Name: genomic transformation of the picoeukaryote ostreococcus tauri
Uploaded: 2012-07-13T13:00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri at JoVE.com

SynthSys مركز بيولوجيا الأنظمة التكاملية تموله BBSRC وجائزة EPSRC D019621. وقد مول الاتحاد الأوروبي FP6 شبكة التميز منحة &quot;الجينوم البحرية&quot; لFYB تطوير أساليب التحول الجيني.

1. إعداد المواد الطحالب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم استزراع خلايا Ostreococcus في مياه البحر الاصطناعي (ASW). وتذوب أملاح البحر (حوالي 40 غراما عادة للتر الواحد) في المياه deionised إلى الملوحة من 30 جزء في الألف، كما يقاس باستخدام متر الملوحة. تضاف المتوسطة تخصيب 11،12، بعض العناصر المعدنية والفيتامينات التتبع كما هو موضح في الجداول 1-3. وسائل الإعلام ثم فلتر تعقيمها من خلال 0.22 ميكرون فلتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للصيانة، وخلايا من سلالة Ostreococcus OTTH95 هي شبه مثقف جو معقم و مطهر حتى التخفيف من 100/1 في ASW جديدة كل 7 أيام، وتنمو تحت ضوء مستمر في محطة حاضنة نمو مزودة ضوء القمر الأزرق مرشح. وينبغي أن شدة الضوء تكون قريبة إلى 20 μmol م -1 ق -2 ويتم الحفاظ على درجة حرارة 20 درجة مئوية الخلايا لا تحتاج إلى تحريض مستمر، ولكن اهتزت مرة واحدة كل يوم 2 إلى 3 لمنع تجميع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل تحول، ويلزم 50 مل من الخلايا في خلية ديnsity من 20-30 مل 10 6 س -1، والتي ينبغي تحقيقها 5-7 أيام الفرعية التالية زراعة. ويمكن تحديد تقريبي كثافة الخلايا وaxeny باستخدام التدفق الخلوي أو haemocytometer واحد على الحد الأدنى من تكبير X40. </li></ol> 2. Electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير الحمض النووي لهذا التحول. لكل تحول، مطلوب 5 ميكروغرام من الحمض النووي linearised نقي، البلازميد بتركيز 1 ميكروغرام / ميكروليتر في المياه deionised العقيمة. للحصول على هذا الحمض النووي، والكتاب يوصي باستخدام ميدي QIAGEN الإعدادية عدة، على الرغم من أساليب أخرى يمكن أن تعمل بشكل جيد على قدم المساواة. هضم المنتج مع الانزيم الذي يقطع في العمود الفقري للناقلات المستعملة، ولكن ليس في التحوير أو الجينات اختيار. مزيد من تنقية وتركيز الحمض النووي الناتج خطي من قبل هطول الأمطار الإيثانول، وresuspend المنتج في حجم مناسب من المياه ذات الجودة العالية deionised العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أنابيب microcentrifuge تحتوي على 5 الحمض النووي ميكروغرام لكل تحويل. وكنترولل مع عدم وجود الحمض النووي ضروري لأن تتحول كل سطر الخلية. تبقى هذه الأنابيب على الجليد، جنبا إلى جنب مع كوفيت electroporation 2 مم لكل تحويل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 2.2 مل من العازلة إعادة تعليق في التحول. حل سوربيتول في التوصل إلى حل 1 م في DDH 2 O، إضافة 0.1٪ حمض pluronic F68 وفلتر تعقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة pluronic حامض F68، إلى تركيز النهائي من 0.1٪ إلى الخلايا، وبيليه لهم لمدة 10 دقائق في ز 8000x على 10 درجة مئوية في أنبوب 50 مل مع قاع