Name: genomic transformation of the picoeukaryote ostreococcus tauri
Uploaded: 2012-07-13T13:00:00
Duration: 10 min 45 s
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SynthSys ein Zentrum für Integrative Systems Biology von BBSRC und EPSRC Auszeichnung D019621 finanziert. EU FP6 Network of Excellence &quot;Marine Genomics&quot; Zuschuss an FYB hat die Entwicklung der genetischen Transformation Methoden finanziert.

1. Vorbereitung der Algenmaterial <ol><li> Ostreococcus Zellen werden in künstlichem Meerwasser (ASW) kultiviert. Meersalz (typischerweise etwa 40 Gramm pro Liter) in entionisiertem Wasser auf einen Salzgehalt von 30 ppt gelöst, wie unter Verwendung eines Salzgehalt Meter. Anreicherungsmedium 11,12, Spurenelemente und Vitamine Metall-Elemente hinzugefügt werden, wie in den Tabellen 1-3 beschrieben. Das Medium wird dann steril filtriert durch ein 0,22 um-Filter. </li><li> Für die Wartung sind die Zellen des Stammes Ostreococcus OTTH95 subkultiviert aseptisch in einer Verdünnung von 1/100 in frischen ASW alle 7 Tage und aufgewachsen unter konstanten Licht in einem Inkubator mit Pflanzenwachstum Moonlight Blue Filter ausgestattet. Die Lichtintensität sollte in der Nähe 20 pmol m -2 s -1 sein und die Temperatur wird bei 20 ° C gehalten Die Zellen müssen nicht ständigem Rühren, aber geschüttelt einmal alle 2 bis 3 Tagen Aggregation zu verhindern. </li><li> Für jede Transformation werden 50 ml der Zellen in einer Zelle erforderlich density von 20-30 x 10 6 ml -1, was erreicht 5-7 Tagen sollte nach Subkultivierung werden. Ungefähre Zelldichte und axeny kann unter Verwendung entweder Durchflusszytometrie oder eines Hämozytometers bei einem Minimum von x40 Vergrößerung werden. </li></ol> 2. Die Elektroporation <ol><li> Planen DNA für die Transformation. Für jede Transformation wird 5 ug der reinen, linearisierte Plasmid-DNA in einer Konzentration von 1 ug / ul in sterilem deionisiertem Wasser erforderlich. Um diese DNA zu erhalten, empfehlen die Autoren unter Verwendung eines Qiagen Midi-Prep-Kit, obwohl auch andere Methoden gleich gut funktionieren könnte. Verdau des Produkts mit einem Enzym, das in der Hauptkette des verwendeten Vektors schneidet, aber nicht in das Transgen oder Selektionsgen. Weiter zu reinigen und konzentrieren die resultierende lineare DNA durch Ethanolfällung, und resuspendieren Sie das Produkt in einem geeigneten Volumen an hochwertigen steriles entionisiertes Wasser. </li><li> Bereiten Mikrozentrifugenröhrchen mit 5 ug DNA für jede Transformation. Ein control, ohne DNA, die für jede Zelllinie transformiert werden. Bewahren Sie diese Röhrchen auf Eis, zusammen mit einem 2 mm Elektroporationsküvette für jede Transformation. </li><li> Bereiten Sie 2,2 ml pro Resuspensionspuffer Transformation. Auflösen Sorbit zu einer 1 M Lösung in ddH 2 O, fügen Sie 0,1% Pluronsäure F68 und Filter-sterilisiert werden. </li><li> In Pluronsäure F68, bis zu einer Endkonzentration von 0,1% zu den Zellen, und das Pellet sie für 10 Minuten bei 8000x g bei 10 ° C in einem 50 ml-Röhrchen mit konischem Boden. Sofort die Zellen in 1 ml Resuspensionspuffer durch Auf-und Abpipettieren und Transfer zu einem Mikrozentrifugenröhrchen. Lysat für 10 Minuten bei 8000 xg bei 10 ° C, und arbeitet schnell, wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal waschen. </li><li> Bei einem Cut Spitze, Resuspendieren jedes fertige Pellet in 40 ul Resuspensionspuffer. In 40 ul der resuspendierten Zellen in jedes Röhrchen von linearisierter DNA auf Eis, vorsichtig mischen und Transfer zum Elektroporationsküvette. </li><li> Setzen Sie die Küvette in den electropRede Maschine. Ändern Sie die Einstellungen zu 6 kV cm -1, 600 Ω und 25 uF. Die Zellen zu elektroporieren. </li><li> Inkubieren der Zellen in den electoporated Küvetten bei Raumtemperatur für 10 Minuten, und diese Zeit nutzen, um die Gewebekulturflaschen herzustellen. Beschriften Sie sie und fügen Sie 30 ml frisches ASW zu jedem. Nehmen Sie 1 ml aus jedem Kolben und fügen Sie es sanft auf die entsprechende Küvette. Inkubieren Sie für 2 Minuten und entfernen Sie vorsichtig die ASW, jetzt mit der Kugel von Zellen und langsam und vorsichtig direkt Pipette in die ASW in der Kulturflasche. </li><li> Die Zellen bleiben in der Regel in einer Kugel. Achten Sie darauf, schütteln oder stören die aggregierten Zellen in diesem Moment. Lassen Sie die Zellen in den Inkubator für 1-2 Stunden erholen, dann durch Schütteln der Kolben zu resuspendieren. Zu diesem Zeitpunkt sollten die Zellen zu resuspendieren und frei keine Klumpen sichtbar sein soll. Lassen Sie die Kulturen sich zu erholen im Inkubator über Nacht. </li></ol> 3. Aufnahme von Zellen auf Platten in halbfesten Medium <ol><li&gt; Am nächsten Tag autoklavieren eine Lösung von 2,1% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in ddH 2 O in einer Flasche mit einem Rührstab. Halten Sie bei 65-90 ° C geschmolzen in einem größeren Becherglas mit Wasser auf der Heizung Magnetrührer. Für jede Transformation vorzubereiten 8 Petrischalen (55 mm Durchmesser) und 8 x 15 ml Tuben mit je 9 ml ASW sowie die gewünschte Auswahl. Bei Verwendung Nourseothricin oder G418, verwenden Sie 2 mg / ml. </li><li> Sammeln Sie die transformierten Zellen aus dem Inkubator. Arbeiten in einer sterilen Flowhood, 1 ml kochendem LMP-Agarose auf die 9 ml in einem der Rohre. Schließen Sie den Schlauch, und mischen durch Invertieren. Dann fügen Sie 0,5 ml frisch transformierten Zellen, schnell mischen und in die Platte. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit den restlichen 7 Röhren und dann gehen Sie zum nächsten Transformation Kolben. </li><li> Lassen Sie die Platten öffnen in der Strömung Haube für eine Stunde, für die Agarose zu setzen. Schließen Sie dann die Platten und übertragen Sie sie auf großen quadratischen Petrischalen, die mit 4 Platten, die jeweils halten wird. Verschließen Sie den quadratischen Platten with Parafilm. Beachten Sie, dass die Platten nicht vollständig eingestellt, und als Ergebnis ist das Gel sehr zerbrechlich. Darauf zu achten, um das Gel zu brechen beim Umgang mit den Platten sein. Legen Sie alle quadratischen Platten im Brutschrank. </li></ol> 4. Die Selektion von transformierten Kolonien <ol><li> Kolonien sollten nach 10 bis 21 Tagen auf den Platten Transformation, nicht aber auf den Mock-Platten verwandelt erscheinen. Zur Aufnahme Kolonien mit einem 200 ul Pipette mit abgeschnittenen Spitzen. Wählen Sie