Name: a semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development
Uploaded: 2012-06-07T13:00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NHI R01 tilskud GM59690 tildelt KLV.

1. Første karakterisering og overvejelser <ol><li> Biofilmdannelse er generelt påvirket af celledensitet og væksthastighed. Derfor er det nødvendigt at bestemme væksten (stigning i optisk densitet (OD) over tid) og udbytte (endelig celleantal) af stamme (r) af interesse ved at udføre simple vækstkurven og Celleudpladning assays. Fejl i vækst, eller en manglende sammenhæng mellem OD og celle nummer, skal tages i betragtning, når fortolkning af resultater fra spotting eksperimenter. </li><li> Medtag de relevante positive og negative kontroller på den samme plade, når de vurderer rynket kolonidannelse, som mindre plade-til-plade variation kan påvirke biofilm udvikling. </li><li> Identificer de bedste forudsætninger for at spotte, dvs dem, der afslører de mest markante forskelle mellem kontrol-og mutant (r) af interesse. Grow stammer i flydende kultur under forskellige forhold, såsom forskellige medier eller temperaturer, og at anden fases vækst (eksponentielle eller stationær fase) før spotting. Plet 10 ul kultur på forskellige celledensiteter over på passende medier og inkuberes ved den ønskede temperatur, indtil kolonier morfologier fremgå. </li><li> Endepunktet assay involverer vurdering af rynket kolonidannelse på et forudbestemt tidspunkt efter pletning (dvs. 48 timer). Denne vurdering er nyttigt for stammer, der udviser (eller foreslås at udstille) alvorlige defekter i biofilmdannelse. </li><li> Tidsforløbet analysen vurderer rynket kolonidannelsen over en periode (dvs. hver time) post-spotting. Dette assay muliggør en semi-kvantitativ vurdering af biofilmdannelse ved at tillade bestemmelse af starten af ​​rynkede kolonidannelse og mønsteret udvikling over en tidsperiode. Varigheden af ​​eksperimentet, og antallet af indsamlingssteder for et givet tidsforløb bør fastsættes i indledende forsøg. </li><li> Du kan nemt holde styr på tiden post-spotting, fastsat tilImer at tælle op. </li></ol> 2. Mikroskopisk vurdering af rynket kolonimorfologi i V. fischeri <ol><li> Podes V. fischeri celler i 5 ml LB-salt (LBS) medium 13 (1% [vægt / vol] trypton, 0,5% [vægt / vol] gærekstrakt, 2% [vægt / vol] natriumchlorid, 50 mM Tris-HCI [ pH 7,5]) indeholdende alle nødvendige antibiotika og inkuberes under omrystning natten over ved 28 ° C. Om morgenen, cellerne med en 1:100 fortynding subkultur i 5 ml frisk LBS medium og inkuberes under de samme betingelser, indtil cellerne har nået den ønskede OD 600 (f.eks OD600 = 0,2 eller 0,5). </li><li> Pipette 1 ml af kulturen i et mikrofugerør og centrifugeres i en mikrocentrifuge sæt ved maksimal hastighed i et minut. Fjern supernatanten ved aspiration. Vask af cellerne til fjernelse af resterende medier og ekstracellulære bestanddele ved at resuspendere pelleten i 1 ml sterile 70% kunstigt havvand (ASW) (35 mM MgSO4-7H 2 O, 7 mM CaCI2-2H 2 O, 210 mM NaCl, 7 mM KCI), og gentagelse af centrifugering. Resuspender den vaskede pellet i 1 ml 70% ASW. </li><li> Sikre, at hver prøve indeholder det samme antal celler, som estimeret af OD ved 600 nm. Foretag de