="http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf</a> 8.
This protocol has been optimized using the specific products indicated. Other reagents may be substituted, but the same results cannot be guaranteed.

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Lentiviral expression vectors are the most effective vehicles for stably expressing different effector molecules or reporter constructs in dividing and non-dividing mammalian cells and whole organisms. Here we provide a protocol on how to package lentivector expression constructs in pseudoviral particles and to transduce target cells using the pseudoviral particles.

Embalagem HIV-FIV ou à base de construções de expressão e Lentivector Transdução de Partículas Pseudotyped VSV-G virais

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

Imunologia e Infecção

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Detecção de nanopartículas fluorescentes Interações com Primário imunitário subpopulações de células por citometria de fluxo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or specific treatments for the disease caused by these viruses, and work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories, significantly limiting the research on these viruses. Lifecycle modeling systems model the virus lifecycle under biosafety level 2 conditions; however, until recently such systems have been limited to either individual aspects of the virus lifecycle, or a single infectious cycle. Tetracistronic minigenomes, which consist of Ebola virus non-coding regions, a reporter gene, and three Ebola virus genes involved in morphogenesis, budding, and entry (VP40, GP1,2, and VP24), can be used to produce replication and transcription-competent virus-like particles (trVLPs) containing these minigenomes. These trVLPs can continuously infect cells expressing the Ebola virus proteins responsible for genome replication and transcription, allowing us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions. Importantly, the viral components of this systems are solely derived from Ebola virus and not from other viruses (as is, for example, the case in systems using pseudotyped viruses), and VP40, GP1,2 and VP24 are not overexpressed in this system, making it ideally suited for studying morphogenesis, budding and entry, although other aspects of the virus lifecycle such as genome replication and transcription can also be modeled with this system. Therefore, the tetracistronic trVLP assay represents the most comprehensive lifecycle modeling system available for Ebola viruses, and has tremendous potential for use in investigating the biology of Ebola viruses in future. Here, we provide detailed information on the use of this system, as well as on expected results.

Work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories. Tetracistronic minigenome-containing replication and transcription-competent virus like particles (trVLPs) represent a lifecycle modeling system that allows us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions, relying exclusively on Ebola virus components.

Modelando o ciclo de vida do vírus Ebola Sob Nível de Biossegurança 2 condições com partículas semelhantes a vírus contendo Tetracistronic minigenomas

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

Optimização de um Micro-quantitativa Ensaio de neutralização

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase reporter, using a simple transfection procedure of the widely available HEK-293T cell line. Once formed and released from producer cells, these pseudovirions incorporate a luciferase reporter gene. Since they only contain the heterologous coronavirus spike protein on their surface, the particles behave like their native coronavirus counterparts for entry steps. As such, they are the excellent surrogates of native virions for studying viral entry into host cells. Upon successful entry and infection into target cells, the luciferase reporter gets integrated into the host cell genome and is expressed. Using a simple luciferase assay, transduced cells can be easily quantified. An important advantage of the procedure is that it can be performed in biosafety level 2 (BSL-2) facilities instead of BSL-3 facilities required for work with highly pathogenic coronaviruses such as Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV). Another benefit comes from its versatility as it can be applied to envelope proteins belonging to all three classes of viral fusion proteins, such as the class I influenza hemagglutinin (HA) and Ebola virus glycoprotein (GP), the class II Semliki forest virus E1 protein, or the class III vesicular stomatitis virus G glycoprotein. A limitation of the methodology is that it can only recapitulate virus entry steps mediated by the envelope protein being investigated. For studying other viral life cycle steps, other methods are required. Examples of the many applications these pseudotype particles can be used in include investigation of host cell susceptibility and tropism and testing the effects of virus entry inhibitors to dissect viral entry pathways used.

Here, we present a protocol to generate pseudotyped particles in a BSL-2 setting incorporating the spike protein of the highly pathogenic viruses Middle East respiratory syndrome and severe acute respiratory syndrome coronaviruses. These pseudotyped particles contain a luciferase reporter gene allowing quantification of virus entry into target host cells.