einfach kostenlos Kolonien und saugen Sie die grüne Kolonie. Achten Sie darauf, dass keine Zellen aus benachbarten Kolonien gehören. </li><li> Übertragen der Zellen zu 2 ml der flüssigen Medium, das die Auswahl, in einer 24 Vertiefungen Platte. Bei der Verwendung von Nourseothricin, verwenden Sie 1,75 mg / ml. Mischen Sie durch Auf-und Abpipettieren. Wählen Sie 24-50 Kolonien pro Transformation. Versiegeln Sie die Platten mit Parafilm und Transfer in den Inkubator. </li><li> Nach einer Woche, dann 100 ul jeder gut bis 2 ml frisch ASW mit Auswahl in einer 24 well-Platte und wachsen für eine additional 7 Tage. Hinterbliebener Zelllinien können für weitere Untersuchungen verwendet werden. Stabile Integration in das Genom und Insertion-Nummer sollte mittels PCR und Southern-Blot werden. Genomische DNA kann für diese Zwecke mit einem beliebigen herunterskalierten Standardmethode für Pflanzen-DNA-Extraktion erhalten werden. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Zellen aufgeteilt 1/100 erreicht eine Dichte von 25 Millionen Zellen pro Milliliter nach wachsender für 7 Tage. Die Elektroporation der Zellen mit den entsprechenden Einstellungen in Folge einer Zeitkonstante zwischen 10 und 14 Millisekunden. Wenn Zellen auf Medium in Kulturflaschen übertragen werden, sollte eine Kugel von Zellen zu bilden. Als nach einer Stunde leicht geschüttelt, sollten die Zellen leicht zu resuspendieren. Die Aufnahme von 1 ml transformierten Zellen in 0,2% LMP-Agar sollten in einem durchgängig, sondern nur halbfestes Gel führen. Kolonien sollten nach 10 bis 21 Tagen erscheinen. Bei der Umwandlung von 5 ug linearisierte DNA unter Verwendung des Protokolls oben, 50-100 Kolonien pro TransformationPlatte wurden in der Regel erwartet, im Vergleich zu keiner auf die negative Kontrolle Platten. ~ 80% der Kolonien wurden gepickt positiv Antibiotikaresistenz in einem flüssigen Medium ausgewählt und in nachfolgenden Studien verwendet. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Endkonzentration </td><td> Stammlösung </td><td> Volumen für 1 Liter </td></tr><tr><td> NaNO 3 </td><td> 8,83 x 10 -4 M </td><td> 75 g / l dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td> 3,63 x 10 -5 m </td><td> 2,68 g / l dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> β-Glycerophosphat </td><td> 1 × 10 -5 M </td><td> 2,16 g / l dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> H 2 SeO 3 </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 1,29 mg / l dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Tris-Base (pH 7,2) </td><td> 1 × 10 -3 M </td><td> 121,1 g / l dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> K Spurenmetallösung </td><td></td><td> Tabelle 2 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> f / 2 Vitamin-Lösung </td><td></td><td> Tabelle 3 </td><td> 0,5 ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Mittlere Bestandteile für das Wachstum von O. Tauri 11, 12. Make up mit einem Gesamtvolumen von 1 Liter künstlichem Meerwasser zu einem Salzgehalt von 30 ppt, und fügen Sie die oben genannten Komponenten aus Stammlösungen wie angegeben. Filter-Sterilisation des Mediums und den Einsatz innerhalb einer Woche. Die Bestände an allen Verbindungen mit Ausnahme des Vitamin-Lösung können gebündelt bis 6 ml dieser Lösung für jeden Liter Medium hinzuzufügen. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Endkonzentration </td><td> Stammlösung </td><td> Menge für 1 Liter </td></tr><tr><td> Na 2 </sub&gt; EDTA • 2H 2 O </td><td> 1 × 10 -4 M </td><td></td><td> 41,6 g </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td> 1 × 10 -5 M </td><td></td><td> 3,15 g </td></tr><tr><td> Na 2 MoO 4 • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 6,3 g / l dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7 H 2 O </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 22,0 g / l dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6 H 2 O </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 10,0 g / l dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 180,0 g / l dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5 H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 9,8 g / l dH <sub&gt; 2 O </td><td> 1 ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Spurenmetallösung 11,12. Mit Wasser bis auf insgesamt 1 Liter, in dH 2 O, und Wärme zu lösen. Aliquotieren und einfrieren die Lösung für die Lagerung. Abschließende angegebenen Konzentrationen beziehen sich auf das Medium, nicht die Spur Metall-Lösung. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Endkonzentration </td><td> Stammlösung </td><td> Menge für 1 Liter </td></tr><tr><td> Vitamin B 12 </td><td> 1 × 10 -10 M </td><td> 1 g / l dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Biotin </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 0,1 g / l dH 2 O </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> • Thiamin HCl </td><td> 1 × 10 -7 M </td><td></td><td> 200 mg </td></tr></tbody></table> Tabelle 3. f / 2Vitamin-Lösung 11. Stellen bis zu einem Gesamtbetrag von 1 Liter in dH 2 O, Filter sterilisieren, aliquotieren und einfrieren. Abschließende angegebenen Konzentrationen beziehen sich auf das Medium, nicht die Vitamin-Lösung. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig1.jpg" /> Abbildung 1. Grafische Übersicht der Transformation Prozedur. Schematische Darstellung des Verfahrens zu gentechnisch verändern Ostreococcus tauri durch Elektroporation. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig2.jpg" /> Abbildung 2. Kultur Wachstum. Zellen sind subkultiviert aseptisch in einer Verdünnung von 1/100 in frischen ASW alle 7 Tage und aufgewachsen unter konstanten Licht in einem Inkubator mit Pflanzenwachstum Moonlight Blue Filter ausgestattet. Die Lichtintensität sollte in der Nähe 20 pmol m -2 s -1 und Temperatur wird bei 20 ° C gehalten Zellen benötigen kein ständiger Bewegung zu sein, aber sind shaken einmal alle 2 bis 3 Tage, um die Aggregation zu verhindern. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig3.jpg" /> Abbildung 3. Colony Formation auf 0,2% LMP-Agarose. Transfer 4 Platten zu einem großen Platz Petrischale und Dichtung mit Parafilm (oben links). Wenn Kolonien gebildet haben, wählen Sie einfach kostenlos (im Idealfall konisch geformten) Kolonien (oben rechts) und saugen sie aus der Platte mit einer Pipette P200. Es sollten keine Kolonien auf der Negativ-Kontrolle (unten rechts) sein.