مخروطي. resuspend فورا الخلايا في 1 مل من العازلة إعادة تعليق من قبل pipetting صعودا وهبوطا، ونقل إلى أنبوب microfuge. تدور باستمرار لمدة 10 دقائق في 8000 XG على 10 درجة مئوية، والعمل بسرعة، كرر هذه الخطوة يغسل مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع طرف قطع، resuspend كل بيليه النهائي في 40 ميكرولتر من العازلة إعادة تعليق. اضافة 40 ميكروليتر من الخلايا معلق على كل أنبوب من الحمض النووي linearised على الجليد، مزيج بلطف ونقل إلى كوفيت electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كفيت في electropخطبة آلة. تغيير الإعدادات لسم كيلو فولت 6 -1، 600 Ω، وμF 25. Electroporate الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا electoporated في cuvettes في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق، واستخدام هذا الوقت لإعداد قوارير زراعة الأنسجة. تسمية لهم وإضافة 30 مل من ASW جديدة للكل. أخذ 1 مل من كل قارورة وإضافة برفق إلى كوفيت المقابلة. احتضان لمدة 2 دقيقة وإزالتها بلطف ASW، تحتوي الآن على كرية من الخلايا وبلطف وببطء ماصة مباشرة في ASW في قارورة الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا تبقى عادة في كرية. والحرص على عدم اهتزاز أو زعزعة الخلايا مجمعة في هذه اللحظة. السماح للخلايا لاسترداد في الحاضنة لمدة 1-2 ساعات، ثم resuspend عن طريق هز قوارير. في هذا الوقت، يجب أن الخلايا resuspend بحرية وكتل لا يجب أن يكون مرئيا. ترك الثقافات لاسترداد بين عشية وضحاها في الحاضنة. </li></ol> 3. إدراج خلايا في لوحات في شبه صلبة متوسطة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><lأنا&gt; وفي اليوم التالي، الأوتوكلاف حل من 2.1٪ انخفاض ذوبان الاغاروز نقطة في DDH 2 O في زجاجة تحتوي على قضيب التحريك. إبقاء المنصهر في 65-90 درجة مئوية في أكبر كوب يحتوي على ماء على النمام التدفئة المغناطيسي. لكل تحول تحضير 8 أطباق بتري (55 مم القطر) و 8 × 15 مل أنابيب تحتوي كل منها على 9 مل من ASW بالإضافة إلى اختيار المطلوبة. إذا باستخدام Nourseothricin أو G418، استخدام 2 ملغ / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا تتحول من الحاضنة. العمل في flowhood معقم، إضافة 1 مل من الاغاروز LMP الغليان إلى مل 9 في واحد من الأنابيب. إغلاق أنبوب، وتخلط بواسطة قلب. ثم يضاف 0.5 مل من الخلايا تحولت حديثا، مزيج بسرعة وتصب في صحن. كرر هذه العملية مع أنابيب 7 المتبقية ومن ثم الشروع في قارورة التحول المقبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك لوحات فتح غطاء محرك السيارة في تدفق لمدة ساعة، لالاغاروز لتعيين. ثم إغلاق لوحات وتحويلها إلى أطباق بتري كبير مربع، والذي سوف يعقد كل 4 لوحات. ختم خفة دم لوحات مربعح parafilm. لاحظ أن لوحات لن يضع تماما، ونتيجة لذلك، فإن جل هشة جدا. ينبغي الحرص على عدم كسر هلام عند التعامل مع لوحات. إخضاع جميع لوحات مربع في الحاضنة. </li></ol> 4. اختيار المستعمرات المحولة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن المستعمرات تظهر بعد 10 إلى 21 يوما على لوحات التحول، ولكن ليس على لوحات وهمية تحول. لاختيار المستعمرات استخدام ماصة 200 ميكرولتر مع قطع نصائح. ببساطة اختيار المستعمرات حرة وامتصاص المستعمرة الخضراء. والحرص على عدم إدراج أي خلايا من المستعمرات المجاورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا إلى 2 مل من المتوسط ​​السائلة التي تحتوي على التحديد، في لوحة الآبار 24. عند استخدام Nourseothricin، استخدم 1.75 ملغم / لتر. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا. حدد 24-50 المستعمرات في التحول. ختم لوحات مع parafilm ونقلها إلى الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أسبوع، نقل 100 ميكرولتر من كل بئر إلى 2 مل جديدة مضادة للغواصات مع التحديد في لوحة الآبار 24 و تنمو لadditionaل 7 أيام. ويمكن استخدام خطوط الخلايا على قيد الحياة لمزيد من الدراسات. وينبغي تحليل التكامل مستقر في عدد الجينوم والإدراج باستخدام PCR، وصمة عار للجنوب. ويمكن الحصول على الحمض النووي الجيني لهذه الأغراض استخدام أي وسيلة لأسفل تحجيم مستوى لاستخراج الحمض النووي المصنع. </li></ol> 5. ممثل النتائج انقسام الخلايا 1/100 وصلت إلى كثافة 25 مليون الخلايا في المليلتر بعد تزايد لمدة 7 أيام. أدى Electroporation من الخلايا مع الإعدادات المناسبة في الألف بين 10 و 14 وقتا ثابت. عندما يتم نقل الخلايا والمتوسطة في قوارير والثقافة، ويجب أن كرية من الخلايا تشكل. عندما اهتزت طفيفة بعد ساعة، وينبغي أن الخلايا resuspend بسهولة. وينبغي إدراج الخلايا 1 مل تتحول أجار آخر دورة شهرية بنسبة 0.2٪ ينتج مادة هلامية شبه صلبة بما يتفق ولكن فقط. وينبغي أن المستعمرات تظهر بعد 10 إلى 21 يوما. عندما تحول 5 ميكروغرام من الحمض النووي linearised باستخدام بروتوكول أعلاه، 50-100 المستعمرات في التحولوكان من المتوقع عادة لوحة، مقابل لا شيء على لوحات التحكم سلبي. ~ تم اختيارهم بشكل إيجابي 80٪ من المستعمرات التقطت من قبل المقاومة للمضادات الحيوية في وسط سائل، وكانت تستخدم في دراسات لاحقة. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> نهائي تركيز </td><td> الأسهم حل </td><td> لحجم 1 لتر </td></tr><tr><td> NANO 3 </td><td> 8.83 × 10 م -4 </td><td> 75 غ / لتر درهم O 2 </td><td> 1 مل </td></tr><tr><td> NH 4 الكلور </td><td> 3،63 X 10 -5 M </td><td> 2.68 غ / ل DH O 2 </td><td> 1 مل </td></tr><tr><td> β-جليسروفوسفات </td><td> 1 × 10 -5 م </td><td> 2.16 غ / ل DH 2 O </td><td> 1 مل </td></tr><tr><td> H 2 3 سيو </td><td> 1 × 10 -8 م </td><td> 1.29 ملغم / لتر درهم O 2 </td><td> 1 مل </td></tr><tr><td> تريس قاعدة (درجة الحموضة 7.2) </td><td> 1 × 10 م -3 </td><td> 121.1 جرام / لتر درهم O 2 </td><td> 1 مل </td></tr><tr><td> K حل المعادن النزرة </td><td></td><td> الجدول 2 </td><td> 1 مل </td></tr><tr><td> و / 2 فيتامين حل </td><td></td><td> الجدول 3 </td><td> 0.5 مل </td></tr></tbody></table> الجدول رقم 1. المتوسطة المكونة للنمو من O. tauri 11 و 12. يشكلون إجمالي حجم 1 لتر من مياه البحر الاصطناعي إلى الملوحة من 30 جزء في الألف، وإضافة العناصر المذكورة أعلاه من الحلول الأوراق المالية كما هو محدد. فلتر تعقيم المتوسطة واستخدامها في غضون أسبوع. ويمكن تجميع مخزون من جميع المركبات ما عدا فيتامين حل لإضافة 6 مل من هذا المحلول لكل لتر من المتوسط. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> نهائي تركيز </td><td> الأسهم حل </td><td> المبلغ 1 ليتر </td></tr><tr><td> غ 2 </sUB&gt; EDTA • 2H 2 O </td><td> 1 × 10 م -4 </td><td></td><td> 41،6 ز </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td> 1 × 10 -5 م </td><td></td><td> 3،15 غرام </td></tr><tr><td> نا 2 مو 4 • 2H 2 O </td><td> 1 × 10 -8 م </td><td> 6،3 غ / ل DH O 2 </td><td> 1 مل </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td> 1 × 10 -9 م </td><td> 22.0 جرام / لتر درهم O 2 </td><td> 1 مل </td></tr><tr><td> كوكلي 2 • 6H 2 O </td><td> 1 × 10 -9 م </td><td> 10.0 جرام / لتر درهم 2 O </td><td> 1 مل </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td> 1 × 10 -8 م </td><td> 180.0 جرام / لتر درهم O 2 </td><td> 1 مل </td></tr><tr><td> CUSO 4 • 5H 2 O </td><td> 1 × 10 -8 م </td><td> 9.8 غرام / DH L <sub&gt; 2 O </td><td> 1 مل </td></tr></tbody></table> الجدول 2. تتبع معدن حل 11،12. جعل ما يصل الى ما مجموعه 1 ليتر، في DH 2 O، والحرارة إلى حل. قسامة الحل والتجميد للتخزين. وأشار تركيزات النهائية تشير إلى متوسط ​​نهائي وليس الحل المعادن النزرة. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> نهائي تركيز </td><td> الأسهم حل </td><td> المبلغ 1 ليتر </td></tr><tr><td> فيتامين ب 12 </td><td> 1 × 10 -10 م </td><td> 1 غرام / لتر درهم O 2 </td><td> 1 مل </td></tr><tr><td> البيوتين </td><td> 1 × 10 -9 م </td><td> 0.1 غ / لتر درهم 2 O </td><td> 10 مل </td></tr><tr><td> الثيامين • حمض الهيدروكلوريك </td><td> 1 × 10 -7 M </td><td></td><td> 200 ملغ </td></tr></tbody></table> الجدول 3. و / 2فيتامين حل 11. مستحضرات التجميل إلى ما مجموعه 1 ليتر في DH 2 O، فلتر تعقيم، قسامة والتجميد. وأشار تركيزات النهائية تشير إلى متوسط ​​نهائي وليس الحل فيتامين. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig1.jpg" /> الشكل 1. رسومية محة عامة عن إجراءات التحول. تمثيل تخطيطي لإجراء لتحويل وراثيا Ostreococcus tauri بواسطة electroporation. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig2.jpg" /> الشكل 2. نمو الثقافة. الخلايا هي شبه مثقف جو معقم و مطهر حتى التخفيف من 100/1 في ASW جديدة كل 7 أيام، وتنمو تحت ضوء مستمر في محطة حاضنة للنمو مزودة ضوء القمر الأزرق مرشح. وينبغي أن شدة الضوء تكون قريبة إلى 20 μmol م -2 ث -1، ويتم الاحتفاظ درجة الحرارة عند 20 درجة مئوية خلايا لا تحتاج إلى تحريض مستمر، ولكن لياليصخر مرة واحدة كل يوم 2 إلى 3 لمنع تجميع. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig3.jpg" /> الشكل 3. تشكيل مستعمرة في الاغاروز LMP 0.2٪. نقل 4 لوحات على طبق بيتري كبيرة مربعة، وختم مع parafilm (أعلى اليسار). عندما شكلت مستعمرات، ببساطة اختيار حر (مثالي على شكل مخروطي) المستعمرات (أعلى يمين) وأمتص لهم للخروج من لوحة مع ماصة P200. وينبغي أن يكون هناك مستعمرات في وحدة التحكم السلبية (أسفل اليمين).

