Name: genomic transformation of the picoeukaryote ostreococcus tauri
Uploaded: 2012-07-13T13:00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri at JoVE.com

SynthSys המרכז לביולוגיה אינטגרטיבית מערכות במימון BBSRC ואת הפרס EPSRC D019621. האיחוד האירופי FP6 רשת מענק מצוינות &quot;Genomics ימית&quot; כדי FYB מימנה פיתוח שיטות שינוי גנטי.

1. הכנת חומר אצות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים בתרבית Ostreococcus הם מי ים מלאכותיים (ASW). מלחי ים (בדרך כלל כ -40 גרם לליטר) הם מומסים במים deionised למליחות של 30 ppt, כפי שנמדד באמצעות מד מליחות. אמצעי העשרה 11,12, יסודות קורט מתכות וויטמינים נוספים, כמתואר בטבלה 1-3. התקשורת היא אז פילטר עיקור באמצעות כמה 0.22 מיקרומטר הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך תחזוקה, תאים של מתח Ostreococcus OTTH95 הם תת תרבות בסביבה נקייה מחיידקים, בדילול של 1/100 ב ASW טרי כל 7 ימים ו גדל תחת אור קבוע גידול צמחים בחממה מצויד אור הירח הכחול הסינון. עוצמת האור צריך להיות קרוב ל 20 μmol m -2 s -1 והטמפרטורה נשמרת על 20 ° C. התאים אינם דורשים תסיסה מתמדת, אבל הם מזועזעים אחת ל -2 עד 3 ימים כדי למנוע צבירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשינוי זה, 50 מ&quot;ל של תאים נדרשים על התא דהnsity של 20-30 x 10 6 מ&quot;ל -1, שאמור להיות מושג לאחר 5-7 ימים culturing המשנה. צפיפות התאים axeny משוער ניתן לקבוע באמצעות אחת cytometry זרימה או haemocytometer לפחות הגדלה של X40. </li></ol> 2. Electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ה-DNA לשינוי. לשינוי זה, 5 מיקרוגרם של ה-DNA, טהור פלסמיד linearised נדרש בריכוז של 1 מיקרוגרם / μl במים deionised סטרילית. כדי להשיג את ה-DNA, החוקרים ממליצים להשתמש midi Qiagen ערכת הכנה, אם כי שיטות אחרות יכול לעבוד באותה מידה. לעכל את המוצר עם האנזים החותך ב עמוד השדרה של וקטור פעם, אבל לא transgene או הגן הבחירה. יתר על כן לטהר ולרכז את ה-DNA ליניארי שהתקבל על ידי משקעים אתנול, ו resuspend המוצר בהיקף המתאים מים באיכות גבוהה deionised סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו צינורות microcentrifuge המכילים DNA 5 מיקרוגרם לשינוי זה. Controאני עם ה-DNA לא נחוץ כל שורה בתא להשתנות. זכור את הצינורות על קרח, יחד עם קובט electroporation 2 מ&quot;מ לשינוי זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין 2.2 מ&quot;ל של חיץ resuspension לכל שינוי. ממיסים סורביטול לפתרון M 1 ב DDH 2 O, מוסיף 0.1% חומצה pluronic F68 ו-מסנן לעקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת חומצה pluronic F68, לריכוז סופי של 0.1% אל התאים, ועל גלולה אותם במשך 10 דקות בכל 8000x גרם ב 10 ° C בצינור 50 מ&quot;ל עם תחתית בצורת חרוט. מיד resuspend התאים מ&quot;ל 1 של חיץ resuspension ידי pipetting למעלה ולמטה, ולהעביר את הצינור microfuge. ספין למטה במשך 10 דקות ב 8000 XG ב 10 ° C, עובד מהר, חזור על שלב זה לשטוף פעם נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם קצה גזירה, resuspend כל גלולה האחרון μl 40 מאגר resuspension. הוסף 40 μl של תאים resuspended אל צינור ה-DNA של כל linearised על קרח, לערבב בעדינות ולהעביר את קובט electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את קובט על electropנאום המכונה. לשנות את ההגדרות כדי kV 6 ס&quot;מ -1, 600 Ω, ו 25 μF. Electroporate התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים electoporated ב cuvettes את בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ולהשתמש זמן להכין את תרבות צלוחיות רקמות. לתייג אותם להוסיף 30 מ&quot;ל של ASW טרי זה. קח 1 מ&quot;ל מתוך בקבוק אחד ובעדינות להוסיף אותו קובט המקביל. דגירה של 2 דקות בעדינות להסיר את ASW, עכשיו המכיל כדורית של תאים בעדינות ולאט לאט פיפטה ישירות ASW בבקבוק התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים בדרך כלל להישאר כדורית. יש להיזהר לא ללחוץ או להפריע את התאים