nødvendige justeringer ved at fortynde mere koncentrerede prøver med yderligere 70% ASW. I indledende eksperimenter, at stedet kulturer ved forskellige indledende OD-værdier bestemme en optimal start OD for et givet sæt af stammer eller tilstande. De bedste resultater er opnået for V. fischeri når pletter dannes fra kulturer med en OD på omkring 0,2. </li><li> Øje 10 gl af de vaskede celler på LBS plader indeholdende de nødvendige antibiotika. Når spotting en kultur på en plade, så sørg for at stabilisere pipetten (med fingeren), lige over agaroverfladen. Øje lodret, ikke i en vinkel, og skubbe væsken langsomt til ensartet fordeling af stedet. Typisk hver stamme er opdaget en gang pr plade (op til 6 steder per plade), vidh flere plader (2-3) for hvert forsøg. </li><li> For at sikre, at den plettede kulturen forbliver jævnt fordelt, give stedet for at tørre, inden du flytter pladen til inkubatoren. Invertere pladerne og inkubere dem ved 28 ° C. </li><li> Overvåge morfologi voksende plet time begyndende ved 12-15 timer efter inokulation. Vi bruger et dissektionsmikroskop (Zeiss STEMI 2000-C) med et kamera vedhæftet fil (Progres C10 PLUS) og Progres CapturePro og ImageJ programmer til at observere og dokumentere kolonimorfologi og for at vurdere starten og progression af rynket koloni-dannelse. </li><li> For den specifikke opstilling er angivet i trin 2.5 er pletterne belyses nedefra gennem et transparent glas trin med en CL 1500 EF koldt lyskilde, mens billeder indfanges fra oven. Denne opsætning er optimal for billedbehandling rynket koloni udvikling, fordi V. fischeri kolonier (pletter) er gennemsigtige. </li><li> I mangel af specifikt udstyr, der er anført i step 2,5, monitor rynket kolonimorfologi hjælp af enhver dissektionsmikroskop der tillader fuldstændig koloni visning og har en justerbar lyskilde og helst en fastgjort kamera. Om nødvendigt kan et digitalt kamera også anvendes i fravær af en vedhæftet kamera, men dette er ikke optimal. </li><li> For bedst at visualisere rynket koloni udvikling, er det nødvendigt at justere både lysstyrken og refleksionsvinkel under de bakteriekolonier, således at den tre-dimensionelle morfologi af de udviklingslande, biofilm kan konstateres. Bestemme de optimale lysforhold, der giver den stærkeste kontrast mellem øje koloni og den omgivende agar baggrunden, således at arkitekturen (rynker) af koloni kan tydeligt skelnes. </li><li> I nogle tilfælde skal farven af ​​plettede koloni også tages i betragtning, som ændringer i kolonien farve kan forekomme under biofilmdannelse. Juster intensitet og vinkel belysning kilde til at afsløredisse subtile ændringer i farve. Når de korrekte indstilling opnås, opretholde dem i eksperimentets varighed. </li><li> Bemærk, hvor meget tid der går fra tidspunktet for inokulation med det tidspunkt, hvor rynket kolonidannelse initierer for hver stamme eller tilstand. Definere starten af ​​rynkede kolonidannelse som det tidspunkt, hvor dannelsen af ​​mønsterdannelse og 3D-strukturer (dvs. riller danner ved den ydre kant eller &quot;ringe&quot;, der forekommer i midten) først tydelig. Mutantceller kan udvise reduceret eller forøget tid til starten af rynkede kolonidannelse (f.eks fig. 2). </li><li> Dokumentere