Name: genomic transformation of the picoeukaryote ostreococcus tauri
Uploaded: 2012-07-13T13:00:00
Duration: 10 min 45 s
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SynthSys un Centre de biologie intégrative des systèmes financés par le BBSRC et d&#39;attribution EPSRC D019621. EU FP6 réseau d&#39;excellence &quot;Marine Genomics&quot; subvention à FYB a financé le développement de méthodes de transformation génétique.

1. Préparation du matériel d&#39;algues <ol><li> Cellules sont cultivées dans Ostreococcus eau de mer artificielle (ASW). Sels de la Mer (généralement environ 40 grammes par litre) sont dissous dans l&#39;eau déminéralisée à une salinité de 30 ppt, tel que mesuré à l&#39;aide d&#39;un mètre de la salinité. 11,12 milieu d&#39;enrichissement, éléments traces métalliques et des vitamines sont ajoutées, comme décrit dans les tableaux 1-3. Les médias est alors stérilisé par filtration à travers un filtre de 0,22 um. </li><li> Pour l&#39;entretien, les cellules de la souche Ostreococcus OTTH95 sont sous-cultivées aseptiquement à une dilution de 1/100 en eau douce ASW tous les 7 jours et a grandi sous la lumière constante dans la croissance des plantes incubateur muni d&#39;Moonlight filtre bleu. L&#39;intensité lumineuse doit être proche de 20 pmoles m -2 s -1 et de la température est maintenue à 20 ° C. Les cellules n&#39;ont pas besoin d&#39;une agitation constante, mais sont secoués une fois tous les 2 à 3 jours pour empêcher l&#39;agrégation. </li><li> Pour chaque transformation, 50 ml de cellules sont nécessaires à une cellule density de 20-30 x 10 6 ml -1, ce qui devrait être atteint 5-7 jours après le repiquage. La densité cellulaire approximative et axeny peut être déterminée en utilisant la cytométrie de flux ou l&#39;autre ou un hémocytomètre à un minimum de grossissement x40. </li></ol> 2. L&#39;électroporation <ol><li> Préparer l&#39;ADN pour la transformation. Pour chaque transformation, 5 pg de pur, d&#39;ADN plasmidique linéarisé est nécessaire à une concentration de 1 pg / pi dans l&#39;eau dé-ionisée. Pour obtenir cet ADN, les auteurs recommandent d&#39;utiliser un kit Qiagen midi de préparation, même si d&#39;autres méthodes pourraient tout aussi bien fonctionner. Digérer le produit avec une enzyme qui coupe dans le squelette du vecteur utilisé, mais pas dans le transgène ou un gène de sélection. En outre purifier et concentrer l&#39;ADN résultant par précipitation à l&#39;éthanol linéaire, et remettre en suspension le produit dans le volume approprié de haute qualité d&#39;eau dé-ionisée. </li><li> Préparer des microtubes contenant 5 ug d&#39;ADN pour chaque transformation. Une control sans ADN est nécessaire pour chaque lignée cellulaire pour être transformé. Maintenir ces tubes sur de la glace, avec une cuvette d&#39;électroporation 2 mm pour chaque transformation. </li><li> Préparer 2,2 ml de tampon de resuspension par la transformation. Dissoudre sorbitol à une solution 1 M dans le trou DDH 2 O, ajouter 0,1% d&#39;acide pluronique F68 et filtre-stériliser. </li><li> Ajouter de l&#39;acide pluronic F68, à une concentration finale de 0,1% à des cellules, et les granulés pendant 10 minutes à 8000X g à 10 ° C dans un tube de 50 ml à fond conique. Immédiatement remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon de resuspension par aspiration et refoulement, et de transférer dans un microtube. Centrifuger pendant 10 minutes à 8000 xg à 10 ° C, et de travailler rapidement, répétez cette étape de lavage une fois de plus. </li><li> Avec une pointe de coupe, remise en suspension chaque culot final dans 40 ul de tampon de resuspension. Ajouter 40 ul des cellules remises en suspension dans chaque tube de l&#39;ADN linéarisé sur la glace, mélanger délicatement et transférer à la cuvette d&#39;électroporation. </li><li> Mettez la cuvette dans le electropMachine oraison. Modifiez les paramètres à 6 kV cm -1, 600 Ω, et 25 uF. Électroporer des cellules. </li><li> Incuber les cellules electoporated dans les cuvettes à température ambiante pendant 10 minutes, et utiliser ce temps pour préparer les flacons de culture tissulaire. Les étiqueter et ajouter 30 ml de frais à chaque ASW. Prélever 1 ml de chaque flacon et doucement l&#39;ajouter à la cuve correspondante. Incuber pendant 2 minutes et retirez délicatement la ASW, qui contient maintenant le globule de cellules et doucement et lentement pipeter directement dans le ASW dans le flacon de culture. </li><li> Les cellules restent généralement