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	<li>Derelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+analysis+of+the+smallest+free-living+eukaryote+Ostreococcus+tauri+unveils+many+unique+features.">Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).</li><li>Henderson, G. P., Gan, L., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+ultrastructure+of+O.+tauri:+electron+cryotomography+of+an+entire+eukaryotic+cell.">3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell.</a> PLoS One. 2, e749 (2007).</li><li>O'Neill, J. 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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Cellular Staat und Kultur axeny ist von entscheidender Bedeutung für die Transformation Prozedur. Obwohl die Zellen üblicherweise in Zyklen von 12 Stunden Licht gehalten werden, wurden 12 Stunden Dunkelheit, Transformationseffizienz in Zellen unter diesen Bedingungen angebaut wird unzureichend zu sein. Während der wiederholten Pelletierung / Resuspension Schritte sollten die Zellen immer leicht zu resuspendieren. Wenn Zellen aggregieren, oder ein Schleim-ähnliche Substanz vorhanden ist, ist es besser, das Verfahren wieder von vorne beginnen. In der Regel können ~ 50 Kolonien auf jeder Platte Transformation gerechnet werden, im Vergleich zu keiner auf der Negativ-Kontrolle Platte. Bei geringer Transformationseffizienz sollte Kulturbedingungen variiert werden, um sicherzustellen Zellen sind im optimalen Zustand sein. Variablen, die Transformationseffizienz beeinflussen, gehören Umgebungstemperatur im Labor (sollte in der Nähe 20 ° C sein) und Handling-Geschwindigkeit (Procedure aus Pelletierung Zellen [2.3] der Besserung [2.7] sollte ~ 1 Stunde dauern). Es ist auch wichtig, dass alle Lösungen einRe machte vor jeder Transformation frisch. Für die Aufnahme in Platten, ist die Konzentration der LMP-Agarose von entscheidender Bedeutung. Ostreococcus Zellen nicht in hohen Konzentrationen Agarose wachsen, und in geringen Konzentrationen zu diffundieren. Drei Transformationsvektoren für Ostreococcus wurden bisher 6, veröffentlicht und Vektoren zu erzielenden und veröffentlicht kurz. Die vorhandenen Vektor Pot-Luc 6 ermöglicht die Verwendung eines Promotors der Wahl in Kombination mit einem C-terminalen Glühwürmchen-Luciferase-Tag eine schnellere Auswahl sowie transgene Linie handhabbar Expressionsmuster, während die Potox Vektor 6 trägt die starken induzierbaren Promotor aus der 13 entnommen Ostreococcus hoher Affinität Phosphat Transporter (HAPT)-Gen für die Überexpression des Gens von Interesse. Die Potox-Luc Vektor leitet sich von Potox, das Tragen einer zusätzlichen Marker, der Luciferase für indirekte Wahl der Überexpression Linien verwendet werden können <sbis&gt; 14. Erfolgreiche Selektionsmarker auf diesen Vektoren sind Nourseothricin und G148. Jedoch sind Ostreococcus Zellen gegen viele Antibiotika, und die Konzentrationen von Verbindungen, die für Selektion von transgenen Ostreococcus Zellen höher ist als bei herkömmlichen Modellsystemen (2 mg / ml). Obwohl das Verfahren als ineffizient, stellt die große Anzahl von Zellen und Plasmid-DNA für dieses Verfahren erforderlich keinen signifikanten Hindernis. Eine größere Einschränkung ist, dass jede Zeile erzeugt, die resistent gegen den Selektionsmarker ist es, individuell analysiert werden muss, um zu überprüfen, dass das gesamte Konstrukt in der DNA integriert wird. Wir haben Beispiele, in denen die erfolgreiche Expression des selektierbaren Markers nicht um das Einsetzen des tatsächlichen Gen von Interesse entsprach, beobachtet, dh teilweise Integrationen auftreten können. Offensichtlich zufällige Insertion in das Genom bedeutet auch, dass es keine Kontrolle der Insertionsstelle mit diesen Verfahren und Methoden, basierend auf homologe Rekombination werden derzeit entwickelt. Aber das hier beschriebene Verfahren ist, nach bestem Wissen, derzeit die einzige Methode, um dadurch genetisch veränderten Zellen Ostreococcus generieren. Als Ostreococcus tauri hat erst vor kurzem als ein experimentelles Modell Organismus benutzt wurde, ist den meisten Methoden der Arbeit mit diesen Zellen wahrscheinlich entwickeln und durch die wachsende Forschungsgemeinschaft beteiligt verfeinert werden. Dieses Protokoll soll den Menschen helfen, initiieren Arbeit mit Ostreococcus, aber keineswegs behauptet, alles, was man über genomische Transformation dieser Mikroalge kennen zu beschreiben. Die Autoren vertrauen, dass die Leser in der Lage, dieses Protokoll, um ihre eigenen Bedürfnisse als kleine Unterschiede in Inkubatoren (Lichtverhältnisse oder Qualität) und andere Parameter anzupassen und existieren wird wahrscheinlich in jedem einzelnen Labor optimiert werden, um die gesunde Kulturen dazu benötigte erhalten Protokoll. Nach Bewältigung der hier beschriebenen Techniken,Vektoren können zur lumineszierenden, fluoreszierenden oder anderen markierte Fusionsproteine ​​Leitungen unter der Steuerung einer Reihe von Promotoren zu erzeugen. Dieses aufregende neue experimentelle Plattform wird nützlich sein, zu untersuchen, wie komplizierte biochemische Probleme in einem Eukaryonten mit reduzierter Komplexität, in denen pharmakologische Ansätze hoch 3 sind erleichtert, gelöst werden.