starten og udvikling af rynket kolonidannelse ved at opfange passende digitale billeder. Det er vigtigt at anvende den samme forstørrelse ved indsamling billeder under hele forsøget. Skifte visning fra okularet af mikroskopet til skærmen ved hjælp af håndtaget er placeret på bagsiden af ​​kameraet. Når du skifter mellem okularetog computer skærmvisning, justere visningen og fokus i overensstemmelse hermed. </li><li> Før billeddannelse plettede kulturer låget af petriskålen typisk fjernes for at tilvejebringe den klareste billedet. Dette er imidlertid et valgfrit trin, som plettede kulturer kan afbildes gennem låget ved hjælp af opsætningen skitseret i trin 2.5 og 2.6. </li><li> På hvert tidspunkt efter påbegyndelsen af ​​rynkede kolonidannelse, bemærk mønster af rynkede koloni udvikling. Arkitekturen kan udvikle sig indefra og ud, eller udenfor i. Denne vurdering giver en mekanisme til at skelne de biofilm dannes ved forskellige stammer eller under forskellige forhold. </li><li> Måle diameteren af ​​udviklingen koloni på hvert tidspunkt. Dette kan gøres manuelt eller digitalt ved hjælp af en tilhørende program. Hvis det gøres digitalt, skal du bruge Progres CapturePro program og første kalibrere skalalinjen til den specifikke forstørrelse anvendes i forsøget. Medtag skalalinjen i hvert billedet. </li><li> For at beregne kolonien diameter ved hjælp af ImageJ software program, åbne hver billedfil. Standardiser skalalinjen som følger: Vælg &quot;Straight line option&quot; fra værktøjslinjen. Overlejre indlejret Målestokken med en lige linie af samme længde og bredde. Vælg &quot;Set Scale&quot; fra fanebladet &quot;Analyser&quot;. I &quot;kendt afstand&quot;-boksen, skal du indsætte den tilsvarende længde (som bestemt ud fra den oprindelige skala bar, dvs, 2 mm) og vælg &quot;OK&quot;. </li><li> Brug &quot;Straight line&quot; mulighed for at indsætte en vandret linie gennem stedet. Under Analyser fanen, vælg &quot;foranstaltning&quot;. I den nye resultater vindue, vil den beregnede længde tilvejebringes. Opnåelse af en anden måling ved at indsætte en vinkelret linie på tværs af stedet. Genberegne diameter. Registrere gennemsnittet af to målinger. Graf over den gennemsnitlige diameter for hver plet på hvert tidspunkt under anvendelse af en software-program såsom Excel. </li><li> Afslutningen af ​​eksperimentet forekommer enten ved en specificeret tidspunkt, eller når der ikke længere erUdviklingen af ​​biofilmen. Når enden er nået, konsolidere de billeder i en figur (r) til at visualisere mønstret udviklingen over tid ved hjælp af et software program som Powerpoint. </li></ol> 3. Repræsentative resultater I disse forsøg brugte vi V. fischeri som en modelorganisme at studere biofilm-dannelse ved at vurdere udviklingen af rynkede kolonier på en fast agaroverfladen. Biofilm-producerende stammer af V. fischeri danner kolonier med store 3D arkitektur inden for 40 timer (fig. 1) 8,9,14. Når de undersøges over et tidsforløb, bliver det tydeligt, at rynket kolonidannelse med kontrolstammen initierer så tidligt som ca 12 timer efter podning (afhængigt af de særlige betingelser) (fig. 2) 9. I modsætning hertil er biofilmdannelse af en repræsentant mutant forsinket med ca 4 