Name: isolation and characterization of dendritic cells and macrophages from the mouse intestine
Uploaded: 2012-05-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine at JoVE.com

Мы благодарим Аарон Рей (Университет Эмори кафедры педиатрии и здравоохранения Детский основной поток Атланта) для сортировки клеток. Эта работа была поддержана грантом AA01787001 NIH, премии по развитию карьеры от Крона и колит фонда Америки, и Эмори-Egleston детского исследовательского центра семян грант TLD

1. Вскрытие и диссоциации эпителиальных клетках кишечника Подготовка реагентов и оборудования: <ul><li> Теплый Ca 2 + / Mg 2 + без PBS (CMF PBS) до комнатной температуры. </li><li> Теплый Ca 2 + / Mg 2 + без HBSS с 5% FBS (CMF HBSS / FBS) и на 2 мм ЭДТА до комнатной температуры. </li><li> Теп?...

<ol>
	<li>Maloy, K. J., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+homeostasis+and+its+breakdown+in+inflammatory+bowel+disease.">Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease.</a> Nature. 474, 298-306 (2011).</li><li>Nagler-Anderson, C., Terhoust, C., Bhan, A. K., Podolsky, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+antigen+presentation+and+the+control+of+tolerance+and+immunity.">Mucosal antigen presentation and the control of tolerance and immunity.</a> Trends Immunol. 22, 120-122 (2001).</li><li>Abraham, C., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+the+host+innate+immune+system+and+microbes+in+inflammatory+bowel+disease.">Interactions between the host innate immune system and microbes in inflammatory bowel disease.</a> Gastroenterology. 140, 1729-1737 (2011).</li><li>Macdonald, T. T., Monteleone, I., Fantini, M. C., Monteleone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regula+tine.">Regula tine.</a> Gastroenterology. 140, 1768-1775 (2011).</li><li>Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+dendritic+cells.">Intestinal dendritic cells.</a> Adv. Immunol. 107, 109-138 (2010).</li><li>Platt, A. M., Bain, C. C., Bordon, Y., Sester, D. P., Mowat, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+independent+subset+of+TLR+expressing+CCR2-dependent+macrophages+promotes+colonic+inflammation.">An independent subset of TLR expressing CCR2-dependent macrophages promotes colonic inflammation.</a> J. Immunol. 184, 6843-6854 (2010).</li><li>Coombes, J. L., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+intestinal+immune+regulation.">Dendritic cells in intestinal immune regulation.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 435-446 (2008).</li><li>Kelsall, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+understanding+the+phenotype+and+function+of+intestinal+dendritic+cells+and+macrophages.">Recent progress in understanding the phenotype and function of intestinal dendritic cells and macrophages.</a> Mucosal Immunol. 1, 460-469 (2008).</li><li>Pulendran, B., Tang, H., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+labor,+plasticity,+and+crosstalk+between+dendritic+cell+subsets.">Division of labor, plasticity, and crosstalk between dendritic cell subsets.</a> Curr. Opin. Immunol. 20, 61-67 (2008).</li><li>Denning, T. L., Wang, Y. C., Patel, S. R., Williams, I. R., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamina+propria+macrophages+and+dendritic+cells+differentially+induce+regulatory+and+interleukin+17-producing+T+cell+responses.">Lamina propria macrophages and dendritic cells differentially induce regulatory and interleukin 17-producing T cell responses.</a> Nat. Immunol. 8, 1086-1094 (2007).</li><li>Niess, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1-mediated+dendritic+cell+access+to+the+intestinal+lumen+and+bacterial+clearance.">CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance.</a> Science. 307, 254-258 (2005).</li><li>Milling, S. W., Cousins, L., MacPherson, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+DCs+interact+with+intestinal+antigens.">How do DCs interact with intestinal antigens.</a> Trends Immunol. 26, 349-352 (2005).</li><li>Bilsborough, J., Viney, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+dendritic+cells+play+a+role+in+immunity,+tolerance,+and+disease.">Gastrointestinal dendritic cells play a role in immunity, tolerance, and disease.</a> Gastroenterology. 127, 300-309 (2004).</li><li>Stagg, A. J., Hart, A. L., Knight, S. C., Kamm, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dendritic+cell:+its+role+in+intestinal+inflammation+and+relationship+with+gut+bacteria.">The dendritic cell: its role in intestinal inflammation and relationship with gut bacteria.</a> Gut. 52, 1522-1529 (2003).</li><li>Medina-Contreras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1+regulates+intestinal+macrophage+homeostasis,+bacterial+translocation,+and+colitogenic+Th17+responses+in+mice.">CX3CR1 regulates intestinal macrophage homeostasis, bacterial translocation, and colitogenic Th17 responses in mice.</a> J. Clin. Invest. 121, 4787-4795 (2011).</li><li>Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Specializations+of+Intestinal+Dendritic+Cell+and+Macrophage+Subsets+That+Control+Th17+and+Regulatory+T+Cell+Responses+Are+Dependent+on+the+T+Cell/APC+Ratio,+Source+of+Mouse+Strain,+and+Regional+Localization.">Functional Specializations of Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets That Control Th17 and Regulatory T Cell Responses Are Dependent on the T Cell/APC Ratio, Source of Mouse Strain, and Regional Localization.</a> J. Immunol. , 187-733 (2011).</li><li>Kim, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nod2+sensor+promotes+intestinal+pathogen+eradication+via+the+chemokine+CCL2-dependent+recruitment+of+inflammatory+monocytes.">The Nod2 sensor promotes intestinal pathogen eradication via the chemokine CCL2-dependent recruitment of inflammatory monocytes.</a> Immunity. 34, 769-780 (2011).</li><li>Schulz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+CD103+,+but+not+CX3CR1+,+antigen+sampling+cells+migrate+in+lymph+and+serve+classical+dendritic+cell+functions.">Intestinal CD103+, but not CX3CR1+, antigen sampling cells migrate in lymph and serve classical dendritic cell functions.</a> J. Exp. Med. 206, 3101-3114 (2009).</li><li>Jaensson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+intestinal+CD103++dendritic+cells+display+unique+functional+properties+that+are+conserved+between+mice+and+humans.">Small intestinal CD103+ dendritic cells display unique functional properties that are conserved between mice and humans.</a> J. Exp. Med. 205, 2139-2149 (2008).</li><li>Uematsu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+humoral+and+cellular+gut+immunity+by+lamina+propria+dendritic+cells+expressing+Toll-like+receptor+5.">Regulation of humoral and cellular gut immunity by lamina propria dendritic cells expressing Toll-like receptor 5.</a> Nat. Immunol. 9, 769-776 (2008).</li><li>Schenk, M., Bouchon, A., Seibold, F., Mueller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM-1--expressing+intestinal+macrophages+crucially+amplify+chronic+inflammation+in+experimental+colitis+and+inflammatory+bowel+diseases.">TREM-1--expressing intestinal macrophages crucially amplify chronic inflammation in experimental colitis and inflammatory bowel diseases.</a> J. Clin. Invest. 117, 3097-3106 (2007).</li><li>Sun, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+intestine+lamina+propria+dendritic+cells+promote+de+novo+generation+of+Foxp3+T+reg+cells+via+retinoic+acid.">Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid.</a> J. Exp. Med. 204, 1775-1785 (2007).</li><li>Kamada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormally+differentiated+subsets+of+intestinal+macrophage+play+a+key+role+in+Th1-dominant+chronic+colitis+through+excess+production+of+IL-12+and+IL-23+in+response+to+bacteria.">Abnormally differentiated subsets of intestinal macrophage play a key role in Th1-dominant chronic colitis through excess production of IL-12 and IL-23 in response to bacteria.</a> J. Immunol. 175, 6900-6908 (2005).</li><li>Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++Th+cells+resembling+regulatory+T+cells+that+inhibit+chronic+colitis+differentiate+in+the+absence+of+interactions+between+CD4+and+class+II+MHC.">CD4+ Th cells resembling regulatory T cells that inhibit chronic colitis differentiate in the absence of interactions between CD4 and class II MHC.</a> J. Immunol. 171, 2279-2286 (2003).</li></ol>