Produção de partículas Pseudotyped para estudar a alta patogenicidade coronavírus em uma configuração de nível 2 de biossegurança

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

Medição de phagocitose de Aspergillus fumigatus Conidia por Leukocytes Humanos usando citometria flow

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

Produção de partículas pseudodigitadas de gripe infecciosa de alto titer com glicoproteínas envelope de vírus H5N1 e H7N9 altamente patogênicos

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is responsible for altering infection for many of these viruses. Thus, characterizing the nature of virus-bacteria binding is a foundational step needed for elucidating the mechanism(s) by which bacteria alter viral infection. For human norovirus, commensal bacteria enhance B cell infection. The virus directly binds to these bacteria, indicating that this direct interaction is involved in the mechanism of infection enhancement. A variety of techniques can be used to quantify interactions between bacteria and viruses including scintillation counting of radiolabeled viruses and polymerase chain reaction (PCR). Both methods require the use of live virus, which may need to be generated in the laboratory. Currently, none of the established in vitro culture systems available for human norovirus are robust enough to allow for generation of highly concentrated viral stocks. In lieu of live virus, virus-like particles (VLPs) have been used to characterize the interactions between norovirus and bacteria. Herein a flow cytometry method is described with uses virus specific antibodies to quantify VLP binding to gram-negative and gram-positive bacteria. Inclusion of both bacteria only and isotype controls allowed for optimization of the assay to reduce background antibody binding and accurate quantification of VLP attachment to the bacteria tested. High VLP:bacterium ratios result in VLPs binding to large percentages of the bacterial population. However, when VLP quantities are decreased, the percent of bacteria bound also decreases. Ultimately, this method can be employed in future experiments elucidating the specific conditions and structural components that regulate norovirus:bacterial interactions.

The goal of this protocol is to quantify binding of the eukaryotic pathogen human norovirus to bacteria. After performing an initial virus-bacterium attachment assay, flow cytometry is used to detect virally-bound bacteria within the population.

Quantificando partículas semelhantes a vírus norovírus humanos ligando-se a bactérias commensal usando citometria de fluxo

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

Infecção de larvas de zebrafish com esporos de Aspergillus para análise de interações hospedeiro-patógeno

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular deoxyribonucleic acid (ecDNA) is released during different forms of cell death including apoptosis, necrosis, necroptosis, neutrophil extracellular traps (NETs) and pyroptosis. Measurement of this cell death is time consuming with several different biomarkers required to identify the different biochemical forms of cell death. Measurement of ecDNA is generally conducted in serum and urine as a surrogate for renal damage, not in the actual target organ where the pathological injury occurs. The current difficulty in investigating ecDNA in the kidney is the lack of methods for formalin fixed paraffin embedded tissue (FFPE) both experimentally and in archived human kidney biopsies. This protocol provides a summary of the steps required to stain for ecDNA in FFPE tissue (both human and murine), quench autofluorescence and measure the ecDNA in the resulting images using a machine learning tool from the publicly available open source ImageJ plugin trainable Weka segmentation. Trainable Weka segmentation is applied to ecDNA within the glomeruli where the program learns to classify ecDNA. This classifier is applied to subsequent acquired kidney images, reducing the need for manual annotations of each individual image. The adaptability of the trainable Weka segmentation is demonstrated further in kidney tissue from experimental murine anti-MPO glomerulonephritis (GN), to identify NETs and ecMPO, common pathological contributors to anti-MPO GN. This method provides objective analysis of ecDNA in kidney tissue that demonstrates clearly the efficacy in which the trainable Weka segmentation program can distinguish ecDNA between healthy normal kidney tissue and diseased kidney tissue. This protocol can easily be adapted to identify ecDNA, NETs and ecMPO in other organs.

Extracellular DNA (ecDNA) released during cell death is proinflammatory and contributes to inflammation. Measurement of ecDNA at the site of injury can determine the efficacy of therapeutic treatment in the target organ. This protocol describes the use of a machine learning tool to automate measurement of ecDNA in kidney tissue.

Aprendizado de Máquina Supervisionado para Semi-Quantificação de DNA Extracelular em Glomerulonephritis

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...