timer, ikke initiering indtil ca 16 h efter inokulering 9. Repeats af disse eksperimenter antydede, at timingen er relativt ensartet, hvilket gør denne vurdering semikvantitativ 9. En anden semi-kvantitativ måling af biofilmdannelse gør brug af ændringen i diameter udvikle koloni over tid. Som vist i fig. 3A er en repræsentativ biofilm-kompetent stamme danner kolonier, der øges i kompleksitet og diameter i forhold til en repræsentativ stamme, der ikke udgør biofilm. Omhyggelige målinger over tid af diametrene af de dannede kolonier af disse to stammer viste, at størrelsen af ​​biofilm-kompetente kolonier forøget med en større hastighed end biofilm-negative kolonier, og ved afslutningen tidspunkt de to afveg med næsten 2 - fold (figur 3B). Selv billeder af en repræsentativ sen tid eller &quot;ende-punkts&quot; kolonimorfologi ofte er vist i litteraturen, kan yderligere, semi-kvantitative data indsamles som vil tillade en bedre forståelse af biofilmen defekten.<img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig1.jpg" /> Figur 1. Endepunkt-assay. Denne figur er et eksempel på et slutpunkt under anvendelse repræsentative ikke-biofilm-dannende (venstre) og biofilm-dannelse (højre) stammer af V. fischeri. Disse billeder blev indsamlet ved 40 h post-genkendelse. Disse billeder blev genereret med vildtype-V. fischeri indeholder en vektor kontrol (ikke-biofilm-dannende) eller en rscS overekspression plasmid (biofilm-dannende) og var en del af de data, der indsamles til Morris et al., 2011. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig2.jpg" /> Figur 2. Tidsforløbet assay. Det øverste panel indeholder repræsentative billeder af biofilmdannelse af en biofilm-kompetent styring stamme af V. fischeri over et udvalgt tidsforløb. Initiering af biofilmdannelse er tydelig ved 12 timer. Den nederste plade indeholder repræsentative inMages af en mutantstamme af V. fischeri som udviser en forsinkelse (4 h) i starten af rynkede kolonidannelse over tid med biofilmdannelse initiering ved 16 timer post-inokulering. Bemærk, at 40 timer stammerne ligner i intensiteten og mønsterdannelse af biofilmdannelse, medens små forskelle mellem disse stammer kun observeret ved de tidligere tidspunkter. Disse billeder blev dannet med rscS overudtrykker vildtype og sypE mutant V. fischeri celler og var en del af de datasæt indsamlet til Morris et al., 2011. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig3.jpg" /> Figur 3. Kolonien diameter som en semi-kvantitativ analyse af biofilmdannelse. (A) Tidsforløb af biofilmdannelse af repræsentative biofilm-dannende (øverste panel) og ikke-biofilm-dannende (nederste panel) stammer af V. fischeri. Bemærk, at biofilmen-dannende stamme udviser en større stigningi diameter over tid i forhold til den ikke-biofilmen dannende stamme. Disse billeder blev genereret med vildtype-V. fischeri indeholder en rscS overekspression plasmid (biofilm-dannende) eller en vektor kontrol (ikke-biofilm-dannende) og var en del af de data, der indsamles til Morris et al., 2011. (B) En grafisk repræsentation af stigningen i kolonien diameter over tid af de to stammer i panel A. Disse data blev frembragt ved anvendelse af ImageJ og Excel software som beskrevet i protokollen.