dans un globule. Prenez soin de ne pas secouer ou de déranger les cellules agrégées en ce moment. Laisser les cellules de récupérer dans l&#39;incubateur pendant 1-2 heures, puis remise en suspension en agitant les flacons. A cette époque, les cellules doivent remettre en suspension librement et sans grumeaux doit être visible. Laissez les cultures afin de récupérer la nuit dans l&#39;incubateur. </li></ol> 3. L&#39;inclusion de cellules sur des plaques dans milieu semi-solide <ol><li&gt; Le lendemain, à l&#39;autoclave une solution de 2,1% d&#39;agarose à faible point de fusion dans le trou DDH 2 O dans un flacon contenant un barreau d&#39;agitation. Garder fondu à 65-90 ° C dans une plus grande bécher contenant de l&#39;eau sur un agitateur magnétique chauffant. Pour chaque transformation de préparer des boîtes de Pétri (8 55 mm de diamètre) et 8 tubes de 15 ml contenant chacun 9 ml de ASW, plus la sélection requise. Si vous utilisez nourseothricine ou G418, utilisez 2 mg / ml. </li><li> Recueillir les cellules transformées de l&#39;incubateur. Travailler dans un Flowhood stérile, ajouter 1 ml d&#39;eau bouillante agarose LMP à la 9 ml dans l&#39;un des tubes. Fermer le tube, et mélanger en inversant. Ajoutez ensuite 0,5 ml de cellules fraîchement transformées, mélanger rapidement et verser dans la plaque. Répétez cette procédure avec les 7 autres tubes et ensuite dans le ballon de transformation suivante. </li><li> Laisser les plaques d&#39;ouvrir dans la hotte à flux pendant une heure, pour l&#39;agarose à définir. Ensuite, fermez les plaques et les transférer à grands carrés des boîtes de Pétri, qui détiennent 4 plaques chacun. Sceller l&#39;esprit carré plaquesh parafilm. Notez que les plaques ne seront pas entièrement fixé, et, par conséquent, le gel est très fragile. Il faut prendre soin de ne pas briser le gel lors de la manipulation des plaques. Placez tous les assiettes carrées dans l&#39;incubateur. </li></ol> 4. Sélection des colonies transformées <ol><li> Colonies devrait apparaître au bout de 10 à 21 jours sur les plaques de transformation, mais pas sur les plaques des simulacres transformées. Pour prélever des colonies utiliser une pipette 200 pi avec coupure conseils. Il suffit de sélectionner les colonies libres et aspirer la colonie verte. Prenez soin de ne pas inclure toutes les cellules de colonies voisines. </li><li> Transférer les cellules à 2 ml de milieu liquide contenant la sélection, dans une plaque de 24 puits. Lorsque vous utilisez nourseothricine, utilisez 1,75 mg / ml. Mélanger en pipetant. Sélectionnez 24-50 colonies par la transformation. Sceller les plaques avec du parafilm et transfert à l&#39;incubateur. </li><li> Après une semaine, transférer 100 ul de chaque puits à 2 ml frais ASW avec sélection dans une plaque de 24 puits et de grandir pour une additional 7 jours. Lignées de cellules survivantes peuvent être utilisés pour des études ultérieures. Stabilité de l&#39;intégration du génome du nombre et de l&#39;insertion doivent être analysés en utilisant la PCR et Southern Blot. L&#39;ADN génomique peut être obtenu à ces fins en utilisant n&#39;importe quelle méthode bas-échelle standard pour l&#39;extraction d&#39;ADN des plantes. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Fractionner les cellules 1/100 a atteint une densité de 25 millions de cellules par millilitre après avoir progressé pendant 7 jours. Électroporation des cellules avec les paramètres appropriés entraîné dans un entre 10 et 14 millisecondes constante de temps. Lorsque les cellules sont transférées dans un milieu en flacons de culture, un globule de cellules doit se former. Lorsque légèrement secoué après une heure, les cellules devraient facilement remettre en suspension. L&#39;inclusion de 1 ml de cellules transformées en agar LMP 0,2% devrait se traduire d&#39;une manière cohérente, mais seulement un gel semi-solide. Colonies devrait apparaître au bout de 10 à 21 jours. Lors de la transformation 5 ug d&#39;ADN linéarisé en utilisant le protocole ci-dessus, 50-100 colonies par la transformationplaque ont été généralement prévu, contre aucun sur les plaques de contrôle négatif. ~ 80% des colonies ont été cueillies sélectionné de façon positive par la résistance aux antibiotiques en milieu liquide et ont été utilisés dans des études ultérieures. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> La concentration finale </td><td> Solution mère </td><td> Volume pour 1 litre </td></tr><tr><td> NaNO 3 </td><td> 8,83 x 10 -4 M </td><td> 75 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td> 3,63 x 10 -5 M </td><td> 2,68 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> β-glycérophosphate </td><td> 1 x 10 -5 M </td><td> 2,16 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> H 2 SeO 3 </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 1,29 mg / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Tris-base forte (pH 7,2) </td><td> 1 x 10 -3 M </td><td> 121,1 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Solution K métaux-traces </td><td></td><td> Tableau 2 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> f / 2 solution de vitamines </td><td></td><td> Tableau 3 </td><td> 0,5 ml </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Constituants du milieu pour la croissance de O. tauri 11, 12. Faire un volume total de 1 litre d&#39;eau de mer artificielle à une salinité de 30 ppt, et ajouter les composants ci-dessus à partir de solutions mères comme indiqué. Filtrez-stériliser le milieu et l&#39;utilisation dans une semaine. Les stocks de tous les composés à l&#39;exception de la solution de vitamine A peut être mis en commun pour ajouter 6 ml de cette solution pour chaque litre de milieu. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> La concentration finale </td><td> Solution mère </td><td> Montant pour 1 litre </td></tr><tr><td> Na 2 </sub&gt; EDTA • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 -4 M </td><td></td><td> 41,6 g </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td> 1 x 10 -5 M </td><td></td><td> 3,15 g </td></tr><tr><td> Na 2 MoO 4 • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 6,3 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> ZnSO 4 .7 H 2 O • </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 22,0 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6H 2 O </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 10,0 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 180,0 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> CuSO 4 .5 H 2 O • </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 9,8 g / L dH <sub&gt; 2 O </td><td> 1 ml </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Tracer une solution métallique 11,12. Maquillage pour un total de 1 litre, en DH 2 O, et chauffer pour dissoudre. Aliquoter la solution et le gel pour le stockage. Les concentrations finales indiquées se rapportent à la moyenne finale, pas la solution des métaux traces. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> La concentration finale </td><td> Solution mère </td><td> Montant pour 1 litre </td></tr><tr><td> La vitamine B 12 </td><td> 1 x 10 -10 M </td><td> 1 g / l dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> La biotine </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 0,1 g / L dH 2 O </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Thiamine • HCl </td><td> 1 x 10 -7 M </td><td></td><td> 200 mg </td></tr></tbody></table> Tableau 3. f / 2solution de vitamines 11. Maquillage pour un total de 1 litre en dH 2 O, le filtre-stériliser, aliquoter et congeler. Les concentrations finales indiquées se rapportent à la moyenne finale, pas la solution la vitamine. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig1.jpg" /> Figure 1. Présentation graphique de la procédure de transformation. Représentation schématique de la procédure à transformer génétiquement Ostreococcus tauri par électroporation. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig2.jpg" /> Figure 2. La croissance des cellules de la culture. Sont sous-cultivées aseptiquement à une dilution de 1/100 en eau douce ASW tous les 7 jours et a grandi sous la lumière constante dans la croissance des plantes incubateur muni d&#39;Moonlight filtre bleu. L&#39;intensité lumineuse doit être proche de 20 pmoles m -2 s -1 et de la température est maintenue à 20 ° C Cellules ne nécessitent pas une agitation constante, mais ils sont sHaken une fois tous les 2 à 3 jours pour empêcher l&#39;agrégation. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig3.jpg" /> Figure 3. La formation de colonies sur les 0,2% d&#39;agarose LMP. Transfert 4 plaques à une boîte de Pétri grand carré, et le joint avec du parafilm (en haut à gauche). Lorsque les colonies se sont formées, il suffit de sélectionner libres (idéalement de forme conique) colonies (en haut à droite) et les sucer de la plaque avec une pipette P200. Il devrait y avoir aucune colonie sur le contrôle négatif (en bas à droite).