<img src="/files/ftp_upload/4040/4040fig3.jpg" alt="Рисунок 3"/> Рисунок 3. Факторы, важные для оптимизации выхода клеток и экспрессия поверхностных антигенов. Выход клеток и экспрессия поверхностных антигенов напрямую зависят от продолжительности ткани пищеварения, специфику коллагеназы, степен?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> 1X PBS, Ca 2 + - и Mg 2 + без </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) фенол красный </td><td> Fisher Scientific </td><td> SH3001603 </td><td></td></tr><tr><td> Бикарбонат натрия </td><td> Сигма </td><td> S6014 </td><td></td></tr><tr><td> 1M HEPES в 0,85% NaCl </td><td> Lonza </td><td> 17-737E </td><td></td></tr><tr><td> Эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) </td><td> Атланты биологических </td><td> S11150H </td><td> Тепло-инактивированная </td></tr><tr><td> 0,5 М ЭДТА (рН 8,0) </td><td> CellGro </td><td> 46-034-ДИ </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasтип электронной VIII </td><td> Сигма </td><td> C2139 </td><td></td></tr><tr><td> ДНКазы I </td><td> Roche </td><td> 14785000 </td><td> Маточный раствор: 100мг/мл </td></tr><tr><td> LIVE / DEAD Исправимые Аква Dead Cell пятен комплект для возбуждения 405 нм </td><td> Invitrogen </td><td> L34957 </td><td> Использование в 1:1000 </td></tr><tr><td> CD45-PerCP МАБ (30F11) </td><td> BD </td><td> 557235 </td><td> Использование при 1:100 </td></tr><tr><td> CD103-PE МАБ (M290) </td><td> BD </td><td> 557495 </td><td> Использование при 1:100 </td></tr><tr><td> FcγRIII / II МАБ (2.4G2) </td><td> BD </td><td> 553141 </td><td> Использование при 1:200 </td></tr><tr><td> CD11c АПК МАБ (N418) </td><td> eBioscience </td><td> 17-0114-82 </td><td> Использование при 1:100 </td></tr><tr><td> MHC-II (I-Ab) Alexa Fluor 700 МКА </td><td> eBioscience </td><td> 56-5321-82 </td><td> Использование при 1:100 </td></tr><tr><td> CD11b-eFluor 450МАБ (M1/70) </td><td> eBioscience </td><td> 48-0112-82 </td><td> Использование при 1:200 </td></tr><tr><td> F4/80-PE-Cy7 МАБ (BM8) </td><td> eBioscience </td><td> 25-4801-82 </td><td></td></tr><tr><td> CD11b микрошарики </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-049-601 </td><td></td></tr><tr><td> CD11c микрошарики </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-052-001 </td><td></td></tr><tr><td> 50 мл конические пробирки </td><td> BD Сокол </td><td> 352098 </td><td></td></tr><tr><td> Одноместный фильтр сетки </td><td> Chefmate </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Малый вес лодки </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-732-116 </td><td></td></tr><tr><td> 100 мкм фильтр клетки </td><td> BD Сокол </td><td> 352360 </td><td></td></tr><tr><td> 40 мкм фильтр клетки </td><td> BD Сокол </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> 5 мл полистирола с круглым дном трубы </td><td> BD Сокол </td><td> 352235 </td><td> Использование при 1:100 </td></tr><tr><td> MAXQ 4450 настольных орбитальный шейкер </td><td> Thermo Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LS MACS колонка </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> LSR II </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FACSAria II </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of dendritic cells and macrophages from the mouse intestine