<ol>
	<li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+survival+mechanisms+of+clinically+relevant+microorganisms.">Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms.</a> Clin. Microbiol. Rev. 15, 167-167 (2002).</li><li>Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms+as+complex+differentiated+communities.">Biofilms as complex differentiated communities.</a> Annu. Rev. Microbiol. 56, 187 (2002).</li><li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+the+matrix+revisited.">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20 (2005).</li><li>Branda, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis.">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11621 (2001).</li><li>Beyhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+rugosity+and+biofilm+formation+in+Vibrio+cholerae:+comparison+of+VpsT+and+VpsR+regulons+and+epistasis+analysis+of+vpsT,+vpsR,+and+hapR.">Regulation of rugosity and biofilm formation in Vibrio cholerae: comparison of VpsT and VpsR regulons and epistasis analysis of vpsT, vpsR, and hapR.</a> J. Bacteriol. 189, 388 (2007).</li><li>Enos-Berlage, J. L., Guvener, Z. T., Keenan, C. E., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+determinants+of+biofilm+development+of+opaque+and+translucent+Vibrio+parahaemolyticus.">Genetic determinants of biofilm development of opaque and translucent Vibrio parahaemolyticus.</a> Mol. Microbiol. 55, 1160 (2005).</li><li>Merritt, J. H., Brothers, K. M., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SadC+reciprocally+influences+biofilm+formation+and+swarming+motility+via+modulation+of+exopolysaccharide+production+and+flagellar+function.">SadC reciprocally influences biofilm formation and swarming motility via modulation of exopolysaccharide production and flagellar function.</a> J. Bacteriol. 189, 8154-8154 (2007).</li><li>Yip, E. S., Geszvain, K., DeLoney-Marino, C. R., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+symbiosis+regulator+rscS+controls+the+syp+gene+locus,+biofilm+formation+and+symbiotic+aggregation+by+Vibrio+fischeri.">The symbiosis regulator rscS controls the syp gene locus, biofilm formation and symbiotic aggregation by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 62, 1586-1586 (2006).</li><li>Morris, A. R., Darnell, C. L., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+a+novel+response+regulator+is+necessary+for+biofilm+formation+and+host+colonization+by+Vibrio+fischeri.">Inactivation of a novel response regulator is necessary for biofilm formation and host colonization by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 82, 114 (2011).</li><li>Nyholm, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Vibrio+fischeri+and+nonsymbiotic+bacteria+in+the+dynamics+of+mucus+secretion+during+symbiont+colonization+of+the+Euprymna+scolopes+light+organ.">Roles of Vibrio fischeri and nonsymbiotic bacteria in the dynamics of mucus secretion during symbiont colonization of the Euprymna scolopes light organ.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5113 (2002).</li><li>Yip, E. S., Grublesky, B. T., Hussa, E. A., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+conserved+cluster+of+genes+promotes+symbiotic+colonization+and+Ï&#x0192;54-dependent+biofilm+formation+by+Vibrio+fischeri.">A novel, conserved cluster of genes promotes symbiotic colonization and Ï&#x0192;54-dependent biofilm formation by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 57, 1485 (2005).</li><li>Mandel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+regulatory+gene+is+sufficient+to+alter+bacterial+host+range.">A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range.</a> Nature. 458, 215 (2009).</li><li>Graf, J., Dunlap, P. V., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+transposon-induced+motility+mutations+on+colonization+of+the+host+light+organ+by+Vibrio+fischeri.">Effect of transposon-induced motility mutations on colonization of the host light organ by Vibrio fischeri.</a> J. Bacteriol. 176, 6986 (1994).</li><li>Geszvain, K., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hybrid+sensor+kinase+RscS+integrates+positive+and+negative+signals+to+modulate+biofilm+formation+in+Vibrio+fischeri.">The hybrid sensor kinase RscS integrates positive and negative signals to modulate biofilm formation in Vibrio fischeri.</a> J. Bacteriol. 190, 4437 (2008).</li><li>Krasteva, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+cholerae+VpsT+regulates+matrix+production+and+motility+by+directly+sensing+cyclic+di-GMP.">Vibrio cholerae VpsT regulates matrix production and motility by directly sensing cyclic di-GMP.</a> Science. 327, 866 (2010).</li><li>Romling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+rdar+morphotype,+a+multicellular+behaviour+in+Enterobacteriaceae.">Characterization of the rdar morphotype, a multicellular behaviour in Enterobacteriaceae.</a> Cell Mol. Life. Sci. 62, 1234 (2005).</li><li>Berleman, J. E., Chumley, T., Cheung, P., Kirby, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rippling+is+a+predatory+behavior+in+Myxococcus+xanthus.">Rippling is a predatory behavior in Myxococcus xanthus.</a> J. Bacteriol. 188, 5888 (2006).</li><li>Lee, K., Veeranagouda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicrocells+form+by+reductive+division+in+macroscopic+Pseudomonas+aerial+structures.">Ultramicrocells form by reductive division in macroscopic Pseudomonas aerial structures.</a> Environ. Microbiol. 11, 1117 (2009).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