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Mittlere Bestandteile </td></tr><tr><td> Chemikalie </td><td colspan="2" > Katalog-Nummer </td><td> Lieferant </td></tr><tr><td> Instant Ocean Meersalz </td><td colspan="3"> von <a href="http://amazon.co.uk" target="_blank">amazon.co.uk</a> oder <a href="http://rocketaquatics.co.uk" target="_blank">rocketaquatics.co.uk</a> </td></tr><tr><td> NaNO 3 </td><td colspan="2"> S5506-250G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td colspan="2"> A9434-500G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Glycerin-2-phosphat Dinatriumsalz Hydrat </td><td colspan="2"> G9422-100G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> H 2 SeO 3 </td><td colspan="2"> 84920-250G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Reinstwasser Tris </td><td colspan="2"> 15504-020 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> • Na 2 EDTA · 2H 2 O </td><td colspan="2"> BPE120-500G </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 157740 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Na 2 MoO 4 • 2H 2 O </td><td colspan="2"> 31439-100G-R </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7 H 2 O </td><td colspan="2"> Z0251 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6 H 2 O </td><td colspan="2"> 31277 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td colspan="2"> 203734-5G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5 H 2 O </td><td colspan="2"> C8027 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Vitamin B 12 (Cyanocobalamin) </td><td colspan="2"> V2876 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Biotin </td><td colspan="2"> 47868 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> • Thiamin HCl </td><td colspan="2"> T4625 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td colspan="2"> A9518-25G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Neomycin </td><td colspan="2"> N6386 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Kanamycin </td><td colspan="2"> K4000 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td colspan="4"> Verbrauchsmaterialien für die Kultivierung </td></tr><tr><td colspan="2"> Artikel </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Lieferant </td></tr><tr><td colspan="2"> Zellkulturflasche T25 Suspensionskulturen mit Gieskanal belüfteter </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Zellkulturflasche T75 Suspensionskulturen mit Gieskanal belüfteter </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Zellkulturflasche T175 Suspensionskulturen mit Gieskanal belüfteter </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP Bottle Top Filter, 1L, komplett </td><td> 99950T </td><td> Helena Bioscience </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP Bottle Top Filter, 500ml, </td><td> 99500T </td><td> Helena Bioscience </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP Bottle Top Filter, 250ml, </td><td> 99250T </td><td> Helena Bioscience </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP Bottle Top Filter, 150ml, </td><td> 99150T </td><td> Helena Bioscience </td></tr><tr><td colspan="2"> Salzgehalt Meter für Marine Aquarium </td><td> DSG-10 </td><td> Daeyoon </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="3" > Chemikalien für die Transformation </td></tr><tr><td> Chemikalie </td><td> KatalogAnzahl </td><td> Lieferant </td></tr><tr><td> D-Sorbit </td><td> S6021-1KG </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Pluronic F-68 Lösung </td><td> P5556-100ML </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> ClonNAT </td><td> 51000 </td><td> Werner </td></tr><tr><td> Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt </td><td> 16520-050 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td colspan="3"> Verbrauchsmaterial für Transformation </td></tr><tr><td> Artikel </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Lieferant </td></tr><tr><td> Zellkulturflasche T25 Suspensionskulturen mit Gieskanal belüfteter </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Zellkulturflasche T75 Suspensionskulturen mit Gieskanal belüfteter </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Zellkulturflasche T175 Federung Cultures mit Gieskanal belüfteter </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Greiner Zentrifugenröhrchen 50ml </td><td> 227261 </td><td> GBO </td></tr><tr><td> Gene Pulser / MicroPulser Küvetten, 0,2 cm Abstand, 50 </td><td> 165-2086 </td><td> Bio-Rad </td></tr><tr><td> Petrischale runden PS 3 VENTS H14.2 Φ55 </td><td> 391-0895 </td><td> VWR International </td></tr><tr><td> Petrischale mit vier quadratischen Öffnungen sterile Polystyrol durch Bestrahlung klar 120mm </td><td> FB51788 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Moonlight Blaulichtfilter </td><td> 183 </td><td> Lee Lighting </td></tr></tbody></table>