<ol>
	<li>Derelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+analysis+of+the+smallest+free-living+eukaryote+Ostreococcus+tauri+unveils+many+unique+features.">Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).</li><li>Henderson, G. P., Gan, L., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+ultrastructure+of+O.+tauri:+electron+cryotomography+of+an+entire+eukaryotic+cell.">3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell.</a> PLoS One. 2, e749 (2007).</li><li>O'Neill, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+persist+without+transcription+in+a+eukaryote.">Circadian rhythms persist without transcription in a eukaryote.</a> Nature. 469, 554-558 (2011).</li><li>van Ooijen, G., Dixon, L. E., Troein, C., Millar, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+function+is+required+for+biological+timing+throughout+the+twenty-four+hour+cycle.">Proteasome function is required for biological timing throughout the twenty-four hour cycle.</a> Curr. Biol. 21, 869-875 (2011).</li><li>Troein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+light+inputs+to+a+simple+clock+circuit+allow+complex+biological+rhythms.">Multiple light inputs to a simple clock circuit allow complex biological rhythms.</a> Plant. J. 66, 375-385 (2011).</li><li>Corellou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clocks+in+the+green+lineage:+comparative+functional+analysis+of+the+circadian+architecture+of+the+picoeukaryote+ostreococcus.">Clocks in the green lineage: comparative functional analysis of the circadian architecture of the picoeukaryote ostreococcus.</a> Plant Cell. 21, 3436-3449 (2009).</li><li>O'Neill, J. S., Reddy, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+clocks+in+human+red+blood+cells.">Circadian clocks in human red blood cells.</a> Nature. 469, 498-503 (2011).</li><li>Monnier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrated+transcription+of+biological+processes+in+the+marine+picoeukaryote+Ostreococcus+exposed+to+light/dark+cycles.">Orchestrated transcription of biological processes in the marine picoeukaryote Ostreococcus exposed to light/dark cycles.</a> B.M.C. Genomics. 11, 192 (2010).</li><li>Le Bihan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+proteomic+analysis+of+the+unicellular+alga+Ostreococcus+tauri.">Shotgun proteomic analysis of the unicellular alga Ostreococcus tauri.</a> J. Proteomics. 74, 2060-2070 (2011).</li><li>Corellou, F., Bouget, F. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+polypeptides+from+the+nuclear+genome+of+Ostreococcus+sp.">Expression of polypeptides from the nuclear genome of Ostreococcus sp.</a> US application patent. , (2010).</li><li>Guillard, R. R. L., Ryther, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+marine+planktonic+diatoms.+I.+Cyclotella+nana+Hustedt,+and+Detonula+confervacea+(cleve)+Gran.">Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran.</a> Can. J. Microbiol. 8, 229-239 (1962).</li><li>Keller, M. D., Selvin, R. C., Claus, W., Guillard, R. R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media+for+the+culture+of+oceanic+ultraphytoplankton.">Media for the culture of oceanic ultraphytoplankton.</a> J. Phycol. 23, 633-638 (1987).</li><li>Djouani-Tari, e. l. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phosphate-regulated+promoter+for+fine-tuned+and+reversible+overexpression+in+Ostreococcus:+Application+to+circadian+clock+functional+analysis.">A phosphate-regulated promoter for fine-tuned and reversible overexpression in Ostreococcus: Application to circadian clock functional analysis.</a> PLoS One. 6, e28471 (2011).</li><li>Moulager, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+light+signals+by+the+retinoblastoma+pathway+in+the+control+of+S+phase+entry+in+the+picophytoplanktonic+cell+Ostreococcus.">Integration of light signals by the retinoblastoma pathway in the control of S phase entry in the picophytoplanktonic cell Ostreococcus.