I dette arbejde beskriver vi en semikvantitativ metode til vurdering af biofilmdannelse hjælp V. fischeri som en model organisme. Specifikt anvender vi et dissektionsmikroskop med kameraet fastgørelse til overvågning biofilmdannelse og udvikling rynket kolonidannelse over tid på en fast agaroverfladen. I denne protokol, skitsere vi to specifikke typer af metoder vi normalt bruger til at vurdere rynket koloni-dannelse. Den første er det end-point analyse, som giver os mulighed for at observere den endelige, samlede 3D arkitektur, mønster, og diameteren af ​​en plettet kultur på en udvalgt &quot;endelig&quot; tidspunkt. Denne fremgangsmåde er mest anvendelig til vurdering af mutantstammer eller tilstande, der fører til dramatisk defekter i biofilmdannelse. Men denne fremgangsmåde ikke skelne mellem mere subtile forskelle, som opstår på tidspunkter før det valgte slutpunkt. Bedre kunne overvåge rynket kolonidannelse, bruger vi et tidsforløb analyse, som giver os mulighed for at identificere starten af ​​wrinkled kolonidannelse og se dens udvikling over tid. Som et resultat af denne fremgangsmåde, kan mere subtile forskelle i timingen af ​​rynket kolonidannelse, 3D arkitektur, og mønsterdannelse identificeres. Vi anvendte det tidsforløb assay til at generere to semi-kvantitative analyser af biofilmdannelse. For det første kan det tidspunkt, hvor en stamme begynder at udvikle 3D arkitektur sammenlignes med den for kontrolstammer. Vi har fundet, at forsinkelsen i biofilmen dannelse af en bestemt mutant under de samme betingelser er relativt konsistent 9. F.eks. I de data der er vist i fig 2, mutant konsekvent udviste omkring en 4 h forsinkelse initiering biofilmdannelse. En anden semi-kvantitativ måling af biofilmdannelse er ændringen i størrelse af diameteren af ​​den rynkede koloni (plet). Vi har fundet, at diameteren af rynkede kolonier gradvis adskiller sig fra ikke-biofilm kolonier, når omkring en 2-fold forskel i slutningen tidspunkt (fig. 3 </strong&gt;) (Morris og Visick, upublicerede data). Til dato har vi ikke observeret en fænotype uden den anden (dvs. biofilmdannelse uden en stigning i koloni diameter) (upublicerede data), selv om det stadig er muligt nogle mutanter vil opføre sig anderledes. Faktisk er det blevet rapporteret for V. cholerae, at nogle rynkede kolonier resulterer i en betydelig stigning i koloni diameter, mens andre ikke gør 15. Alligevel kunne vurdere ændringen i diameter over tid hjælpe med karakterisering af potentielle biofilm mutanter og / eller give en ekstra kvantitativ måling af mutanter med forsinkelser i udviklingen. De to mål for biofilmdannelse (tid og diameter), er at bestemme begyndelsen af ​​rynkede kolonidannelse mere følsomme, men også mere subjektiv end bestemmelse af diameteren af ​​stedet. Alligevel begge foranstaltninger giver en semi-kvantitativ vurdering af en fænotype, der er yderst nyttigt at biofilm forskere, men ikke let kan quantification. Ved udførelse af plettede dyrkede analyser, er det vigtigt at overveje de miljømæssige forhold, som de plettede stammer dyrkes. Rynket kolonidannelsen er ofte påvirket af forskellige miljømæssige forhold, herunder næringsstof tilgængelighed, temperatur og fugtighed. At reducere variabilitet mellem eksperimenter, er det nyttigt at standardisere disse betingelser meget muligt (dvs. standardisering af agarplader til et sæt volumen og dyrkning af plettede stammer ved en kontrolleret temperatur). For yderligere kontrol for variabilitet mellem spotte eksperimenter, er vigtigt at medtage de relevante kontrol-stammer inden for hvert sæt af eksperimenter. Endelig, ved fortolkning af data fra disse analyser, er det nødvendigt at udføre et eksperiment flere gange (3 +), især ved vurderingen af ​​subtile forskelle i rynket kolonidannelse (fx en forsinkelse i biofilmdannelse eller mønster forskelle). Nogle