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	<li>Derelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+analysis+of+the+smallest+free-living+eukaryote+Ostreococcus+tauri+unveils+many+unique+features.">Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).</li><li>Henderson, G. P., Gan, L., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+ultrastructure+of+O.+tauri:+electron+cryotomography+of+an+entire+eukaryotic+cell.">3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell.</a> PLoS One. 2, e749 (2007).</li><li>O'Neill, J. 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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Cellulaire axeny Etat et de la culture est d&#39;une importance cruciale pour la procédure de transformation. Bien que les cellules sont généralement maintenus en cycles de 12 heures de lumière, 12 heures sombres, l&#39;efficacité de transformation dans les cellules cultivées dans ces conditions ont été jugées insuffisantes. Au cours des répétées de granulation / remise en suspension des mesures, les cellules doivent toujours remettre en suspension facilement. Si globale cellules, ou d&#39;une substance comme le mucus est présent, il est préférable de commencer la procédure depuis le début. En règle générale, environ 50 colonies on peut s&#39;attendre sur chaque plaque de transformation, par opposition à aucune sur la plaque de contrôle négatif. En cas de faible efficacité de transformation, des conditions de culture doit être modifiée afin d&#39;assurer cellules sont dans l&#39;état optimal. Les variables qui affectent l&#39;efficacité de transformation comprennent la température ambiante dans le laboratoire (qui devrait être proche de 20 ° C) et la vitesse de traitement (la procédure de centrifugation des cellules [2.3] à la reprise [2,7] devrait prendre environ 1 heure). Il est également important que toutes les solutions d&#39;unre fait frais avant chaque transformation. Pour être inclus dans des plaques, la concentration de agarose LMP est crucial. Cellules Ostreococcus ne poussent pas dans des concentrations élevées d&#39;agarose, et se diffuse dans de faibles concentrations. Trois vecteurs de transformation pour Ostreococcus ont déjà été publiés 6, et plus de vecteurs devraient être générées et publiées sous peu. Le vecteur existant Pot-Luc 6 permet l&#39;utilisation d&#39;un promoteur de choix en combinaison avec une étiquette de luciole luciférase C-terminale permettant la sélection de ligne plus rapide transgénique plus motifs d&#39;expression traitables, que le vecteur porte la Potox 6 inductible fort 13 promoteur de la prise Ostreococcus Haut Phosphate Transporter Affinity (HAPT) gène de la surexpression du gène d&#39;intérêt. Le vecteur Potox-Luc dérive de Potox, portant un marqueur luciférase supplémentaire qui peut être utilisé pour la sélection indirecte de lignes surexpression <sjusqu&#39;à&gt; 14. Marqueurs de sélection retenus sur ces vecteurs sont nourseothricine et G148. Cependant, les cellules Ostreococcus sont très résistantes à de nombreux antibiotiques, et les concentrations de composés nécessaires pour la sélection des cellules transgéniques Ostreococcus est plus élevé que pour les systèmes de modèle classique (2 mg / ml). Bien que le processus semble inefficace, le grand nombre de cellules et l&#39;ADN plasmidique nécessaire pour cette procédure ne pose aucun obstacle significatif. Un plus grand limitation est que chaque ligne générée qui est résistant à l&#39;marqueur sélectionnable doit être analysés individuellement pour vérifier que la construction entière est intégré dans l&#39;ADN. Nous avons observé des exemples dans lesquels l&#39;expression réussie du marqueur de sélection ne correspondent pas à l&#39;insertion du gène d&#39;intérêt réel; intégrations partielles peuvent se produire soit. De toute évidence, l&#39;insertion au hasard dans le génome signifie également qu&#39;il n&#39;y a pas de contrôle du site d&#39;insertion en utilisant cette méthode, et les méthodes de basé sur la recombinaison homologue sont actuellement en cours d&#39;élaboration. Cependant, la méthode décrite ici est, à notre connaissance, actuellement la seule méthode pour générer des cellules caractérisée Ostreococcus génétiquement modifiés. Comme Ostreococcus tauri a récemment été utilisé comme un organisme modèle expérimental, la plupart des méthodes de travail avec ces cellules est susceptible d&#39;évoluer et d&#39;être affiné par la communauté de recherche de plus en plus impliqués. Ce protocole est destiné à aider les gens à entreprendre des travaux avec Ostreococcus, mais ne prétend nullement à décrire tout ce qu&#39;il ya à savoir sur la transformation de la génomique cette microalgue. La confiance auteurs que les lecteurs seront en mesure d&#39;adapter ce protocole à leurs propres besoins que de petites différences dans les incubateurs (niveaux de luminosité ou de qualité) et d&#39;autres paramètres seront présentes et sans doute être optimisé dans tous les laboratoires individu d&#39;obtenir des cultures saines nécessaires à cette protocole. Après avoir maîtrisé les techniques décrites ici,vecteurs peut être construit pour générer luminescente, fluorescente ou d&#39;autres lignes de fusion étiquette sous le contrôle d&#39;une série de promoteurs. Cette plate-forme expérimentale roman passionnant sera utile d&#39;étudier comment les problèmes complexes biochimiques sont résolus dans un eucaryote de réduction de la complexité, dans laquelle les approches pharmacologiques sont hautement facilitées 3.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Constituants du milieu </td></tr><tr><td> Chimique </td><td colspan="2" > Numéro de catalogue </td><td> Fournisseur </td></tr><tr><td> Instantanée Ocean Marine sel </td><td colspan="3"> à partir <a href="http://amazon.co.uk" target="_blank">amazon.co.uk</a> ou <a href="http://rocketaquatics.co.uk" target="_blank">rocketaquatics.co.uk</a> </td></tr><tr><td> NaNO 3 </td><td colspan="2"> S5506-250G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td colspan="2"> A9434-500G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Glycérol-2-phosphate hydrate de sel disodique </td><td colspan="2"> G9422-100G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> H 2 SeO 3 </td><td colspan="2"> 84920-250G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Ultra pure tris </td><td colspan="2"> 15504-020 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Na 2 EDTA • 2H 2 O </td><td colspan="2"> BPE120-500G </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 157740 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Na 2 MoO 4 • 2H 2 O </td><td colspan="2"> 31439-100G-R </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> ZnSO 4 .7 H 2 O • </td><td colspan="2"> Z0251 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 31277 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td colspan="2"> 203734-5G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> CuSO 4 .5 H 2 O • </td><td colspan="2"> C8027 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> La vitamine B 12 (cyanocobalamine) </td><td colspan="2"> V2876 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> La biotine </td><td colspan="2"> 47868 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Thiamine • HCl </td><td colspan="2"> T4625 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Ampicilline </td><td colspan="2"> A9518-25G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Néomycine </td><td colspan="2"> N6386 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Kanamycine </td><td colspan="2"> K4000 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td colspan="4"> Consommables pour la culture </td></tr><tr><td colspan="2"> Point </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Fournisseur </td></tr><tr><td colspan="2"> Culture de tissus cultures Flacon de suspension T25 ventilé avec Verser Manche </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Culture de tissus cultures Flacon de suspension T75 ventilé avec Verser Manche </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Culture de tissus cultures Flacon de suspension T175 ventilé avec Verser Manche </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Filtres digitaux TPP, 1L, complets </td><td> 99950T </td><td> Bioscience Helena </td></tr><tr><td colspan="2"> Filtres bouteilles TPP top, 500ml, </td><td> 99500T </td><td> Bioscience Helena </td></tr><tr><td colspan="2"> Filtres digitaux TPP, 250ml, </td><td> 99250T </td><td> Bioscience Helena </td></tr><tr><td colspan="2"> Filtres digitaux TPP et 150ml, </td><td> 99150T </td><td> Bioscience Helena </td></tr><tr><td colspan="2"> Compteur de salinité pour Marine Aquarium </td><td> DSG-10 </td><td> Daeyoon </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="3" > Produits chimiques pour la transformation </td></tr><tr><td> Chimique </td><td> Cataloguenombre </td><td> Fournisseur </td></tr><tr><td> D-Sorbitol </td><td> S6021-1KG </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Pluronic F-68 solution </td><td> P5556-100ML </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> ClonNat </td><td> 51000 </td><td> Werner </td></tr><tr><td> Bas point de fusion d&#39;agarose </td><td> 16520-050 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td colspan="3"> Consommables pour la transformation </td></tr><tr><td> Point </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Fournisseur </td></tr><tr><td> Culture de tissus cultures Flacon de suspension T25 ventilé avec Verser Manche </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Culture de tissus cultures Flacon de suspension T75 ventilé avec Verser Manche </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Flacon de culture tissulaire T175 Suspension Cultures ventilé avec Verser Manche </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Tubes à centrifuger 50ml Greiner </td><td> 227261 </td><td> GBO </td></tr><tr><td> Gene Pulser / MicroPulser Cuves, 0,2 cm, l&#39;écart de 50 </td><td> 165-2086 </td><td> Bio-Rad </td></tr><tr><td> Petri plat rond PS 3 VENTS H14.2 Φ55 </td><td> 391-0895 </td><td> VWR International </td></tr><tr><td> Une boîte de Pétri carrée avec quatre évents polystyrène stérile par irradiation 120mm clair </td><td> FB51788 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Moonlight Blue filtre de lumière </td><td> 183 </td><td> Lee éclairage </td></tr></tbody></table>

genomic transformation of the picoeukaryote ostreococcus tauri

Les problèmes courants qui empêchent des progrès rapides en sciences de plantes comprennent les cellules, des tissus et de la complexité organisme entier, et notamment le niveau élevé de redondance génomique touchant la génétique simples chez les plantes supérieures. Le roman organisme modèle Ostreococcus tauri est le plus petit eucaryote libre-vivant connu à ce jour, et possède une taille de génome très réduit et 1,2 complexité cellulaire, qui se manifeste par la présence d&#39;un seul de la plupart des organites (mitochondrie, chloroplaste, pile de Golgi) par cellulaire, et un génome contenant seulement de ~ 8000 gènes. En outre, la combinaison de unicellularity et de la culture facile fournit une plate-forme se prête à des approches de biologie chimique. Récemment, Ostreococcus a été employée avec succès pour étudier les mécanismes sous-jacents de base chronométrage circadien 3-6. Les résultats de cet organisme modèle ont eu un impact non seulement la science des plantes, mais aussi la biologie des mammifères 7. Cet exemple met en évidence comment l&#39;expérimentation rapide dans uneucaryote simple à partir de la lignée verte peut accélérer la recherche dans les organismes plus complexes en générant des hypothèses testables en utilisant des méthodes techniquement réalisables que dans ce contexte de complexité réduite. Connaissance d&#39;un génome et la possibilité de modifier les gènes sont des outils essentiels dans toutes les espèces modèles. Génomique 1, transcriptomique 8, 9 et protéomique des informations de cette espèce est disponible gratuitement, alors que les méthodes précédemment rapportés à 6,10 génétiquement transformer Ostreococcus sont connus pour quelques laboratoires à travers le monde. Dans cet article, les méthodes expérimentales pour transformer génétiquement cet organisme nouveau modèle à une surexpression de construire au moyen de l&#39;électroporation sont décrites en détail, ainsi que la méthode de l&#39;inclusion des cellules transformées en pourcentage d&#39;agarose à bas pour permettre la sélection de lignées transformées provenant d&#39;une seule cellule transformée. Suite à l&#39;application réussie de OstreocoCCU à la recherche du rythme circadien, un intérêt croissant pour Ostreococcus On peut s&#39;attendre à des domaines de recherche différents dans et en dehors des sciences végétales, y compris les zones biotechnologiques. Les chercheurs d&#39;un large éventail de sciences biologiques et médicales qui travaillent sur ​​les voies biochimiques conservés peut considérer la recherche poursuit dans Ostreococcus, exempt de la complexité génomique et organismique d&#39;espèces modèles plus grands.

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Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Cet article décrit la transformation génétique de l&#39;algue marine unicellulaire<em&gt; Ostreococcus tauri</em&gt; Par électroporation. Cet organisme eucaryote est une plate-forme modèle efficace pour les plantes supérieures, possesing considérablement réduit la complexité génomique et cellulaire et à être prête à la culture cellulaire et biologie chimique.

Transformation génomique de la Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolement de l&#39;ADN génomique de souris Tails

Recherche

Biologie

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

Grand Insérer production bibliothèque génomique de l&#39;environnement

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Génération d&#39;ADN / ARN hybrides d&#39;ADN génomique par la transformation en utilisant l&#39;ARN contenant Oligonucléotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

Genomic IRM - une ressource publique pour l&#39;étude des schémas de séquence dans l&#39;ADN génomique

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Écrans concurrentiel des bibliothèques génomiques de levure Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Capture d&#39;sélectif de 5-hydroxyméthylcytosine partir de l&#39;ADN génomique

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

Tableau hybridation génomique comparative (CGH array) pour la détection des variantes génomiques du nombre de copies

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Séquençage de nouvelle génération, et l&#39;ADN génomique Cartographie des rétrovirales Sites d&#39;intégration

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

Ciblées ARN Séquençage Assay pour caractériser l&#39;expression génique et génomique Transformations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

Préparation et injection d’embryons de moustiques Culex pour générer des mutations nulles à l’aide de CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...