</a> PLoS. Genet. 6, e1000957 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الخلوية الدولة وثقافة axeny له أهمية حاسمة بالنسبة لإجراء تحول. على الرغم من أن يتم الاحتفاظ عادة الخلايا في دورات من 12 ساعة ضوء ذلك، تم العثور على 12 ساعة مظلمة، وكفاءة في تحويل خلايا نمت في ظل هذه الظروف غير كافية. خلال الخطوات التكوير / إعادة تعليق المتكررة، يجب أن الخلايا resuspend دائما بسهولة. إذا خلايا الكلية، أو على مادة تشبه المخاط موجودا، فمن الأفضل لبدء هذا الإجراء من البداية مرة أخرى. عادة، يمكن توقع ~ 50 المستعمرات في كل لوحة تحول، مقابل لا شيء على لوحة تحكم سلبي. في حالة انخفاض كفاءة التحويل، ينبغي أن تختلف ظروف زراعة لضمان الخلايا هي في حالة مثلى. المتغيرات التي تؤثر على كفاءة تحويل وتشمل درجة الحرارة المحيطة في المختبر (يجب أن تكون قريبة من 20 درجة مئوية)، وسرعة التعامل مع (إجراء من التكوير خلايا [2.3] لاسترداد [2،7] ينبغي أن تأخذ ~ 1 ساعة). من المهم أيضا أن كل الحلول 1جعل إعادة الطازجة قبل كل تحول. لإدراجها في لوحات، وتركيز الاغاروز LMP أمر بالغ الأهمية. الخلايا Ostreococcus لن تنمو في تركيزات عالية الاغاروز، وسيتم نشرها في التركيزات المنخفضة. وقد تم نشر ثلاث ناقلات تحول لOstreococcus سابقا 6، ويتوقع المزيد من ناقلات إلى أن ولدت، ونشرت في وقت قريب. الموجه الحالية وعاء لوك 6 يسمح استعمال promotor من خيار في تركيبة مع علامة اليراع C-محطة luciferase المراسل السماح أسرع المعدلة وراثيا اختيار خط زائد أنماط التعبير لين العريكة، في حين أن ناقلات Potox 6 يحمل قوي محرض 13 promotor مأخوذة من Ostreococcus ارتفاع الناقل الفوسفات الانجذاب (اللمس) جين overexpression من هذا الجين من الفائدة. الموجه Potox لوك مستمد من Potox، يحمل علامة luciferase المراسل الإضافية التي يمكن استخدامها لاختيار غير المباشرة للخطوط overexpression <sحتى 14&gt;. علامات اختيار ناجح على هذه النواقل هي Nourseothricin و G148. ومع ذلك، الخلايا Ostreococcus هي مقاومة عالية للكثير من المضادات الحيوية، وتركيزات المركبات الضرورية لتحديد الخلايا المعدلة وراثيا Ostreococcus أعلى من النموذج التقليدي للنظم (2 ملغ / مل). على الرغم من أن عملية يبدو غير فعال، وعدد كبير من الخلايا والحمض النووي البلازميد اللازمة لهذا الإجراء لا يشكل عقبة كبيرة. وأكبر القيد هو أن كل خط المولدة التي هي مقاومة للعلامة اختيار يحتاج إلى تحليل فردي للتأكد من أن يتم دمج كامل التركيبة في الحمض النووي. وقد لاحظنا في الأمثلة التي التعبير الناجح لعلامة اختيار لم تكن مناسبة للادراج في الجينات الفعلية في المصالح؛ التكاملات أي جزئية يمكن أن يحدث. من الواضح، الإدراج عشوائية في جينوم يعني أيضا أنه ليست هناك سيطرة من موقع الإدراج باستخدام هذا الأسلوب، وأساليب بويجري حاليا ased على إعادة التركيب مماثل يجري وضعها. ومع ذلك، وصفت طريقة هنا هو، لمعرفة أفضل لنا، في الوقت الراهن أسلوب يتميز فقط على توليد خلايا Ostreococcus المعدلة وراثيا. كما تم مؤخرا فقط Ostreococcus tauri تستخدم كائن النموذج التجريبي، ومعظم أساليب العمل مع هذه الخلايا من المحتمل أن تتطور ويتم تكريره من قبل الأوساط البحثية المتنامية المعنية. ويهدف هذا البروتوكول لمساعدة الناس على الشروع في العمل مع Ostreococcus، ولكن بأي حال من الأحوال يدعي لوصف كل ما يمكن معرفته عن التحول الجيني لهذا microalga. على ثقة من الكتاب أن القراء سوف تكون قادرة على التكيف مع هذا البروتوكول لاحتياجاتها الخاصة والفروق الصغيرة في الحاضنات (مستويات الضوء أو النوعية) وغيرها من المعالم وجود وسوف يكون من المحتمل أن يكون الأمثل في كل مختبر الفردية للحصول على الثقافات الصحية اللازمة لهذا بروتوكول. بعد اتقان التقنيات وصفت هنا،ويمكن بناء ناقلات لتوليد الانارة، فلوري، أو غيرها من خطوط الانصهار الموسومة تحت سيطرة مجموعة من الدعاة. وهذه التجارب رواية مثيرة منصة مفيدة لدراسة كيفية حل مشاكل معقدة البيوكيميائية في خفض حقيقي النواة من التعقيد، والتي هي سهلت للغاية نهج الدوائية 3.