genomic transformation of the picoeukaryote ostreococcus tauri

Häufige Probleme behindert schnelle Fortschritte in Plant Sciences zählen Zell-, Gewebe und ganzen Organismus Komplexität und vor allem das hohe Niveau der genomischen Redundanz beeinflussen einfache Genetik in höheren Pflanzen. Das erfindungsgemäße Modellorganismus Ostreococcus tauri ist die kleinste frei lebenden eukaryotischen bisher bekannten und besitzt einen stark reduzierten Genomgröße und zelluläre Komplexität 1,2, durch die Anwesenheit von nur einer der Organellen (Mitochondrien, Chloroplasten, Golgi) pro manifestiert Zelle, und ein Genom, das nur ~ 8000 Gene. Weiterhin stellt die Kombination von unicellularity und einfache Kultur eine Plattform zugänglich chemische Ansätze. Vor kurzem hat Ostreococcus erfolgreich eingesetzt, um grundlegende Mechanismen der zirkadianen Zeitmessung 3-6 studieren. Die Ergebnisse dieser Modell-Organismus haben nicht nur Plant Science beeinflusst, sondern auch Säugetierbiologie 7. Dieses Beispiel macht deutlich, wie schnell ein Experimentieren ineinfache Eukaryoten aus der grünen Linie kann die Forschung in komplexeren Organismen beschleunigen durch die Erzeugung überprüfbare Hypothesen mit Methoden technisch möglich nur in diesem Zusammenhang von geringerer Komplexität. Wissen eines Genoms und die Möglichkeit, Gene zu verändern sind unverzichtbare Werkzeuge in jedem Modell Arten. Genomic 1, Transkriptom 8, 9 und Proteom-Daten für diese Spezies ist frei verfügbar, während die zuvor berichteten Methoden zu 6,10 genetisch verändern Ostreococcus zu wenige Labors weltweit bekannt sind. In diesem Artikel, um die experimentellen Verfahren, genetisch transformierbar diese neuartigen Modell Organismus mit einer Überexpression Konstrukt mittels Elektroporation werden im Detail beschrieben, sowie das Verfahren der Aufnahme von transformierten Zellen in geringen Prozentsatz Agarose die Selektion transformierter Linien von einem bestimmten einzigen transformierten Zelle. Nach der erfolgreichen Anwendung der OstreocoCCUs zu circadianen Forschung, kann wachsendes Interesse an Ostreococcus aus verschiedenen Forschungsbereichen innerhalb und außerhalb der Botanik einschließlich biotechnologischen Bereichen zu erwarten. Forscher aus einem breiten Spektrum von biologischen und medizinischen Wissenschaften, die auf biochemischen Wege konservierte arbeiten kann prüfen, forscht in Ostreococcus, frei von genomischer und organismischen Komplexität des größeren Modells Arten.

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Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Dieser Artikel beschreibt die genetische Transformation der einzelligen Alge<em&gt; Ostreococcus tauri</em&gt; Durch Elektroporation. Diese eukaryotischen Organismus ist ein gutes Modell-Plattform für höhere Pflanzen, possesing stark reduziert genomischen und zellulären Komplexität und wobei sich gut für die sowohl Zellkultur und Biochemie.

Genomic Transformation des Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolierung genomischer DNA aus Maus-Tails

Forschung

Biologie

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

Large Insert Environmental Genomic Bibliothek Produktion

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Generierung von RNA / DNA-Hybride in genomischer DNA durch Transformation mit RNA-haltigen Oligonukleotiden

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

Genomic MRI - eine öffentliche Ressource für ein Studium Sequence Patterns in genomischer DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Selektive Aufnahme von 5-Hydroxymethylcytosin aus genomischer DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

Array Comparative Genomic Hybridization (Array-CGH) zum Nachweis von Genomic Copy Number Varianten

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

RNA-Sequenzierung Assay Gezieltes Genexpression und Genomic Änderungen an Charakterisieren

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

Vorbereitung und Injektion von Embryonen von Culex-Moskitos zur Erzeugung von Nullmutationen mit CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...