Name: genomic transformation of the picoeukaryote ostreococcus tauri
Uploaded: 2012-07-13T13:00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri at JoVE.com

SynthSys een Centre for Integrative Systems Biology gefinancierd door BBSRC en EPSRC award D019621. EU FP6 Network of Excellence &#39;Marine Genomics &quot;subsidie ​​aan Fyb heeft gefinancierd ontwikkeling van genetische transformatie methoden.

1. Voorbereiding van algen Materiaal <ol><li> Ostreococcus cellen worden gekweekt in kunstmatig zeewater (ASW). Zeezouten (typisch ongeveer 40 g per liter) worden opgelost in gedeïoniseerd water tot een saliniteit van 30 ppt, zoals gemeten met een saliniteit meter. Aanrijkingsmedium 11,12, zware metalen elementen en vitaminen worden toegevoegd zoals beschreven in tabellen 1-3. De media is dan filter-gesteriliseerd door een 0,22 pm filter. </li><li> Voor het onderhoud, de cellen van Ostreococcus stam OTTH95 zijn sub-gekweekt aseptisch in een verdunning van 1/100 in zoet ASW om de 7 dagen en geteeld onder constant licht in een groei van de plant incubator uitgerust met Moonlight Blue filter. De lichtintensiteit moet ongeveer 20 mol m -2 s -1 zijn en temperatuur wordt op 20 ° C. Cellen niet nodig constant roeren, maar geschud om de 2 tot 3 dagen aggregatie te voorkomen. </li><li> Voor elke transformatie worden 50 ml cellen vereist bij de celnsity 20-30 x 10 6 ml-1, dat moet 5-7 dagen worden bereikt na sub-kweken. Geschatte celdichtheid axeny kan worden bepaald met behulp van flow cytometrie of een hemocytometer op minimaal x40 vergroting. </li></ol> 2. Elektroporatie <ol><li> Bereid DNA voor de transformatie. Per transformatie wordt 5 ug zuivere gelineariseerde plasmide DNA vereist bij een concentratie van 1 pg / pl in steriel gedeïoniseerd water. Om dit DNA te verkrijgen, de auteurs raden het gebruik van een Qiagen midi prep-kit, maar ook andere methoden kan even goed werken. Digest het product met een enzym dat snijdt in de ruggengraat van de gebruikte vector, maar niet in de transgene of selectie gen. Verder te zuiveren en te concentreren de resulterende lineaire DNA door ethanol precipitatie, en mengen van het product in de juiste hoeveelheid hoogwaardige steriel gedeïoniseerd water. </li><li> Bereid microcentrifugebuizen met 5 ug DNA voor elke transformatie. Een control zonder DNA nodig voor elke cellijn worden getransformeerd. Houd deze buizen op ijs, met een 2 mm elektroporatie cuvet voor elke transformatie. </li><li> Bereid 2,2 ml van resuspentie buffer per transformatie. Los Sorbitol een 1 M oplossing in DDH 2 O toevoegen 0,1% pluronisch zuur F68 en filter-steriliseren. </li><li> Voeg pluronisch zuur F68 tot een eindconcentratie van 0,1% van de cellen en hun pellet gedurende 10 minuten bij 8000x g bij 10 ° C in een 50 ml buis konische bodem. Onmiddellijk resuspendeer de cellen in 1 ml buffer resuspensie door en neer te pipetteren, en over te dragen aan een microfugebuis. Spin down gedurende 10 minuten bij 8000 xg bij 10 ° C en snel te werken, herhaalt u deze wasstap nog een keer. </li><li> Met een snee tip, resuspendeer elke laatste pellet in 40 pi van resuspensie buffer. Voeg 40 ul van de geresuspendeerde cellen aan elke buis van gelineariseerde DNA op het ijs, voorzichtig mengen en over te dragen aan de elektroporatie cuvette. </li><li> Plaats de cuvet in de electroporatie machine. Wijzig de instellingen tot 6 kV cm -1, 600 Ω, en 25 uF. Electroporate de cellen. </li><li> Incubeer de electoporated cellen in de cuvetten bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en gebruikt die tijd de weefselkweekflessen bereiden. Label ze en voeg 30 ml vers ASW aan elk. Neem 1 ml uit elke kolf en voorzichtig toe te voegen aan de betreffende kuvet. Incubeer gedurende 2 minuten en verwijder voorzichtig de ASW, nu met het bolletje van cellen en voorzichtig en langzaam direct pipet in de ASW in de cultuur kolf. </li><li> Cellen meestal nog een globule. Zorg ervoor dat u schudden of de geaggregeerde cellen verstoren