begrænsninger af denne protokol er: 1) determinning om cellerne har en defekt i vækst kan være vanskeligt: ​​vækst af cellerne i flydende kultur kan ikke nøjagtigt afspejle vækstrater på faste medier, og en nøjagtig bestemmelse af væksten af ​​biofilm-dannende celler, som kan klæbe sammen, muligvis ikke; 2) stammer med vækstdefekter vil være problematisk at analysere, 3) er det måske ikke muligt at skelne diameter forskelle mellem stammer med små biofilm fænotyper, 4) for stammer, som ikke vokser i en koncentrisk ring er det måske ikke muligt præcist at måle ændringer i diameter, 5), medens mønsterdannelse kan observeres under biofilmdannelse, er der ingen måde til at kvantificere mønsterdannelse af den resulterende biofilmen og 6) der er ingen måde at måle Z-dimensionen af ​​biofilmen med denne forsøgsopstilling . På trods af disse begrænsninger, men ikke desto mindre protokol giver et middel til at opnå numeriske data til at hjælpe med at vurdere krøllede koloni-dannelse. I denne protokol, anvender vi en bestemt billedbehandlingsystem (dvs. en Zeiss dissektionsmikroskop og Progres CapturePro imaging software) at observere og vurdere rynket koloni-dannelse. Det billeddannende system, der er beskrevet her, er effektive: evnen til at detektere starten af ​​rynkede kolonidannelse, og derved vurdere udviklingen med et tidsforløb fremgangsmåde, forøges kraftigt ved anvendelse af et dissektionsmikroskop. Men hvis denne teknologi ikke er tilgængelig, kan protokollen tilpasses til anvendelse med andet udstyr, herunder et enkelt digitalkamera med en zoom fokus. Medens denne protokol fokuserer på vurdering af rynket koloni udvikling kan det også modificeres til at evaluere pellikkel dannelse, en form af biofilm, der udvikles, når cellerne vokser statisk i flydende kultur. Denne protokol kan også være nyttigt i vurderingen af ​​andre indikatorer for biofilmdannelse, herunder indarbejdelse af specifikke farvestoffer i de plettede kolonier i løbet af biofilm udvikling. Disse indbefatter, men er ikke begrænset til, farvestoffer, såsom Congorødt og calcoflueller som kan binde til cellulose, en almindelig bestanddel af bakterielle biofilm 16. Desuden er denne protokol, men er udviklet til brug sammen med V. fischeri, er ikke begrænset til denne organisme, men kan generaliseres til at studere biofilmdannelse i mange forskellige organismer, såsom Bacillus subtilis 4, Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6 og Pseudomonas aeruginosa 7, som alle udviser rynkede kolonidannelse. Endelig er det også kan tilpasses til at studere andre kolonistimulerende morfologier, der har en udviklingsmæssig mønster, såsom potentielt det mønster, der opstår under vækst af Myxococcus xanthus 17 og antennen struktur udvikling Pseudomonas aeruginosa 18. Denne protokol er således af almindelig brug for mikrobiologi og biofilm forskere.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Navn på udstyr </td><td> Firma </td><td> Katalognr </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Zeiss STEMI 2000-C dissektionsmikroskop </td><td> Zeiss </td><td> 45505300000000000 </td><td> (Opnået ved Lukas Microscope) </td></tr><tr><td> Progres C10 PLUS </td><td> JENOPTIK Optical Systems GmbH </td><td> 017953-602-26 </td><td> Kamera vedhæftet fil (opnået gennem Lukas Microscope) </td></tr><tr><td> CL 1500 EF Cold Light Source </td><td> Zeiss </td><td> 4355400000000000 </td><td> (Opnået ved Lukas Microscope) </td></tr><tr><td> Progres CapturePro </td><td> JENOPTIK Optical Systems GmbH </td><td> Gratis software med registreret kamera </td><td> Computerprogram til billedoptagelse </td></tr><tr><td> Billede J </td><td> NIH </td><td> Gratis software fra:ij / download.html &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html </td><td> Computerprogram til diametermålinger </td></tr></tbody></table>

a semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development

Biofilm, eller overfladeaktive vedhæftede samfund af celler indkapslet i en ekstracellulær matrix, udgør en fælles livsstil for mange bakterier. Inden for en biofilm, ofte bakterieceller udviser ændret fysiologi, herunder et øget resistens over for antibiotika og andre miljømæssige belastninger 1. Desuden kan biofilm spille vigtige roller i host-mikrobe interaktioner. Biofilm udvikler, når bakterier overgangen fra enkelte, planktoniske celler danne komplekse, multi-cellulære samfund 2. I laboratoriet er biofilm studeres ved at vurdere udviklingen af ​​specifikke biofilm fænotyper. En almindelig biofilm fænotype involverer dannelsen af krøllede eller rugose bakteriekolonier på fast agar medier 3. Rynket kolonidannelse tilvejebringer en særlig enkel og nyttig måde til at identificere og karakterisere bakteriestammer udviser ændret biofilm fænotyper, og at undersøge miljømæssige betingelser, som påvirker biofilmdannelse. WRInkled kolonidannelse tjener som en indikator for biofilmdannelse i en række bakterier, herunder både Gram-positive bakterier, såsom Bacillus subtilis 4 og Gram-negative bakterier, såsom Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7, og Vibrio fischeri 8. Den marine bakterie V. fischeri er blevet en model for biofilmdannelse på grund af den kritiske rolle af biofilm under host kolonisering: biofilm produceret af V. fischeri fremme sin kolonisering af de hawaiiansk stumphale blæksprutte Euprymna scolopes 8-10. Vigtigt, biofilm fænotyper observeret in vitro korrelerer med evne V. fischeri celler effektivt kolonisere værtsdyr: stammerne svækkede til biofilmdannelse in vitro har en kolonisering defekt 9,11, mens stammer udviser forøgetbiofilm fænotyper forstærkes for kolonisering 8,12. V. fischeri giver derfor en simpel model system til at vurdere de mekanismer, som bakterierne regulerer biofilmdannelse og hvordan biofilm indvirkning vært kolonisering. I denne rapport beskriver vi en semi-kvantitativ metode til at vurdere biofilmdannelse hjælp V. fischeri som et modelsystem. Denne fremgangsmåde involverer omhyggelig pletning af bakterielle kulturer ved definerede koncentrationer og mængder på faste agarmedier, en plettet kultur er synonymt med en enkelt bakteriekoloni. Denne &quot;spotted kultur &#39;teknik kan anvendes til at sammenligne brutto biofilm fænotyper på enkelte, nærmere angivne tidspunkter (end-point assays), eller til at identificere og karakterisere subtile biofilm fænotyper gennem tiden-retters analyser af biofilm udvikling og målinger af kolonien diameter , som er påvirket af biofilm-dannelse. Denne teknik tilvejebringer en semi-kvantitativ analyse af biofilmdannelse prenhed overfører evaluering af timingen og mønster af rynket koloni udvikling og den relative størrelse af at udvikle struktur, egenskaber, der rækker ud over den simple overordnede morfologi.

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development at JoVE.com

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Vi tilvejebringe en enkel, semikvantitativ metode til at undersøge biofilmdannelse<em&gt; In vitro</em&gt;. Denne fremgangsmåde drager fordel af den Zeiss STEMI 2000-C dissektionsmikroskop (med kameraet fastgørelse) for at overvåge både timing og mønstret af biofilmdannelse, som vurderet ved udviklingen af ​​rynkede kolonier.

En semi-kvantitativ tilgang til Vurdere biofilmdannelse Brug Rynket Colony Udvikling

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Omdannelse af en ELISA til en Luminex xMAP assay under anvendelse af en multiplex antistof screeningsmetode

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Cellesporing hjælp Photoconvertible proteiner under zebrafisk Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Blastomer Eksplantater at teste for Cell Fate Commitment under fosterudviklingen

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Vurdere artsspecifikke bidrag til kraniofaciale Development Brug Quail-ænder kimærer

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

The Soft Agar Colony Formation Assay

Soft Agar Colony Formation Assay

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Gap junktion intercellulær kommunikation: En funktionel biomarkør at vurdere negative virkninger af giftstoffer og toksiner, og Sundhedsmæssige fordele af Naturprodukter

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency

En enkel tilgang til at udføre TEER målinger ved hjælp af en selv lavet volt-amperemeter med programmerbar Udgangsfrekvens

Transepithelial/endothelial electrical resistance (TEER) has been used since the 1980s to determine confluency and permeability of in vitro barrier model ...

Development of an Individual-Tree Basal Area Increment Model using a Linear Mixed-Effects Approach

Udvikling af en individuel-Tree Basal Area Increment Model ved hjælp af en lineær mixed-effects tilgang

Here, we developed an individual-tree model of 5-year basal area increments based on a dataset including 21898 Picea asperata trees from 779 sample plots ...

A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior

En rørledning, der bruger bilateral in Utero Electroporation til at afhøre genetiske påvirkninger af gnaveradfærd

As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution ...