Name: customization of aspergillus niger morphology through addition of talc micro particles
Uploaded: 2012-03-15T13:00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles at JoVE.com

Yazarlar minnetle Technische Universität Braunschweig, Almanya&#39;da &quot;Gen itibaren Ürün için&quot; ortak araştırma merkezi SFB 578 ile Alman Araştırma Topluluğu (DFG) tarafından sağlanan mali destek için minnettarım.

1. Yetiştiği Reaktör Kurulum ve Başlangıç Toplam 4 biyoreaktör kültivasyonları gerçekleştirilmektedir. <ol><li> A. ekimi için 2.2 L bir çalışma hacmi ile 3 L karıştırılan tank biyoreaktör kullanın Nijer SKAn1015. </li><li> Reaktöre 72,6 g glukoz monohidrat dökün ve 1,9 L deiyonize su ile doldurunuz. </li><li> 3 gibi tamponlar olarak reaktör ekipmanları, iki altı kanatlı diski türbin çarkı, pH elektrodu, hava filtresi ile bir gaz girişi, bir soğutma parmak, hava filtresi ile bir egzoz hava soğutucu, hava filtresi ile steril örnekleme için daldırma tüp yükleyin orta, inokulum, asit ve baz ve giriş hortumlarının. </li><li> 20 dakika boyunca 121 ° C&#39;de reaktör otoklava. </li><li> Asit-baz rezervuar (2 M HCl, 2 M NaOH) ve ilgili pompaları ile reaktör bağlayın ve pH kontrol ünitesi ile 5.0 bir pH değeri ± 0.05 kurmak. </li><li> Soğutma suyu sistemi ile birlikte reaktöre bağlamak ve ısıtma ceketi koymakreaktör damar etrafında. </li><li> İlgili kontrol ünitesi ile sıcaklık sensörü takın ve 37 lik bir sıcaklık kurmak ± 0.1 ° C sıcaklık kontrol ünitesinde. </li><li> Reaktörün tepesine ajitasyon motoru Fit ve 200 dk -1 bir ajitasyon hızı ile hizmet getirmek. </li><li> Steril minimal büyüme ortamında 11 oluk steril bir giriş hortumlarının (250 mL) içinde bir ekleme. Orta hazırlanması için, tüm bileşenler 20 dakika süreyle 121 ° C&#39;de otoklavda ve karıştırılmıştır. Üç kültivasyonları için bileşenleri talk 1 g / L arasında konsantrasyonlarda tozu (3MgO • • 4SiO 2 H 2 O) (reaktör 2), 3 g / L (reaktöre 3) ve 10 g / L (reaktör 4) içerir. Kullanmadan önce, 50 mM sodyum asetat tampon (pH 6.5) içinde mikro parçacıklar yeniden askıya ve steril besiyeri ekleyin. Kontrol kültürlerinde (parçacıklar olmadan) 50 mM sodyum asetat tampon (pH 6.5) ile mikro partikül süspansiyon yerini alır. </li><li> Spor süspansiyon (inokulum) bir ekles Wucherpfennig et hazırlanmıştır. diğerleri (2011) 11 bu nedenle çukur steril bir giriş hortumlarının (50 mL) içinde bir 6 olduğu 1x10 mL -1 sporların miktarda konsantrasyonu. Inokülasyon ekiminin başlangıcı (h = 0 h) işaretler. </li><li> 1.0 L dk -1 oranı ile havalandırma başlayın. </li></ol> 2. Steril 24 sonra Örnekleme, 48 ve Yetiştirme 72 saat <ol><li> Bir flacon tüp içine steril kültür bulyonu 50 mL al. </li><li> Biyokütle kuru ağırlık, β-fructofuranosidase aktivite ve mikroskopik analiz belirlenmesi için numune kullanın. </li></ol> 3. 24 sonrası Biyokütle Kuru Ağırlık Tayini, 48 ve Yetiştirme 72 saat <ol><li> Biyokütle numuneleri en az iki kez alınmalıdır. </li><li> Ağırlık desikatörde kuruma ve bağlı su jeti vakum pompası ile Büchner huni filtre yerleştirdikten sonra bir mikro ölçeklerde bir selüloz filtre. </li><li> Tanımlanmış bir numune hacmi (örneğin 10 mL) bir filtrend biyokütleden orta bileşikler kaldırmak için 10 ml deiyonize su ile filtre durulayın. </li><li> Kırışıklık filtresi kez ortasında, bir cam petri koyun ve ağırlık sabitliği (en az 24 saat) kadar kurutma bölmesine koydu. </li><li> Bir desikatörde filtre soğutulur ve ağırlık ölçer. </li><li> Ve kullanılan örnek hacmi bölünmesiyle kurutulmuş biyokütle olmadan filtre ağırlığı arasındaki fark olarak biyokütle kuru ağırlık hesaplayabilir. </li></ol> 4. 24 sonrası TANRI / POD-kompozisyon ile β-fructofuranosidase ve Ekstrasellüler Enzimatik aktivitenin belirlenmesi, 48 ve Yetiştirme 72 saat Onlarla çalışırken sürekli buz örnekleri saklayın. <ol><li> Filtre 1.5 mL kültür süspansiyonu bir reaksiyon teknesi tüp içine filtre aracılığıyla bir şırınga ile kültür süspansiyon basarak bir selüloz asetat filtre. Kullanıma kadar -20 ° C&#39;de reaksiyon tüpü saklayın. </li><li> Reaksiyon karışımı 20 kullanmak içinuL numune ve glikoz sukroz gelen tepkimesini başlatabildiği için 0.05 M fosfat tampon maddesi (pH 5.4) içinde çözülmüş, 1,65 M sakaroz ve 200 uL ekleyebilir. En azından reaksiyonunu Cary çoğaltın. </li><li> Bir ısıtma blok içinde 20 dakika süreyle 40 ° C&#39;de inkübe Reaksiyon karışımı. Bir ısıtma blok içinde 10 dakika süreyle 95 ° C&#39;de kuluçkaya reaksiyonu durdurmak. Buz üzerinde saklayarak Reaksiyon karışımı soğutulur ve 10 dakika 4 ° C&#39;de 13,000 g&#39;de için santrifüj ile kondanse su aşağı doğru dönmeye </li><li> PH ve glikoz sakkaroz sıcaklığa bağlı bölünme dikkate almak için, 20 uL deiyonize su yerine 20 uL örnek kullanarak boş bir değer yürütmek. </li><li> Kültür suyu kalıntı glukoz dikkate almak için, her bir örnek için negatif bir kontrol yürütmek. Bu amaçla kullanılması 20 numune uL ve sukroz ve ilave olarak adım 4,3 tarif inkübe önce 10 dakika süreyle 95 ° C&#39;de ısıtılarak β-fructofuranosidase inaktive etmek için. </li><li> Öyle ki örnekleri aşağıdaki ölçüm seyreltilirçıkılması önlenmektedir adsorpsiyon kalibre edilmiş bir değer aralığı içindedir. </li><li> Üç kopya olarak tüm enzimatik testler yapın. Iyi bir mikro titrede plaka 2 uL seyreltilmiş numune uygulayın. Yerine 2 uL örnek on farklı Know konsantrasyonlarda (1 mM ile 15 mM) ile on glukoz çözümleri 2 uL kullanarak her tarafından mikro titre plaka üzerinde kalibrasyon için bir standart uygular. Sıfır noktası kalibrasyon 2 uL deiyonize su yerine 2 uL örnek kullanmak için. </li><li> Bir çok pipet kullanılarak her oyuğa reaktifi çözeltinin 200 uL ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika süreyle inkübe karışımı. </li><li> 6 mikro titre plakası Mağaza ° ölçümü (en az birkaç saat) kadar C. </li><li> Bir 96-Gün Doğumu mikro plaka okuyucu ve Magellan veri alma yazılımı kullanılarak 450 nm dalga boyunda absorpsiyon ölçün. 5 sn karıştırma zamanı ayarlayın. ve en fazla 1 sn dinlenme süresi. </li><li> Elektronik tablo ile sonuç grafiği açın ve standart aralığı kullanarak bir kalibrasyon hat inşa: glucose konsantrasyonu = Bir X emme + b </li><li> Aktivite hesaplayın: aktivite = (soğurma X sulandırma faktörü-boş değer) X a + b </li><li> Örnek etkinlikleri ve uygun negatif kontrol arasındaki fark hesaplanarak β-fructofuranosidase aktivite bulmaya çalışın. </li><li> Hesap biyokütle kuru ağırlığı ve β-fructofuranosidase aktivite 11 dikkate alarak aşağıdaki kullanım için özel verimlilik hesaplayın. </li></ol> 5.. Yetiştiği 72 saat sonra Mikroskopi ve Otomatik Görüntü Analizi <ol><li> Yer yaklaşık 3 ml kültürü bir plastik Petri kabındaki süspansiyon vemorfolojik özellikleri ayrılır kadar fizyolojik sodyum klorür çözeltisi ile seyreltilmiş. </li><li> Entegre veya bağlı kamera, mikroskop altında Petri, kalorifer. Örnek başına morfolojik yapıları yaklaşık 100 görüntü (Şekil 2) edinin ve kaydedin. Her bir fotoğraf, en az bir nesne tamamen resmedilmiştir dikkat ediniz. </li><li> Görüntü işleme programı ImageJ 12 ile aynı örnek tüm görüntüleri açın. Süreci aracını kullanarak siyah ve beyaz (Şekil 2) &quot;İkili olun&quot; görüntüleri dönüştürün. Görüntülerin dizi için komut uygulamak için aşağıdaki gibi bir makro kodunu kullanabilirsiniz. çalıştırın (, İkili Yap &quot;) </li><li> Tekrar ImageJ ile işlenmiş ikili görüntüleri açın. Şekil faktörleri Feret çapı, projeksiyon alanı, çevre, dairesellik, boy oranı, analiz aracı &quot;Ölçüm&quot; ile her görüntü için yuvarlaklık und sağlamlığına hesaplayın. Bir seri için komutu uygulamak içinGörüntülerin es aşağıdaki gibi bir makro kodunu kullanabilirsiniz. (&quot;8 bit&quot;) çalıştırın; (&quot;İkili Yap&quot;) çalıştırabilirsiniz; (&quot;Set Ölçeği ...&quot;, &quot;mesafe = X bilinen = 1000 piksel = 1 birim = mikron küresel&quot;) çalıştırabilirsiniz; (&quot;Set Ölçümleri ...&quot;, &quot;alan çevre şekli Feret sınırlarını ekran = Yok ondalık = 3 yönlendirme&quot;) çalıştırın; (&quot;Parçacıklar Analiz ...&quot;, &quot;size = 10000-Infinity dairesellik = 0,00-1,00 gösterisi = ekran Outlines&quot;) çalıştırın; Bir ölçek çubuğu üzerinde düz bir çizgi oluşturarak 1000 mikron ilişkilendirir piksel sayısını X olarak belirleyin. Mikron ölçeğinde in çubuk uzunluğu ile düz çizgi arasında piksel sayısını ilişkilidir. </li><li> Elektronik tablo ile her resim için şekil faktörü değerleri içeren sonuç grafiği açın. Her bir görüntü için aşağıdaki bir Morfoloji sayısını hesaplayın. <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/4023/4023eq1.jpg" /></li><li> Değer ve dikkate bir örnek tüm fotoğraf çekmek Morfoloji numarası için standart sapma hesaplanır. </li&gt; <li> Özel verimlilik ile Morfoloji sayıda grafik korelasyon için bir grafik ve veri analizi programı kullanın ve matematiksel regresyon ile matematiksel ilişkiyi belirler. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Talk mikro parçacıklar A. eklenmesiyle Nijer Skan 1015 morfoloji gerçek bir pelet morfolojiden dağınık bir hatta misel morfolojisi değişti. Pelet morfolojisi standart koşullar sergilenmektedir Oysa bir misel morfolojisi talk mikro parçacıklar 10 g / L (Şekil 4). Orta takviyesi tarafından oluşturulur. Aynı zamanda β-fructofuranosidase aktivitesini 3 kat 3-5 etrafında arttırır. 1 ya da 3 g / L talk pudra bir takviye bir katına fructofuranosidase aktivitesi (Şekil 4). Ile, bir dağılmış morfolojisi yol açar. Mikro partikül bağımlı morfolojisi kapsamlı Mor tarafından tarif edilebilirOtomatik görüntü analizi ile belirlendi parametreleri kullanılarak hesaplanabilir yapıdaki sayısı. Mükemmel yuvarlak ve yumuşak granül mikroskobik görüntüleri mükemmel daireler olarak görünür. Bu tür partiküller için morfoloji numarası 1 bir değere sahiptir. Misel morfoloji en küçük parçası 0 bir Morfoloji numarası veren tek boyutlu bir hat olarak basitleştirilmiş olabilir. Uzamış düzensiz pelet veya öbekler gibi tüm ara morfolojik formları nedenle 0 ve 1 arasında değerler olacaktır. Oldukça büyük partiküller oldukça düşük sayıda morfoloji 11 geniş bir yüzey veya ince uzun parçacıklar yüksek bir mantar partikülleri, sonuçlanacaktır. Standart şartlarda reaktör 1 morfolojisi sergileyen 0,8 etrafında bir Morfoloji numarası. 10 g / L talk pudra ile birlikte reaktöre 4 morfolojisi 0,1 etrafında bir Mn sahiptir. 1 ve 3 g / L, talk pudra konsantrasyonları ile reaktörler 2 ve 3 için Morfoloji sayısı dağınık bir biçim gösteren, bu iki uç arasında yer almaktadırlogy. Mikro partikül bağımlı morfolojisi yakından β-fructofuranosidase verimliliği ile ilgili olduğundan, Şekil 5&#39;e benzer Morfoloji sayısı ve verimlilik matematiksel bir korelasyon elde edilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig1.jpg" /> Şekil 1. Deneysel tasarım ve analitik prosedür genel şeması. A. Nijer 72 saat boyunca tankı biyoreaktör karıştırılmış bir 3 L (mikro parçacıklar olan veya olmayan) yetiştirilmektedir. 24 saat sonra, 48 ve 72 ha Örnek tekrar özel verimlilik hesaplanması için kullanılmaktadır biyokütle kuru ağırlık ve β-fructofuranosidase aktivitesi, belirlenmesi için alınır. 48 saat sonra mantar morfolojisi mikroskopta incelenir ve dijital görüntü analizi ile karakterizedir. Görüntü analizi ve ilgili parametrelerin matematiksel özel verimlilik ile korele bir Morfoloji numarası için birleştirilmiştir. <imgalt = &quot;Şekil 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4023/4023fig2.jpg&quot; /&gt; Şekil 2. A. morfolojik yapılarının mikroskobik oluşturulan görüntüler için görüntü işleme Aşamaları Nijer. Adım 1: mikroskopta görüntü elde etme. Adım 2: görüntü iyileştirme gerekirse. Adım 3: Görüntü İkiye Ayırma, ImageJ üretilen siyah-beyaz (ikili) görüntü. Adım 4: ikili görüntü ile işlenir ve istenmeyen bir nesne temizlenir. Adım 5: morfolojik analiz açık kaynak program İmageJ olan &quot;parçacıklar Analiz&quot; fonksiyonu ile yapılır. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig3.jpg" /> Şekil 3. A. Farklı morfolojik katma mikro parçacıklar konsantrasyonuna bağlı Nijer. Mikro parçacıklar sayesinde artan konsantrasyonu pelet boyutu tam olarak küçük bir çekirdek kabuğu topakları, küçük sürüler ve hatta serbestçe dağılmış misel kadar azaltılabilir ekledi. As Morfoloji mühendisliğibatık kültüründe mikro partikül takviyesiyle pergillus Nijer SKAn1015. Olmadan mikro (A), 10 mg / L (B), 0.1 g / L (C), 0.2 g / L (D), 0.3 g / L (E), 0.6 g / L (F), 1.0 g / L (G), 1.5 g / L (H), 2.0 g / L (I), 2.5 g / L (J), 3.0 g / L (K), 3.5 g / L (L), 4.0 g / L (M g / L (Q), 20 g / L (R), 30 g / L (S) ve), 4.5 g / L (N), 5.0 g / L (O), 10 g / L (P), 15 40-50 g / L (T). Görüntüler ekiminin 72 saat sonra ışık mikroskobu alınmıştır. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig4.jpg" /> Şekil 4. Bağımlılığı in Fructofuranosidase aktivitesi talk mikro partikül konsantrasyonu 1 g / L (reaktör 2), 3 g / L (reaktöre 3) ve 10 g / L (reaktör 4). Reaktör 1 mikro partikülleri ilave edilmez; burada kültivasyonu standart koşullar altında yapılır. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/4023/4023fig5.jpg" /> Şekil 5. Morfoloji Temsilcisi iyi bir korelasyon (R 2 = 0.91)numarası ve spesifik üretkenliği. Morfoloji numarası özel verimlilik (ordinat) karşı (apsis) çizilir. Doğrusal olmayan regresyon üstel korelasyon verir.

<ol>
	<li>Wucherpfennig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Applied Microbiology. 72, 89-136 (2010).</li><li>Driouch, H., H&#228;nsch, R., Wucherpfennig, T., Krull, R., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+enzyme+production+by+bio-pellets+of+Aspergillus+niger:+Targeted+morphology+engineering+using+titanate+microparticles.">Improved enzyme production by bio-pellets of Aspergillus niger: Targeted morphology engineering using titanate microparticles.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109, 462-471 (2012).</li><li>Driouch, H., Roth, A., Dersch, P., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+bioprocess+for+production+of+fructofuranosidase+by+recombinant+Aspergillus+niger.">Optimized bioprocess for production of fructofuranosidase by recombinant Aspergillus niger.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 87, 2011-2024 (2010).</li><li>Driouch, H., Roth, A., Dersch, P., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+fungi+in+good+shape:+Microparticles+for+tailor-made+fungal+morphology+and+enhanced+enzyme+production.">Filamentous fungi in good shape: Microparticles for tailor-made fungal morphology and enhanced enzyme production.</a> Bioengineered Bugs. 2, 100-104 (2011).</li><li>Driouch, H., Sommer, B., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+engineering+of+Aspergillus+niger+for+improved+enzyme+production.">Morphology engineering of Aspergillus niger for improved enzyme production.</a> Biotechnology and Bioengineering. 105, 1058-1068 (2010).</li><li>Kaup, B. -. A., Ehrich, K., Pescheck, M., Schrader, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microparticle-enhanced+cultivation+of+filamentous+microorganisms:+Increased+chloroperoxidase+formation+by+Caldariomyces+fumago+as+an+example.">Microparticle-enhanced cultivation of filamentous microorganisms: Increased chloroperoxidase formation by Caldariomyces fumago as an example.</a> Biotechnology and Bioengineering. 99, 491-498 (2008).</li><li>Hirayama, M., Sumi, N., Hidaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+fructooligosaccharide-producing+beta-fructofuranosidase+from+Aspergillus+niger+ATCC+20611.">Purification and characterization of a fructooligosaccharide-producing beta-fructofuranosidase from Aspergillus niger ATCC 20611.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 53, 667-673 (2006).</li><li>Rajoka, M. I., Yasmeen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+productivity+of+beta-fructofuranosidase+by+a+derepressed+mutant+of+Aspergillus+niger+form+conventional+and+non-conventional+substrates.">Improved productivity of beta-fructofuranosidase by a derepressed mutant of Aspergillus niger form conventional and non-conventional substrates.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 21, 471-478 (2005).</li><li>Zuccaro, A., G&#195;&#182;tze, S., Kneip, S., Dersch, P., Seibel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailor-made+fructooligosaccharides+by+a+combination+of+substrate+and+genetic+engineering.">Tailor-made fructooligosaccharides by a combination of substrate and genetic engineering.</a> ChemBioChem. 9, 143-149 (2008).</li><li>Huggett, A. S. G., Nixon, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+glucose+oxidase,+peroxidase,+and+o-dianisidin+in+determination+of+blood+and+urinary+glucose.">Use of glucose oxidase, peroxidase, and o-dianisidin in determination of blood and urinary glucose.</a> The Lancet. , 270-368 (1957).</li><li>Wucherpfenning, T., Hestler, T., Krull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+engineering+-+Osmolality+and+its+effect+on+Aspergillus+niger+morphology+and+productivity.">Morphology engineering - Osmolality and its effect on Aspergillus niger morphology and productivity.</a> Microb. Cell Fact. 10, (2011).</li><li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ. , (1997).</li><li>Papagianni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+fractal+nature+of+mycelial+aggregation+in+Aspergillus+niger+submerged+cultures.">Quantification of the fractal nature of mycelial aggregation in Aspergillus niger submerged cultures.</a> Microbial Cell Factories. 5, 5 (2006).</li></ol>

Ben ifşa hiçbir şey yok.

Mantar morfolojik değişiklikler, uzun yıllar beri biyoteknoloji ilgi olmuştur. Farklı çalışmalarda, pH değeri, güç girişi, sıcaklık, orta besinlerin veya inokulum konsantrasyonu 1 olarak seçilen proses parametreleri değiştirmek için çalıştı, ama aksine morfolojisi oldukça özensiz ve eksik kontrolü, yüksek enerji maliyetleri, önleme etkisi veya ürün istikrarsızlık, acı var parçacıklarının mikro takviyesi parçacık boyutu ve konsantrasyon ince ayarlanmış değişimi yoluyla fungal morfolojisi kesin bir mühendislik sağlar. Bu yeni olanaklar A. ile biyoteknolojik üretim optimizasyonu ve yüksek üreten morfoloji ısmarlama tasarım için mikro parçacıklar kullanmak açar Nijer ve diğer ipliksi mikroorganizma. Dijital görüntü analizi fungal makro morfolojisi karakterize etmek için kolay bir tekrarlanabilir bir yöntemdir. Ancak, boyut, şekil ve yüzey karakteristik için parametrelerin çeşitliLiteratürde tanımlanan morfolojik yapıları ter karmaşık mantar morfoloji hızlı değerlendirme yapar. Ilgili parametrelerin bir birleşimi olarak sunulan Morfoloji sayısı, bu eksikliği ortadan kaldırır ve morfolojik yapılarının kapsamlı karakterizasyonu için değil, aynı zamanda verimliliği ile doğrudan matematiksel bir korelasyon için sadece kullanılabilir. Bu da mümkün ihtiyacı süreci için verilen morfolojisi ve bu nedenle morfolojisi bir özelleştirme ile verimlilik tahmini vermektedir. Morfoloji numarasını kullanarak, çeşitli pelet ve ağır adımlarla yürümek morfolojileri 4,5 ayırt etmek mümkündür. Morfoloji sayısının daha da geliştirilmesi için fraktal boyutunun dikkate umut vermektedir. A fraktal boyut bir nesne 13 özellikleri dolum karmaşıklığı ve kütlesinin bir ölçüm vermekte ve bu nedenle misel morfolojisinin bütünsel karakterizasyonu için predestinated edilir. Crmisel büyüme formu daha önce çok daha büyük bir kültür suyu viskoziteleri 2 sergiledikleri gösterilmiştir çünkü yüksek üreten misel morfolojisi eation Ancak, özellikle büyük ölçekli ekimi işlemi performans sorunlarına yol açabilir. Bu ısı ve kütle transferi ve daha yüksek bir güç girişi ve 1 işletmek ekimi daha pahalı hale gerektiren durgun olmayan karışık bölgeleri, oluşumu ile ilgili sorunlara yol açabilir. Morfolojisi değişen ve daha modellerinde dahil edilebilir, bu nedenle fungal morfoloji ve kültür bulyonu viskozite arasındaki ilişkiyi göz önüne alınmalıdır.

Table of Equipment:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			Equipment</td>
			<td>
			Company</td>
			<td>
			Catalogue Number/model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			autoclave</td>
			<td>
			Systec</td>
			<td>
			V150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			B&uuml;chner funnel (plastic)</td>
			<td>
			VWR</td>
			<td>
			-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			cellulose filter (for biomass dry weight)</td>
			<td>
			Sartorius Stedim Biotech</td>
			<td>
			Filter Discs Grade 389</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			cellulose acetate filter (for air filtration at reactor)</td>
			<td>
			Sartorius stedim biotech</td>
			<td>
			Midisart 200 PTFE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			cellulose acetate filter (for enzyme activity)</td>
			<td>
			Sartorius Stedim Biotech</td>
			<td>
			Midisart NML</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			centrifuge</td>
			<td>
			Eppendorf</td>
			<td>
			Centrifuge 5415R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			centrifuge</td>
			<td>
			Heraeus</td>
			<td>
			Biofuge fresco</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			centrifuge</td>
			<td>
			Heraeus sepatech</td>
			<td>
			Varifuge 3.0R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			compartment dryer (105 &deg;C)</td>
			<td>
			Heraeus</td>
			<td>
			Kelvitran t</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			control unit (temperature)</td>
			<td>
			Jumo</td>
			<td>
			Jumo iTron 08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			control unit (pH-value)</td>
			<td>
			meredos</td>
			<td>
			pH Control 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			desiccator</td>
			<td>
			Duran</td>
			<td>
			Vacuum stable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Falcon tubes</td>
			<td>
			Omnilab</td>
			<td>
			FALC352070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			heating block 40 &deg;C</td>
			<td>
			Biometra</td>
			<td>
			TB1 Thermoblock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			heating block 95 &deg;C</td>
			<td>
			HLC</td>
			<td>
			HBT 130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro plate reader</td>
			<td>
			Tecan</td>
			<td>
			Sunrise-Microplate-Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro scales</td>
			<td>
			Sartorius</td>
			<td>
			CP 225</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			microscope (digital inverted)</td>
			<td>
			AMG</td>
			<td>
			EVOS xl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro pipettes and tips (different sizes)</td>
			<td>
			Omnilab</td>
			<td>
			5283303
			5283298 
			5283299 
			5283300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro titer plate</td>
			<td>
			Nunc</td>
			<td>
			MaxiSorp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			multi pipette and tips</td>
			<td>
			Eppendorf/ Omnilab</td>
			<td>
			5283611/ 5283611</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			pH-electrode</td>
			<td>
			Schott</td>
			<td>
			pH-Meter CG840</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			reaction tubes</td>
			<td>
			Roth</td>
			<td>
			E518.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			scale</td>
			<td>
			Sartorius</td>
			<td>
			CP 3202 S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			stirred tank bioreactor with equipment</td>
			<td>
			Applikon Biotechnology</td>
			<td>
			2L Bioreactor set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			syringe</td>
			<td>
			Eppendorf</td>
			<td>
			Combitips Plus 5 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table of Reagents:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			Name of the reagent</td>
			<td>
			Company </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Acetic acid</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Disodium hydrogen phosphate</td>
			<td>
			Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Ethanol (95%)</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glucose monohydrate, (&alpha;-D-)</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glucose oxidase (Typ II from Aspergillus niger)</td>
			<td>
			Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Hydrochloride acid (37 % w/v)</td>
			<td>
			Fiedel-de Ha&euml;n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Hydrous magnesium silicate</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Monopotassium phosphate</td>
			<td>
			Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			o-dianoisidine dihydrochloride</td>
			<td>
			Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Peroxidase (Typ II from horseradish)</td>
			<td>
			Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sodium acetate</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sodium hydroxide</td>
			<td>
			Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sucrose, D-(+)</td>
			<td>
			Fluka</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Water (deionized)</td>
			<td>
			-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table of Solutions and Medium Composition:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			Solution</td>
			<td>
			Components</td>
			<td>
			Amount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			50 mM sodium acetate buffer (pH 6.5)</td>
			<td>
			Sodium acetate
			Bring to volume with deionized water
			Adjust at pH 6.5 with acetic acid</td>
			<td>
			4.1 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M monopotassium phosphate solution</td>
			<td>
			Monopotassium phosphate
			Bring to volume with deionized water</td>
			<td>
			6.805 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M disodium hydrogen phosphate solution</td>
			<td>
			Disodium hydrogen phosphate
			Bring to volume with deionized water</td>
			<td>
			7.1 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M phosphate buffer (pH 7.0)</td>
			<td>
			0.05 M disodium hydrogen phosphate solution
			Bring to volume with 0.05 M monopotassium phosphate solution</td>
			<td>
			61.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M phosphate buffer (pH 5.4)</td>
			<td>
			0.05M disodium hydrogen phosphate solution
			Bring to volume with 0.05 M monopotassium phosphate solution</td>
			<td>
			3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			1.65 M sucrose solution</td>
			<td>
			D-(+)-sucrose
			Bring to volume with phosphate buffer (pH 5.4)</td>
			<td>
			564.8 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			reagent solution</td>
			<td>
			o-Dianisidin-Dihydrochlorid
			Ethanol (95%)</td>
			<td>
			25 mg
			10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glucose reagent solution</td>
			<td>
			Glucose oxidase
			Peroxidase
			Phosphate buffer (pH 7.0)
			reagent solution</td>
			<td>
			10.5 mg
			3 mg
			90 mL
			10 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

customization of aspergillus niger morphology through addition of talc micro particles

Ipliksi mantar A. Nijer gıda ilaç endüstrisi için endüstriyel süreçleri geniş bir yelpazede yaygın olarak kullanılan bir türdür. Bu ipliksi organizmanın en ilgi çekici ve çoğu zaman kontrol edilemeyen özelliklerinden biri karmaşık morfolojisini. Bu yoğun küresel pelet viskoz miselyumla (Şekil 1) arasında değişmektedir. Çeşitli proses parametreleri ve malzemeyi fungal morfolojisi 1 etkilemekte olarak da bilinirler. Optimum verimlilik, belirli bir morfolojik yapısı ile güçlü bir korelasyon bu yana, mantar morfolojisi genellikle, sanayi üretiminde verimlilik darboğaz temsil eder. Kesin morfolojik şeklini kontrol A yalındır ve zarif yaklaşımı artan enzim üretimi 2-6 katkıda kültür ortamına inorganik çözünmeyen mikro partiküller (sulu magnezyum silikat, alüminyum oksit veya titanyum oksit, silikat gibi) eklenmesidir. Bir obv olmadığındanmikro partikül bağımlı morfolojisi ve enzim üretimi arasındaki ious ilişki matematiksel olarak verimlilik ve morfolojik görünüm bağlamak için arzu edilir. Bu nedenle kantitatif bir kesin ve bütünsel morfolojik tanımlama hedeflenmektedir. Böylece, biz üretmek ve karakterize mikro partikül bağımlı morfolojik yapıları ve muhtemelen ipliksi mikroorganizmaların morfonogenezi daha iyi anlaşılmasına katkıda verimlilik (Şekil 1) mantar morfoloji ilişkilendirmek için bir yöntem sunuyoruz. Rekombinant suşu A. Nijer SKAn1015 tankı biyoreaktör karıştırılmış bir 3 L 72 saat için yetiştirilmektedir. G / L önceden aşılama için 1 g / L, 3 g / L ve 10 konsantrasyonda talk mikro partiküllerinin eklenmesi ile morfolojik özellikleri çeşitli çoğaltılabilir şekilde oluşturulur. Steril örnekleri üretilen enzim büyüme ve gelişme aktivitesinin belirlenmesi için 24, 48 ve 72 saat sonra alınmıştır.oluşan ürün değeri yüksek enzim β-fructofuranosidase, gıda ya da diğerleri arasında glukoz 7-9 için sukroz reaksiyonu katalize ilaç sanayi, neo-şeker oluşumu için önemli bir biocatalyst olduğunu. Bu nedenle, sukroz eklendikten sonra glikoz miktarının üretilen β-fructofuranosidase miktarı anlamına gelmektedir. Glikoz miktar 96-kuyucuklu plaklar içinde mikro titre yüksek verim analizi için değiştirilmiş bir GOD / POD-Assay 10 tarafından yapılmaktadır. 72 saat sonra Mantarların morfolojisi mikroskopta incelenir ve dijital görüntü analizi ile karakterizedir. Bunu yaparken, Feret çapı gibi mantar makro morfolojisi, projeksiyon alanı, çevre, dairesellik, boy oranı, yuvarlaklık und sağlamlık için parçacık şekli faktörleri açık kaynak görüntü işleme programı ImageJ ile hesaplanır. İlgili parametreleri kapsamlı bir karakterizasyonu sağlayan bir boyutsuz Morfoloji numarası (Mn) 11, birleştirilerekmantar morfolojisi. Morfoloji sayısı ve verimlilik yakın bir ilişki matematiksel regresyon ile vurgulanır.

Watch this Scientific Journal Video about Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles at JoVE.com

Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles

Tam olarak oluşturmak ve kapsamlı ipliksi mantar morfolojisi karakterize bir yöntem<em&gt; Aspergillus Nijer</em&gt; Morfolojik görünüm ve verimlilik matematiksel bir korelasyon olanak sağlayan açıklanmıştır.

Ve Özelleştirme Aspergillus Nijer</emTalk Mikro Parçacıkların toplama yoluyla> Morfolojisi

The filamentous fungus A. niger is a widely used strain in a broad range of industrial processes from food to pharmaceutical industry. One of the most ...

customization-aspergillus-niger-morphology-through-addition-talc

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient expression of effectors. Packaging lentiviral expression constructs into pseudoviral particles, however, enables up to 100% transduction, even with difficult-to-transfect cells, such as primary, stem, and differentiated cells. Moreover, the lentiviral delivery does not produce the specific cellular responses typically associated with chemical transfections, such as cell death resulting from toxicity of the transfection reagent 1, 2. When transduced into target cells, the lentiviral construct integrates into genomic DNA and provides stable expression of the small hairpin RNA (shRNA), cDNA, microRNA or reporter gene 3, 4. Target cells stably expressing the effector molecule can be isolated using a selectable marker contained in the expression vector construct such as puromycin or GFP. After pseudoviral particles infect target cells, they cannot replicate within target cells because the viral structural genes are absent and the long terminal repeats (LTRs) are designed to be self-inactivating upon transduction 5, 6.
There are three main components necessary for efficient lentiviral packaging 1, 5, 6, 7. 
1. The lentiviral expression vector that contains some of the genetic elements required for packaging, stable integration of the viral expression construct into genomic DNA, and expression of the effector or reporter. 
2. The lentiviral packaging plasmids that provide the proteins essential for transcription and packaging of an RNA copy of the expression construct into recombinant pseudoviral particles. This protocol uses the pPACK plasmids (SBI) that encode for gag, pol, and rev from the HIV or FIV genome and Vesicular Stomatitis Virus g protein (VSV-G) for the viral coat protein. 
3. 293TN producer cells (derived from HEK293 cells) that express the SV40 large T antigen, which is required for high-titer lentiviral production and a neomycin resistance gene, useful for reselecting the cells for maintenance.
An overview of the viral production protocol can be seen in Figure 1. Viral production starts by co-transfecting 293TN producer cells with the lentiviral expression vector and the packaging plasmids. Viral particles are secreted into the media. After 48-72 hours the cell culture media is harvested. Cellular debris is removed from the cell culture media, and the viral particles are precipitated by centrifugation with PEG-it for concentration. Produced lentiviral particles are then titered and can be used to transduce target cells. Details of viral titering are not included in this protocol, but can be found at:
<a href="http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf</a> 8.
This protocol has been optimized using the specific products indicated. Other reagents may be substituted, but the same results cannot be guaranteed.

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Lentiviral expression vectors are the most effective vehicles for stably expressing different effector molecules or reporter constructs in dividing and non-dividing mammalian cells and whole organisms. Here we provide a protocol on how to package lentivector expression constructs in pseudoviral particles and to transduce target cells using the pseudoviral particles.

Ambalaj HIV veya FIV tabanlı Lentivector İfade Yapıları &amp; VSV-G Pseudotyped Viral Parçacıklarının İletimi

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Sitometrisi ile Primer İmmün hücre alt Floresan Nanoparçacık Etkileşimleri Algılama

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or specific treatments for the disease caused by these viruses, and work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories, significantly limiting the research on these viruses. Lifecycle modeling systems model the virus lifecycle under biosafety level 2 conditions; however, until recently such systems have been limited to either individual aspects of the virus lifecycle, or a single infectious cycle. Tetracistronic minigenomes, which consist of Ebola virus non-coding regions, a reporter gene, and three Ebola virus genes involved in morphogenesis, budding, and entry (VP40, GP1,2, and VP24), can be used to produce replication and transcription-competent virus-like particles (trVLPs) containing these minigenomes. These trVLPs can continuously infect cells expressing the Ebola virus proteins responsible for genome replication and transcription, allowing us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions. Importantly, the viral components of this systems are solely derived from Ebola virus and not from other viruses (as is, for example, the case in systems using pseudotyped viruses), and VP40, GP1,2 and VP24 are not overexpressed in this system, making it ideally suited for studying morphogenesis, budding and entry, although other aspects of the virus lifecycle such as genome replication and transcription can also be modeled with this system. Therefore, the tetracistronic trVLP assay represents the most comprehensive lifecycle modeling system available for Ebola viruses, and has tremendous potential for use in investigating the biology of Ebola viruses in future. Here, we provide detailed information on the use of this system, as well as on expected results.

Work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories. Tetracistronic minigenome-containing replication and transcription-competent virus like particles (trVLPs) represent a lifecycle modeling system that allows us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions, relying exclusively on Ebola virus components.