В кишечнике находятся уникальные популяции врожденных и адаптивных иммунных клеток, которые участвуют в деле поощрения терпимости по отношению к комменсальных флоры и пищевых антигенов в то время как остальные готовы одновременно подключить к воспалительной реакции инвазивных 1,2 патогенов. Антиген представляющих клеток, в частности, домена и макрофагами, играют важную роль в поддержании кишечного иммунного гомеостаза через их способность чувствовать и адекватно реагировать на микробиоты 3-14. Эффективная изоляция кишечного домена и макрофагов является важным шагом в характеризующие фенотип и функцию этих клеток. Хотя многие эффективные методы выделения кишечной клетки иммунной системы, включая контроллеры домена и макрофагов, были описаны 6,10,15-24, многие полагаются на длительное время пищеварения, которые могут отрицательно влиять на клеточной поверхности антиген выражения, жизнеспособность клеток и / или выход ячейки. Здесь мы подробно методику для быстрого выделения больших количеств viablе, кишечные ДК и макрофагов. Фенотипические характеристики кишечной ДК и макрофаги осуществляют непосредственно окрашивание изолированных клеток кишечника с конкретными флуоресценции-меченных моноклональных антител для многоцветной проточной цитометрии. Кроме того, очень чистый DC и макрофагов населения изолированных функциональных исследований с использованием CD11c и CD11b магнитных активированной сортировки клеток бисером следует сортировки клеток.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine at JoVE.com

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Здесь мы подробно методику для быстрого выделения мышью кишечного дендритные клетки (ДК) и макрофаги. Фенотипические характеристики кишечной домена и макрофагов осуществляется с помощью многоцветной проточной цитометрии в то время как магнитный шарик обогащения следует сортировки клеток используют для получения особо чистых популяций для функциональных исследований.

Выделение и характеристика дендритных клеток и макрофагов из кишечника мыши

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Выделение мышиные клетки легких Дендритные

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Изоляция миелоидных дендритных клеток и эпителиальных клеток из человеческого тимуса

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Т-клеток Захват бактерий Transinfection от дендритных клеток

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Выделение и проточной цитометрии анализ иммунных клеток из мозга ишемического Mouse

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Генерация и идентификация GM-CSF производный альвеол, как макрофаги и дендритные клетки из костного мозга мыши

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Характеристика человека моноцитов дендритные клетки путем обработки изображений проточной цитометрии: Сравнение между двумя моноцитов Isolation протоколов

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Фенотипическая Характеристика макрофаги почек крыс с помощью проточной цитометрии

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Флуоресценция активированных сортировки клеток для очистки плазмоцитов дендритных клеток из костного мозга мыши

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Поколение человеческих моноцитов дендритных клеток из цельной крови

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Изоляция, характеристика и очистки макрофагов из пострадавших от связанных с ожирением воспаление тканей

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...