op dit moment. Laat de cellen in de incubator te herstellen gedurende 1-2 uur, daarna mengen door schudden van de kolven. Op dit moment moet de cellen vrij te resuspenderen en geen klonten zichtbaar moeten zijn. Laat de culturen om &#39;s nachts terug in de incubator. </li></ol> 3. Opname van cellen op platen in Semi-vast medium <ol><li&gt; De volgende dag autoclaaf een oplossing van 2,1% laag smeltpunt agarose in DDH 2 O in een fles met een roerstaaf. Houd gesmolten bij 65-90 ° C in een grotere bekerglas met water op een verwarmingsinrichting magneetroerder. Voor elke transformatie bereiden 8 petrischalen (55 mm diameter) en 8 x 15 ml; elk met 9 ml ASW plus de gewenste selectie. Bij gebruik van Nourseothricin of G418, gebruik dan 2 mg / ml. </li><li> Verzamel de getransformeerde cellen uit de incubator. Het werken in een steriele flowhood, 1 ml kokend LMP agarose de 9 ml in een van de buizen. Sluit de buis, en meng door. Voeg vervolgens 0,5 ml van een vers getransformeerde cellen, snel door elkaar en giet het in de plaat. Herhaal dit proces met de resterende 7 buizen en ga verder met de volgende transformatie kolf. </li><li> Laat de platen te openen in de stroom kap voor een uur, voor de agarose op te zetten. Sluit vervolgens de borden en zet ze tot grote vierkante Petri-schalen, en een capaciteit van 4 borden elk. Sluit de vierkante borden with Parafilm. Merk op dat de platen niet volledig vastgesteld, en daardoor de gel is zeer kwetsbaar. Zorg ervoor dat u niet om de gel te breken bij het hanteren van de platen. Plaats alle vierkante borden in de incubator. </li></ol> 4. Selectie van getransformeerde kolonies <ol><li> Kolonies moeten verschijnen na 10 tot 21 dagen op de transformatie platen, maar niet op de mock getransformeerd platen. Op te halen kolonies een 200 ul pipet te gebruiken met cut-off tips. Selecteer gewoon gratis kolonies en zuigen het groene kolonie. Zorg ervoor dat u alle cellen van naburige kolonies op te nemen. </li><li> Breng de cellen 2 ml vloeibaar medium bevatten de selectie, in een 24 wells plaat. Bij gebruik Nourseothricin gebruikt 1,75 mg / ml. Meng door en neer te pipetteren. Kies 24-50 kolonies per transformatie. Sluit de platen met parafilm en transfer naar de incubator. </li><li> Na een week overdracht 100 pi van elk putje 2 ml verse ASW met selectie in een 24 wells plaat en groeien op een additionaliteitsdebatl 7 dagen. Overlevende cellijnen worden gebruikt voor verdere studies. Stabiele integratie in het genoom en insertie nummer moet worden geanalyseerd met PCR en Southern blot. Genomisch DNA kan worden verkregen voor deze doeleinden gebruik van een down-schaal standaardmethode voor het planten DNA-extractie. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Cellen verdeeld honderdste een dichtheid van 25 miljoen cellen per milliliter na het kweken gedurende 7 dagen. Elektroporatie van cellen met de gewenste instellingen resulteerde in een tijdconstante tussen 10 en 14 milliseconden. Wanneer cellen worden overgebracht naar medium in kweekflessen moet een bolletje cellen vormen. Bij het licht geschud na een uur, moeten de cellen goed kunnen mengen. Opneming van 1 ml getransformeerde cellen in 0,2% agar LMP moet resulteren in een consistente maar halfvaste gel. Kolonies moeten verschijnen na 10 tot 21 dagen. Wanneer transformerende 5 ug gelineariseerde DNA met de bovenstaande protocol 50-100 kolonies per transformatieplaat werden meestal verwacht, ten opzichte van niets op de negatieve controle platen. Ongeveer 80% van kolonies werden opgepikt positief geselecteerd resistentie in een vloeibaar medium en werden gebruikt voor verdere studies. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Eindconcentratie </td><td> Stock oplossing </td><td> Volume voor 1 liter </td></tr><tr><td> NaNO 3 </td><td> 8,83 x 10 -4 M </td><td> 75 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> NH4CI </td><td> 3,63 x 10 -5 M </td><td> 2,68 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> β-glycerofosfaat </td><td> 1 x 10 ~ 5 M </td><td> 2,16 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> H 2 3 SeO </td><td> 1 x 10 ~ 8 M </td><td> 1,29 mg / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Tris-base (pH 7,2) </td><td> 1 x 10 -3 M </td><td> 121,1 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> K trace oplossing van het metaal </td><td></td><td> Tabel 2 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> f / 2 vitamine oplossing </td><td></td><td> Tabel 3 </td><td> 0,5 ml </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Medium bestanddelen voor de groei van O. tauri 11, 12. maken tot een totaal volume van 1 liter kunstmatig zeewater een saliniteit van 30 ppt, en voeg de hierboven beschreven onderdelen van voorraadoplossingen aangegeven. Filter-steriliseren op de middellange en gebruik binnen een week. Voorraden van alle verbindingen met uitzondering van de vitamine oplossing wordt samengevoegd tot 6 ml van deze oplossing toegevoegd per liter medium. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Eindconcentratie </td><td> Stock oplossing </td><td> Hoeveelheid voor 1 liter </td></tr><tr><td> Na 2 </sub&gt; EDTA • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 -4 M </td><td></td><td> 41,6 g </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td> 1 x 10 ~ 5 M </td><td></td><td> 3,15 g </td></tr><tr><td> Na 2 MoO 4 • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 ~ 8 M </td><td> 6,3 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td> 1 x 10 9 M </td><td> 22,0 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6H 2 O </td><td> 1 x 10 9 M </td><td> 10,0 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> MnCl2 • 4H 2 O </td><td> 1 x 10 ~ 8 M </td><td> 180,0 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td> 1 x 10 ~ 8 M </td><td> 9,8 g / L dH <sub&gt; 2 O </td><td> 1 ml </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Trace oplossing van het metaal 11,12. Vul aan tot een totaal van 1 liter, in dH 2 O, en warmte op te lossen. Aliquot de oplossing en bevriezen voor opslag. Final concentraties hebben betrekking op het uiteindelijke medium, niet het spoor oplossing van het metaal. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Eindconcentratie </td><td> Stock oplossing </td><td> Hoeveelheid voor 1 liter </td></tr><tr><td> Vitamine B 12 </td><td> 1 x 10 10 M </td><td> 1 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Biotine </td><td> 1 x 10 9 M </td><td> 0,1 g / L dH 2 O </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> Thiamine • HCl </td><td> 1 x 10 -7 M </td><td></td><td> 200 mg </td></tr></tbody></table> Tabel 3. f / 2vitamine oplossing 11. aan tot een totaal van 1 liter in dH 2 O, filter-steriliseren, hoeveelheid en vries. Eindconcentraties betrekking op het uiteindelijke medium, niet de vitamine oplossing. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig1.jpg" /> Figuur 1. Grafisch overzicht van de transformatie procedure. Schematische weergave van de procedure om genetisch Ostreococcus Tauri te transformeren door middel van elektroporatie. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig2.jpg" /> Figuur 2. Cultuur groei. Cellen zijn sub-gekweekt aseptisch in een verdunning van 1/100 in zoet ASW om de 7 dagen en geteeld onder constant licht in een groei van de plant incubator uitgerust met Moonlight Blue filter. De lichtintensiteit gelijk zou zijn aan 20 umol m -2 s -1 en temperatuur op 20 ° C cellen niet constant roeren vereisen, maar ishaken om de 2 of 3 dagen om aggregatie te voorkomen. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig3.jpg" /> Figuur 3. Colony formatie op 0,2% LMP agarose. Transfer 4 borden een groot plein petrischaal en afdichting met parafilm (links boven). Wanneer kolonies zijn gevormd, selecteert u gewoon gratis (bij voorkeur conisch gevormde) kolonies (rechtsboven) en zuigen ze uit de plaat met een P200 pipet. Er mogen geen kolonies op de negatieve controle (rechtsonder).