Tetracistronic minigenomlar İçeren virüs benzeri partiküller ile Biyogüvenlik Seviyesi 2 Koşullarında Ebola virüsü Ömrü Modelleme

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

Bir Kantitatif Mikro-nötralizasyon Testi optimizasyonu

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase reporter, using a simple transfection procedure of the widely available HEK-293T cell line. Once formed and released from producer cells, these pseudovirions incorporate a luciferase reporter gene. Since they only contain the heterologous coronavirus spike protein on their surface, the particles behave like their native coronavirus counterparts for entry steps. As such, they are the excellent surrogates of native virions for studying viral entry into host cells. Upon successful entry and infection into target cells, the luciferase reporter gets integrated into the host cell genome and is expressed. Using a simple luciferase assay, transduced cells can be easily quantified. An important advantage of the procedure is that it can be performed in biosafety level 2 (BSL-2) facilities instead of BSL-3 facilities required for work with highly pathogenic coronaviruses such as Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV). Another benefit comes from its versatility as it can be applied to envelope proteins belonging to all three classes of viral fusion proteins, such as the class I influenza hemagglutinin (HA) and Ebola virus glycoprotein (GP), the class II Semliki forest virus E1 protein, or the class III vesicular stomatitis virus G glycoprotein. A limitation of the methodology is that it can only recapitulate virus entry steps mediated by the envelope protein being investigated. For studying other viral life cycle steps, other methods are required. Examples of the many applications these pseudotype particles can be used in include investigation of host cell susceptibility and tropism and testing the effects of virus entry inhibitors to dissect viral entry pathways used.

Here, we present a protocol to generate pseudotyped particles in a BSL-2 setting incorporating the spike protein of the highly pathogenic viruses Middle East respiratory syndrome and severe acute respiratory syndrome coronaviruses. These pseudotyped particles contain a luciferase reporter gene allowing quantification of virus entry into target host cells.

Bir biyogüvenlik seviye 2 ortamda yüksek patojenik Coronaviruses çalışmaya Pseudotyped parçacıklar imalatı

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

Akış Sitometrisi Kullanılarak İnsan Lökositler tarafından Aspergillus fumigatus Conidia Fagositozunun ölçülmesi

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

Yüksek Patojenik H5N1 ve Kuş H7N9 Virüslerinden Zarf Glikoproteinleri Ile Yüksek Titer Enfeksiyöz İnfluenza Pseudotyped Partiküllerin Üretimi

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is responsible for altering infection for many of these viruses. Thus, characterizing the nature of virus-bacteria binding is a foundational step needed for elucidating the mechanism(s) by which bacteria alter viral infection. For human norovirus, commensal bacteria enhance B cell infection. The virus directly binds to these bacteria, indicating that this direct interaction is involved in the mechanism of infection enhancement. A variety of techniques can be used to quantify interactions between bacteria and viruses including scintillation counting of radiolabeled viruses and polymerase chain reaction (PCR). Both methods require the use of live virus, which may need to be generated in the laboratory. Currently, none of the established in vitro culture systems available for human norovirus are robust enough to allow for generation of highly concentrated viral stocks. In lieu of live virus, virus-like particles (VLPs) have been used to characterize the interactions between norovirus and bacteria. Herein a flow cytometry method is described with uses virus specific antibodies to quantify VLP binding to gram-negative and gram-positive bacteria. Inclusion of both bacteria only and isotype controls allowed for optimization of the assay to reduce background antibody binding and accurate quantification of VLP attachment to the bacteria tested. High VLP:bacterium ratios result in VLPs binding to large percentages of the bacterial population. However, when VLP quantities are decreased, the percent of bacteria bound also decreases. Ultimately, this method can be employed in future experiments elucidating the specific conditions and structural components that regulate norovirus:bacterial interactions.

The goal of this protocol is to quantify binding of the eukaryotic pathogen human norovirus to bacteria. After performing an initial virus-bacterium attachment assay, flow cytometry is used to detect virally-bound bacteria within the population.

Akış Sitometrikullanarak Commensal Bakterilere Bağlanan İnsan Norovirüs Benzeri Partiküllerin Ölçülmesi

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

Konakçı-Patojen Etkileşimlerinin Analizi için Zebra Balığı Larvalarının Aspergillus Sporları ile Enfeksiyonu

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular deoxyribonucleic acid (ecDNA) is released during different forms of cell death including apoptosis, necrosis, necroptosis, neutrophil extracellular traps (NETs) and pyroptosis. Measurement of this cell death is time consuming with several different biomarkers required to identify the different biochemical forms of cell death. Measurement of ecDNA is generally conducted in serum and urine as a surrogate for renal damage, not in the actual target organ where the pathological injury occurs. The current difficulty in investigating ecDNA in the kidney is the lack of methods for formalin fixed paraffin embedded tissue (FFPE) both experimentally and in archived human kidney biopsies. This protocol provides a summary of the steps required to stain for ecDNA in FFPE tissue (both human and murine), quench autofluorescence and measure the ecDNA in the resulting images using a machine learning tool from the publicly available open source ImageJ plugin trainable Weka segmentation. Trainable Weka segmentation is applied to ecDNA within the glomeruli where the program learns to classify ecDNA. This classifier is applied to subsequent acquired kidney images, reducing the need for manual annotations of each individual image. The adaptability of the trainable Weka segmentation is demonstrated further in kidney tissue from experimental murine anti-MPO glomerulonephritis (GN), to identify NETs and ecMPO, common pathological contributors to anti-MPO GN. This method provides objective analysis of ecDNA in kidney tissue that demonstrates clearly the efficacy in which the trainable Weka segmentation program can distinguish ecDNA between healthy normal kidney tissue and diseased kidney tissue. This protocol can easily be adapted to identify ecDNA, NETs and ecMPO in other organs.

Extracellular DNA (ecDNA) released during cell death is proinflammatory and contributes to inflammation. Measurement of ecDNA at the site of injury can determine the efficacy of therapeutic treatment in the target organ. This protocol describes the use of a machine learning tool to automate measurement of ecDNA in kidney tissue.

Glomerülonefritte Hücre Dışı DNA'nın Yarı Nicelikselleştirilmesi için Denetimli Makine Öğrenimi

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

Ve Özelleştirme Aspergillus Nijer Morfolojisi