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="4"> المتوسطة المكونة </td></tr><tr><td> مادة كيميائية </td><td colspan="2" > فهرس العدد </td><td> المزود </td></tr><tr><td> لحظة المحيط البحري السلط </td><td colspan="3"> من <a href="http://amazon.co.uk" target="_blank">amazon.co.uk</a> أو <a href="http://rocketaquatics.co.uk" target="_blank">rocketaquatics.co.uk</a> </td></tr><tr><td> NANO 3 </td><td colspan="2"> S5506-250G </td><td> سيغما </td></tr><tr><td> NH 4 الكلور </td><td colspan="2"> A9434-500G </td><td> سيغما </td></tr><tr><td> الجلسرين ملح الصوديوم 2-فوسفات هيدرات </td><td colspan="2"> G9422-100G </td><td> سيغما </td></tr><tr><td> H 2 3 سيو </td><td colspan="2"> 84920-250G </td><td> سيغما </td></tr><tr><td> الفائق النقاوة تريس </td><td colspan="2"> 15504-020 </td><td> إينفيتروجن </td></tr><tr><td> نا 2 إدتا • 2H 2 O </td><td colspan="2"> BPE120-500G </td><td> فيشر العلمية </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 157740 </td><td> سيغما </td></tr><tr><td> نا 2 مو 4 • 2H 2 O </td><td colspan="2"> 31439-100G-R </td><td> سيغما </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td colspan="2"> Z0251 </td><td> سيغما </td></tr><tr><td> كوكلي 2 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 31277 </td><td> سيغما </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td colspan="2"> 203734-5G </td><td> سيغما </td></tr><tr><td> CUSO 4 • 5H 2 O </td><td colspan="2"> C8027 </td><td> سيغما </td></tr><tr><td> فيتامين ب 12 (سيانوكوبالامين) </td><td colspan="2"> V2876 </td><td> سيغما </td></tr><tr><td> البيوتين </td><td colspan="2"> 47868 </td><td> سيغما </td></tr><tr><td> الثيامين • حمض الهيدروكلوريك </td><td colspan="2"> T4625 </td><td> سيغما </td></tr><tr><td> أمبيسيلين </td><td colspan="2"> A9518-25G </td><td> سيغما </td></tr><tr><td> النيوميسين </td><td colspan="2"> N6386 </td><td> سيغما </td></tr><tr><td> الكانامايسين </td><td colspan="2"> K4000 </td><td> سيغما </td></tr><tr><td colspan="4"> المواد الاستهلاكية للزراعة </td></tr><tr><td colspan="2"> بند </td><td> فهرس العدد </td><td> المزود </td></tr><tr><td colspan="2"> نسيج الثقافة قارورة الثقافات التعليق T25 تنفيس مع صب القناة </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> نسيج الثقافة قارورة الثقافات التعليق T75 تنفيس مع صب القناة </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedتي </td></tr><tr><td colspan="2"> نسيج الثقافة قارورة الثقافات التعليق T175 تنفيس مع صب القناة </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> مرشحات TPP أعلى الزجاجة، 1L، كاملة </td><td> 99950T </td><td> العلوم البيولوجية هيلينا </td></tr><tr><td colspan="2"> مرشحات زجاجة TPP أعلى، 500ml، </td><td> 99500T </td><td> العلوم البيولوجية هيلينا </td></tr><tr><td colspan="2"> مرشحات TPP أعلى الزجاجة، 250ml الاتحاد، </td><td> 99250T </td><td> العلوم البيولوجية هيلينا </td></tr><tr><td colspan="2"> مرشحات TPP أعلى الزجاجة، 150ml، </td><td> 99150T </td><td> العلوم البيولوجية هيلينا </td></tr><tr><td colspan="2"> مقياس الملوحة لمتحف البحرية </td><td> DSG-10 </td><td> Daeyoon </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="3" > المواد الكيميائية لتحول </td></tr><tr><td> مادة كيميائية </td><td> كتالوجعدد </td><td> المزود </td></tr><tr><td> D-سوربيتول </td><td> S6021-1KG </td><td> سيغما </td></tr><tr><td> Pluronic F-68 حل </td><td> P5556-100ML </td><td> سيغما </td></tr><tr><td> ClonNat </td><td> 51000 </td><td> ويرنر </td></tr><tr><td> انخفاض نقطة انصهاره الاغاروز </td><td> 16520-050 </td><td> إينفيتروجن </td></tr><tr><td colspan="3"> المواد الاستهلاكية للتحول </td></tr><tr><td> بند </td><td> فهرس العدد </td><td> المزود </td></tr><tr><td> نسيج الثقافة قارورة الثقافات التعليق T25 تنفيس مع صب القناة </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> نسيج الثقافة قارورة الثقافات التعليق T75 تنفيس مع صب القناة </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> نسيج الثقافة قارورة T175 تعليق النحاسltures تنفيس مع صب القناة </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> أنابيب الطرد المركزي غرينر 50ml </td><td> 227261 </td><td> GBO </td></tr><tr><td> الجينات بولسير / MicroPulser Cuvettes، 0.2 سم فجوة، 50 </td><td> 165-2086 </td><td> الحيوي راد </td></tr><tr><td> طبق بتري جولة PS 3 كوات H14.2 Φ55 </td><td> 391-0895 </td><td> VWR الدولية </td></tr><tr><td> طبق بتري مربع مع البوليسترين المخارج 4 معقم بواسطة 120mm أشعة واضحة </td><td> FB51788 </td><td> فيشر العلمية </td></tr><tr><td> ضوء القمر الأزرق ضوء فلتر </td><td> 183 </td><td> لي إضاءة </td></tr></tbody></table>