<ol>
	<li>Derelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+analysis+of+the+smallest+free-living+eukaryote+Ostreococcus+tauri+unveils+many+unique+features.">Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).</li><li>Henderson, G. P., Gan, L., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+ultrastructure+of+O.+tauri:+electron+cryotomography+of+an+entire+eukaryotic+cell.">3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell.</a> PLoS One. 2, e749 (2007).</li><li>O'Neill, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+persist+without+transcription+in+a+eukaryote.">Circadian rhythms persist without transcription in a eukaryote.</a> Nature. 469, 554-558 (2011).</li><li>van Ooijen, G., Dixon, L. E., Troein, C., Millar, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+function+is+required+for+biological+timing+throughout+the+twenty-four+hour+cycle.">Proteasome function is required for biological timing throughout the twenty-four hour cycle.</a> Curr. Biol. 21, 869-875 (2011).</li><li>Troein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+light+inputs+to+a+simple+clock+circuit+allow+complex+biological+rhythms.">Multiple light inputs to a simple clock circuit allow complex biological rhythms.</a> Plant. J. 66, 375-385 (2011).</li><li>Corellou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clocks+in+the+green+lineage:+comparative+functional+analysis+of+the+circadian+architecture+of+the+picoeukaryote+ostreococcus.">Clocks in the green lineage: comparative functional analysis of the circadian architecture of the picoeukaryote ostreococcus.</a> Plant Cell. 21, 3436-3449 (2009).</li><li>O'Neill, J. S., Reddy, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+clocks+in+human+red+blood+cells.">Circadian clocks in human red blood cells.</a> Nature. 469, 498-503 (2011).</li><li>Monnier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrated+transcription+of+biological+processes+in+the+marine+picoeukaryote+Ostreococcus+exposed+to+light/dark+cycles.">Orchestrated transcription of biological processes in the marine picoeukaryote Ostreococcus exposed to light/dark cycles.</a> B.M.C. Genomics. 11, 192 (2010).</li><li>Le Bihan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+proteomic+analysis+of+the+unicellular+alga+Ostreococcus+tauri.">Shotgun proteomic analysis of the unicellular alga Ostreococcus tauri.</a> J. Proteomics. 74, 2060-2070 (2011).</li><li>Corellou, F., Bouget, F. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+polypeptides+from+the+nuclear+genome+of+Ostreococcus+sp.">Expression of polypeptides from the nuclear genome of Ostreococcus sp.</a> US application patent. , (2010).</li><li>Guillard, R. R. L., Ryther, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+marine+planktonic+diatoms.+I.+Cyclotella+nana+Hustedt,+and+Detonula+confervacea+(cleve)+Gran.">Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran.</a> Can. J. Microbiol. 8, 229-239 (1962).</li><li>Keller, M. D., Selvin, R. C., Claus, W., Guillard, R. R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media+for+the+culture+of+oceanic+ultraphytoplankton.">Media for the culture of oceanic ultraphytoplankton.</a> J. Phycol. 23, 633-638 (1987).</li><li>Djouani-Tari, e. l. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phosphate-regulated+promoter+for+fine-tuned+and+reversible+overexpression+in+Ostreococcus:+Application+to+circadian+clock+functional+analysis.">A phosphate-regulated promoter for fine-tuned and reversible overexpression in Ostreococcus: Application to circadian clock functional analysis.</a> PLoS One. 6, e28471 (2011).</li><li>Moulager, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+light+signals+by+the+retinoblastoma+pathway+in+the+control+of+S+phase+entry+in+the+picophytoplanktonic+cell+Ostreococcus.">Integration of light signals by the retinoblastoma pathway in the control of S phase entry in the picophytoplanktonic cell Ostreococcus.</a> PLoS. Genet. 6, e1000957 (2010).</li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Cellulaire staat en cultuur axeny is van cruciaal belang voor de transformatie procedure. Hoewel cellen worden meestal onderhouden in cycli van 12 uur licht en werden 12 uur donker, efficiëntie van de omzetting in cellen gekweekt onder deze omstandigheden onvoldoende blijken te zijn. Tijdens de herhaalde pellets / resuspensie stappen moeten cellen altijd gemakkelijk mengen. Als cellen aggregaat, of een slijm-achtige substantie aanwezig is, is het beter om de procedure opnieuw te beginnen vanaf het begin. Meestal kan ~ 50 kolonies worden verwacht op elke transformatie plaat, ten opzichte van niets op de negatieve controle plaat. Bij lage efficiëntie van de omzetting dient teeltomstandigheden worden gevarieerd om cellen in de optimale stand. Variabelen die transformatie efficiëntie beïnvloeden, zijn onder de omgevingstemperatuur in het laboratorium (moet in de buurt van 20 ° C zijn) en de behandeling snelheid (Procedure van pelleteren cellen [2,3] naar herstel [2,7] moet ~ 1 uur duren). Het is ook belangrijk dat oplossingen eenre gemaakt vers voor elke transformatie. Voor opname in platen, de concentratie van LMP agarose essentieel. Ostreococcus cellen groeien niet in hoge concentraties agarose, en diffunderen in lage concentraties. Drie transformatievectoren voor Ostreococcus zijn eerder gepubliceerd 6, en nog veel meer vectoren zullen naar verwachting worden gegenereerd en binnenkort gepubliceerd. De bestaande vector Pot-Luc 6 maakt het gebruik van een promotor naar keuze in combinatie met een C-terminale vuurvlieg luciferase-tag waardoor een snellere transgene lijn selectie plus handelbaar expressie patronen, terwijl de Potox vector 6 draagt ​​de sterke induceerbare 13 promotor uit de Ostreococcus hoge affiniteit fosfaat Transporteur (HAPT) gen voor overexpressie van het gen van belang. De Potox-Luc vector afgeleid van Potox, die een extra luciferase marker kan worden gebruikt voor indirecte selectie van lijnen overexpressie <sup&gt; 14. Succesvolle selectie markers op deze vectoren zijn Nourseothricin en G148. Echter Ostreococcus cellen zeer goed bestand tegen verschillende antibiotica en de concentraties van verbindingen die nodig zijn voor selectie van transgene Ostreococcus cellen hoger dan bij conventionele modelsysteem (2 mg / ml). Hoewel de werkwijze weergegeven inefficiënt het grote aantal cellen en plasmide DNA nodig voor deze werkwijze vormt geen significante hindernis. Een grotere beperking is dat elke opgewekte lijn die bestand is tegen de selecteerbare marker dient te worden geanalyseerd om te controleren of de gehele constructie is geïntegreerd in de DNA. Wij hebben opgemerkt voorbeelden waarin succesvolle expressie van de selecteerbare marker niet overeen met het inbrengen van het genproduct van interesse, dat wil zeggen gedeeltelijke integratie optreden. Blijkbaar willekeurige integratie in het genoom betekent ook dat er geen beperking van de insteekopening deze methode en methoden bebaseerd op homologe recombinatie worden momenteel ontwikkeld. Echter, de hier beschreven methode is, naar ons beste weten, momenteel de enige gekenmerkt methode om genetisch gemodificeerde Ostreococcus cellen te genereren. Als Ostreococcus Tauri is pas sinds kort gebruikt als experimenteel model organisme, de meeste methoden het werken met deze cellen voor verandering vatbaar is en verfijnd worden door de groeiende betrokken onderzoeksgemeenschap. Dit protocol is bedoeld om mensen te helpen werk te starten met Ostreococcus, maar op geen enkele wijze beweert te beschrijven alles wat er te weten valt over genomische transformatie van deze microalga. De auteurs vertrouwen dat lezers in staat zijn om dit protocol aan te passen aan hun eigen behoeften als kleine verschillen in de incubators (licht of kwaliteit) en andere parameters zal bestaan ​​en waarschijnlijk geoptimaliseerd moeten worden in ieder afzonderlijk laboratorium naar de gezonde culturen die nodig zijn voor deze te verkrijgen protocol. Na het beheersen van de technieken die hier beschreven,vectoren kunnen worden geconstrueerd luminescerende, fluorescent of andere gelabeld fusie lijnen onder besturing van een aantal promotoren genereren. Deze spannende roman experimenteel platform zal nuttig zijn om te onderzoeken hoe ingewikkelde biochemische problemen worden opgelost in een eukaryoot van verminderde complexiteit, waarbij farmacologische benaderingen zeer vergemakkelijkt worden 3.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Medium bestanddelen </td></tr><tr><td> Chemisch </td><td colspan="2" > Catalogusnummer </td><td> Leverancier </td></tr><tr><td> Instant Ocean Marine Salt </td><td colspan="3"> van <a href="http://amazon.co.uk" target="_blank">amazon.co.uk</a> of <a href="http://rocketaquatics.co.uk" target="_blank">rocketaquatics.co.uk</a> </td></tr><tr><td> NaNO 3 </td><td colspan="2"> S5506-250G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> NH4CI </td><td colspan="2"> A9434-500G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Glycerol 2-fosfaat dinatriumzout hydrateren </td><td colspan="2"> G9422-100G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> H 2 3 SeO </td><td colspan="2"> 84920-250G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Ultra zuiver tris </td><td colspan="2"> 15504-020 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Na 2 EDTA • 2H 2 O </td><td colspan="2"> BPE120-500G </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 157740 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Na 2 MoO 4 • 2H 2 O </td><td colspan="2"> 31439-100G-R </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td colspan="2"> Z0251 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 31277 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> MnCl2 • 4H 2 O </td><td colspan="2"> 203734-5G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td colspan="2"> C8027 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Vitamine B 12 (cyanocobalamine) </td><td colspan="2"> V2876 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Biotine </td><td colspan="2"> 47868 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Thiamine • HCl </td><td colspan="2"> T4625 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Ampicilline </td><td colspan="2"> A9518-25G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Neomycine </td><td colspan="2"> N6386 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Kanamycine </td><td colspan="2"> K4000 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td colspan="4"> Verbruiksartikelen voor het kweken van </td></tr><tr><td colspan="2"> Item </td><td> Catalogusnummer </td><td> Leverancier </td></tr><tr><td colspan="2"> Tissue Culture Flask T25 suspensieculturen ontlucht te worden met Gieten Channel </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Tissue Culture Flask T75 suspensieculturen ontlucht te worden met Gieten Channel </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Tissue Culture Flask T175 suspensieculturen ontlucht te worden met Gieten Channel </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP Fles top filters, 1L, compleet </td><td> 99950T </td><td> Helena bio- </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP Fles top filters, 500 ml, </td><td> 99500T </td><td> Helena bio- </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP Fles top filters, 250ml, </td><td> 99250T </td><td> Helena bio- </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP Fles top filters, 150ml, </td><td> 99150T </td><td> Helena bio- </td></tr><tr><td colspan="2"> Zoutgehalte Meter voor Marine Aquarium </td><td> DSG-10 </td><td> Daeyoon </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="3" > Chemische producten voor de transformatie </td></tr><tr><td> Chemisch </td><td> Catalogusaantal </td><td> Leverancier </td></tr><tr><td> D-sorbitol </td><td> S6021-1KG </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Pluronic F-68 oplossing </td><td> P5556-100ML </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> ClonNat </td><td> 51000 </td><td> Werner </td></tr><tr><td> Laag smeltpunt agarose </td><td> 16520-050 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td colspan="3"> Verbruiksartikelen voor transformatie </td></tr><tr><td> Item </td><td> Catalogusnummer </td><td> Leverancier </td></tr><tr><td> Tissue Culture Flask T25 suspensieculturen ontlucht te worden met Gieten Channel </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Tissue Culture Flask T75 suspensieculturen ontlucht te worden met Gieten Channel </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures ontlucht te worden met Gieten Channel </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Greiner centrifugebuizen 50ml </td><td> 227261 </td><td> GBO </td></tr><tr><td> Gene Puiser / MicroPulser cuvetten, 0,2 cm afstand, 50 </td><td> 165-2086 </td><td> Bio-Rad </td></tr><tr><td> Petrischaal ronde PS 3 VENTS H14.2 Φ55 </td><td> 391-0895 </td><td> VWR International </td></tr><tr><td> Petrischaal vierkant met vier openingen polystyreen steriele door bestraling duidelijke 120mm </td><td> FB51788 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Moonlight Blue lichtfilter </td><td> 183 </td><td> Lee Verlichting </td></tr></tbody></table>

genomic transformation of the picoeukaryote ostreococcus tauri

Veel voorkomende problemen belemmeren een snelle vooruitgang in de Plant Sciences zijn cellulair, weefsel en hele organisme complexiteit, en met name het hoge niveau van genomische redundantie die simpele genetica in hogere planten. De nieuwe modelorganisme Ostreococcus tauri de kleinste vrijlevende eukaryote tot dusver bekend, en heeft een sterk verminderde genoomgrootte en cellulaire complexiteit 1,2, blijkt uit de aanwezigheid van slechts een van de organellen (mitochondrion, chloroplast, Golgi stack) per cel en een genoom dat alleen ~ 8000 genen. Bovendien is de combinatie van unicellularity gemakkelijk cultuur een platform vatbaar chemische biologie benaderingen. Onlangs heeft Ostreococcus met succes gebruikt om fundamentele mechanismen ten grondslag liggen aan circadiane tijdwaarneming 3-6 te bestuderen. De resultaten van dit model organisme zijn niet alleen gevolgen voor planten wetenschap, maar ook zoogdieren biologie 7. Dit voorbeeld maakt hoe snel experimenten in eeneenvoudige eukaryoot van de groene lijn kan versnellen onderzoek in meer complexe organismen door het genereren van toetsbare hypothesen met behulp van methoden technisch mogelijk alleen in de achtergrond van de verminderde complexiteit. Kennis van een genoom en de mogelijkheid om genen te passen essentiële elementen zijn in een model soort. Genomic 1, transcriptoom 8 en 9 Proteoom informatie voor deze soort is vrij beschikbaar, terwijl de eerder gemelde 6,10 methoden om genetisch te transformeren Ostreococcus is bekend dat ze enkele laboratoria overal ter wereld. In dit artikel, de proefmethoden genetisch transformeren deze nieuwe modelorganisme overexpressie construeren door middel van elektroporatie worden beschreven in detail, alsmede de wijze van toevoeging van getransformeerde cellen bij lage percentage agarose om selectie van getransformeerde lijnen afkomstig van een een getransformeerde cel. Na de succesvolle toepassing van Ostreococcus naar circadiane onderzoek kan groeiende belangstelling voor Ostreococcus worden verwacht van diverse onderzoeksgebieden binnen en buiten Plant Sciences, met inbegrip van biotechnologische gebieden. Onderzoekers van een breed scala aan biologische en medische wetenschappen die werken aan geconserveerde biochemische pathways kunnen overwegen bezighouden met onderzoek in Ostreococcus, vrij van de genomische en organismaal de complexiteit van groter model soorten.

Watch this Scientific Journal Video about Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri at JoVE.com

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Dit artikel beschrijft genetische transformatie van de eencellige mariene algen<em&gt; Ostreococcus Tauri</em&gt; Door elektroporatie. Dit eukaryote organisme is een effectief model platform voor hogere planten, het bezitten van veel minder genomische en cellulaire complexiteit en zijn gemakkelijk vatbaar is voor zowel de celkweek en chemische biologie.

Genomic Transformatie van de Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus Tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

genomic-transformation-of-the-picoeukaryote-ostreococcus-tauri

Research

JoVE Journal

Biology

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolatie van Genomic DNA van muis Tails

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

Grote Plaats Milieu Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Genereren van RNA / DNA-Hybriden in Genomic DNA door omzetting door middel RNA-bevattende Oligonucleotiden

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

Genomische MRI - een openbare hulpbron voor het bestuderen van Sequence patronen binnen Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Concurrerende Genomische Schermen van streepjescode Gist Bibliotheken

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Selectieve vangen van 5-hydroxymethylcytosine van genomisch DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

Array comparative genomic hybridisatie (Array CGH) voor detectie van genomische kopij Varianten

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Versterking, next-generation sequencing en Genomic DNA in kaart brengen van retrovirale integratie Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

Gerichte RNA Sequencing Assay Gene Expression en Genomic Wijzigingen karakteriseren

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

Embryo's van Culex-muggen voorbereiden en injecteren om null-mutaties te genereren met CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...