genomic transformation of the picoeukaryote ostreococcus tauri

المشاكل المشتركة التي تعوق التقدم السريع في علوم النبات وتشمل الخلوية والأنسجة وتعقيد الكائن الحي كله، وخصوصا على مستوى عال من التكرار الجيني التي تؤثر على الوراثة بسيط في النباتات العليا. الكائن الحي نموذج رواية Ostreococcus tauri هو أصغر حرة المعيشة حقيقي النواة معروف حتى الآن، وتمتلك حجم الجينوم تقلص إلى حد كبير والخلوية 1،2 التعقيد، والذي تجلى من خلال وجود واحد فقط من معظم العضيات (الحبيبات الخيطية، بلاستيدات الخضراء، جولجي كومة) في الخلية، والتي تحتوي على الجينوم فقط ~ 8000 الجينات. وعلاوة على ذلك، فإن الجمع بين unicellularity والثقافة سهل توفر منصة قابلة للنهج البيولوجيا الكيميائية. مؤخرا، تم Ostreococcus استخدامها بنجاح لدراسة الآليات الأساسية الكامنة وراء ضبط الوقت الإيقاعية 3-6. وقد أثرت نتائج من هذا الكائن الحي نموذج ليس فقط علوم النبات، ولكن أيضا بيولوجيا الثدييات 7. ويوضح هذا المثال كيف التجريب السريع فييمكن حقيقي النواة بسيط من سلالته الخضراء تسريع البحوث في كائنات حية أكثر تعقيدا عن طريق توليد الفرضيات القابلة للقياس باستخدام وسائل ممكنة من الناحية التقنية فقط في هذه الخلفية من تعقيد مخفضة. علم الجينوم وإمكانية لتعديل الجينات هي أدوات لا غنى عنها في أي نوع نموذجي. الجينومية 1، Transcriptomic 8، والبروتين 9 معلومات عن هذه الأنواع هي متاحة بحرية، في حين من المعروف أن الأساليب وذكرت سابقا 6،10 لتحويل وراثيا Ostreococcus إلى المختبرات القليلة على مستوى العالم. في هذه المقالة، والطرق التجريبية وراثيا لتحويل هذا الحي نموذج الرواية مع overexpression ترد عن طريق بناء electroporation بالتفصيل، فضلا عن طريقة إدراج الخلايا تحولت في الاغاروز انخفاض النسبة المئوية للسماح للاختيار من خطوط تحويل منشؤها من واحد تحول الخلية. بعد التطبيق الناجح للOstreococcus للبحوث الإيقاعية، يمكن توقع تزايد الاهتمام في Ostreococcus من المجالات البحثية المختلفة داخل وخارج علوم النبات، بما في ذلك مجالات التكنولوجيا الحيوية. يمكن للباحثين من طائفة واسعة من العلوم البيولوجية والطبية التي تعمل على المسارات البيوكيميائية حفظها النظر في البحوث السعي في Ostreococcus، وخالية من التعقيد الجيني والعضوي من نوع أكبر نموذج.

Watch this Scientific Journal Video about Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri at JoVE.com

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

توضح هذه المقالة التحول الجيني للطحلب البحرية وحيدة الخلية<em&gt; Ostreococcus tauri</em&gt; من جانب electroporation. هذا الكائن هو منصة حقيقية النواة نموذج فعال لارتفاع النباتات، وتقلص إلى حد كبير possesing تعقيد الجينومية والخلوية وكونها قابلة بسهولة للثقافة الخلية والبيولوجيا الكيميائية على حد سواء.

الجينومية التحول من Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

genomic-transformation-of-the-picoeukaryote-ostreococcus-tauri

Research

JoVE Journal

Biology

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

عزل الحمض النووي الجينوم من الذيول ماوس

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

مكتبة كبيرة إدراج الجينوم البيئية الإنتاج

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

جيل من الحمض النووي الريبي / الحمض النووي DNA في الجينوم الهجائن التي تحول باستخدام الحمض النووي الريبي التي تحتوي على [أليغنوكليوتيد]

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

الجينومية MRI -- وهو من الموارد العامة للدراسة أنماط تسلسل الحمض النووي داخل الجينوم

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

الجينوم شاشات التنافسية للمكتبات الخميرة Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

انتقائية لقطة من hydroxymethylcytosine-5 من الحمض النووي الجيني

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

مجموعة المقارن الجينوم التهجين (صفيف [ك]) عن الكشف عن الجينوم نسخ عدد المتغيرات

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

التضخيم، الجيل التالي من التسلسل، والحمض النووي الجينوم رسم خرائط مواقع التكامل فيروسات الرجعية

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

استهدفت RNA تسلسل الفحص لتحديد خصائص التعبير الجيني والجينوم التعديلات

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

إعداد وحقن أجنة البعوض Culex لتوليد الطفرات فارغة باستخدام CRISPR / Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...