מצטברים ברגע זה. אפשר התאים להתאושש בחממה למשך 1-2 שעות, resuspend מכן על ידי רועדת על צלוחיות. בשלב זה, התאים צריכים resuspend בחופשיות גושים לא צריך להיות גלוי. השאירו את התרבויות לשחזר לילה בחממה. </li></ol> 3. הכללה של תאים בצלחות במצע חצי מוצק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><lאני&gt; למחרת, החיטוי פתרון של 2.1% נקודת התכה נמוכה agarose ב DDH 2 O בבקבוק המכיל מוט ערבוב. שמור מותכת על 65-90 מעלות צלזיוס בכוס גדולה יותר המכילה מים על stirrer חימום מגנטי. לשינוי זה להכין 8 צלחות פטרי (בקוטר 55 מ&quot;מ) ו -8 צינורות x 15 מ&quot;ל כל אחת מכילה 9 מ&quot;ל של ASW, בתוספת מבחר הנדרש. אם אתה משתמש Nourseothricin או G418, השתמש 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוספים את התאים השתנו מן החממה. עבודה flowhood סטרילית, הוסף 1 מ&quot;ל של רותחים LMP agarose כדי מ&quot;ל 9 באחד הצינורות. סגור את הצינור, ומערבבים על ידי היפוך. לאחר מכן הוסף 0.5 מ&quot;ל של תאים שהפכו זה עתה, לערבב במהירות ולשפוך לתוך הצלחת. חזור על תהליך זה עם 7 צינורות הנותרים, ואז להמשיך בקבוק השינוי הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו הצלחות לפתוח בשכונה זרימת במשך שעה, על agarose להגדיר. ואז לסגור את הצלחות ולהעבירם רבועים מנות גדולות פטרי, אשר תקיים 4 צלחות כל אחת. לאטום את השנינות צלחות מרובעH parafilm. לציין כי הצלחות לא יקבע לחלוטין, וכתוצאה מכך, ג&#39;ל הוא שברירי מאוד. יש להיזהר לא לשבור את הג&#39;ל במהלך הטיפול בו הצלחות. מניחים את כל צלחות מרובעות בחממה. </li></ol> 4. מבחר המושבות טרנספורמציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מושבות אמור להופיע לאחר 10 עד 21 ימים על הצלחות שינוי, אך לא על צלחות שהפכו מדומים. לקחת מושבות להשתמש פיפטה 200 μl עם חתוכים טיפים. שעליך לעשות הוא לבחור מושבות בחינם ולמצוץ את המושבה הירוקה. יש להיזהר שלא לכלול תאים מן המושבות השכנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התאים 2 מ&quot;ל של מדיום נוזל המכיל את הבחירה, בצלחת בארות 24. בעת שימוש Nourseothricin, השתמש 1.75 מ&quot;ג / מ&quot;ל. מערבבים ידי pipetting מעלה ומטה. בחר 24-50 מושבות לכל שינוי. לאטום את הצלחות עם parafilm והעברה חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שבוע, להעביר 100 μl של כל טוב 2 מ&quot;ל טרי ASW עם מבחר בצלחת בארות 24 ולגדול על additionaL-7 ימים. שורות תאים ששרדו יכול לשמש למחקרים נוספים. שילוב יציבה למספר הגנום הכניסה יש לנתח באמצעות PCR ו כתם הדרום. הדנ&quot;א הגנומי ניתן להשיג מטרות אלה באמצעות כל שיטה לאורך בקנה מידה סטנדרטית להפקת DNA הצמח. </li></ol> 5. נציג תוצאות פיצול תאים 1/100 הגיעו צפיפות של 25 מיליון תאים למיליליטר לאחר גידול של 7 ימים. Electroporation של תאים עם ההגדרות המתאימות הביא כמה זמן קבועים בין 10 ל 14 אלפיות השנייה. כאשר תאים מועברים בינוני צלוחיות תרבות, כדורית של תאים צריך טופס. כאשר מזועזע קלות אחרי שעה, התאים צריכים בקלות resuspend. הכללה של 1 מ&quot;ל תאים הופכים אגר LMP 0.2% אמורה לגרום ג&#39;ל חצי מוצק עקבי אבל רק. מושבות אמור להופיע לאחר 10 עד 21 ימים. כאשר למהפך 5 מיקרוגרם של ה-DNA linearised באמצעות פרוטוקול לעיל, 50-100 מושבות לכל שינויהצלחת היו אמורים בדרך כלל, לעומת אף על לוחות בקרה שליליות. ~ 80% מושבות הרים נבחרו באופן חיובי על ידי עמידות לאנטיביוטיקה במדיום נוזלי נעשה שימוש במחקרים הבאים. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> ריכוז סופי </td><td> המניות פתרון </td><td> נפח של 1 ליטר </td></tr><tr><td> NANO 3 </td><td> 8.83 x 10 -4 M </td><td> 75 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td> 3.63 x 10 -5 M </td><td> 2.68 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> β-glycerophosphate </td><td> 1 x 10 -5 M </td><td> 2.16 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> H 2 3 SEO </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 1.29 מ&quot;ג / ל &#39;ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> טריס בסיס (pH 7.2) </td><td> 1 x 10 -3 M </td><td> 121.1 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> K עקבות פתרון מתכת </td><td></td><td> טבלה 2 </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> f / 2 פתרון ויטמין </td><td></td><td> לוח 3 </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> טבלה 1. המרכיבים בינוני לצמיחה של א &#39; tauri 11, 12. איפור בנפח כולל של 1 ליטר של מי ים מלאכותיים כדי מליחות של 30 ppt, ולהוסיף את המרכיבים הנ&quot;ל מפתרונות מניות כמצוין. סנן-לעקר בינוני ושימוש בתוך שבוע. מניות של כל תרכובות מלבד פתרון ויטמין ניתן ונקווה להוסיף 6 מ&quot;ל של פתרון זה עבור כל ליטר של המדיום. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> ריכוז סופי </td><td> המניות פתרון </td><td> סכום של 1 ליטר </td></tr><tr><td> Na 2 </sUB&gt; EDTA • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 -4 M </td><td></td><td> 41.6 גרם </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6 שעות 2 O </td><td> 1 x 10 -5 M </td><td></td><td> 3.15 גר &#39; </td></tr><tr><td> Na 2 מו 4 • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 6.3 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 22.0 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6 שעות 2 O </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 10.0 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 180.0 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 9.8 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה <sub&gt; 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> טבלה 2. עקוב אחר פתרון מתכת 11,12. לעשות עד לסך של 1 ליטר, ב ד&quot;ה 2 O, וחום לפרק. הפתרון aliquot ומקפיאים לאחסון. הריכוזים האחרונים הצביעו מתייחסים בינוני של דבר, לא הפתרון מתכת עקבות. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> ריכוז סופי </td><td> המניות פתרון </td><td> סכום של 1 ליטר </td></tr><tr><td> ויטמין B 12 </td><td> 1 x 10 מ -10 </td><td> 1 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> ביוטין </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 0.1 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 10 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> תיאמין • HCl </td><td> 1 x 10 -7 M </td><td></td><td> 200 מ&quot;ג </td></tr></tbody></table> לוח 3. f / 2ויטמין הפתרון 11. לעשות עד לסך של 1 ליטר ב DH 2 O, פילטר לעקר, aliquot ומקפיאים. הריכוזים האחרונים הצביעו מתייחסים בינוני של דבר, לא הפתרון ויטמין. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig1.jpg" /> באיור 1. סקירה גרפית של תהליך השינוי. ייצוג סכמטי של הליך גנטית כדי להפוך Ostreococcus tauri ידי electroporation. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig2.jpg" /> איור 2. תאים גדילה והתרבות. הם תת תרבות בסביבה נקייה מחיידקים, בדילול של 1/100 ב ASW טרי כל 7 ימים, גדל תחת אור קבוע גידול צמחים בחממה מצויד אור ירח כחול הסינון. עוצמת האור צריך להיות קרוב ל 20 μmol m -2 s -1 והטמפרטורה נשמרת על 20 מעלות צלזיוס תאים אינם דורשים תסיסה מתמדת, אבל הם שלhaken אחת ל -2 עד 3 ימים כדי למנוע צבירה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig3.jpg" /> איור 3. במושבה היווצרות על 0.2% LMP agarose. העברת 4 צלחות פטרי צלחת גדולה בכיכר, ואת החותם עם parafilm (למעלה משמאל). כאשר הקימו מושבות, פשוט לבחור בחינם (באופן אידיאלי בצורת conically) מושבות (מימין למעלה) ולמצוץ אותם בצלחת עם טפטפת P200. לא אמורה להיות מושבות בשלט שלילית (מימין למטה).

<ol>
	<li>Derelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+analysis+of+the+smallest+free-living+eukaryote+Ostreococcus+tauri+unveils+many+unique+features.">Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).</li><li>Henderson, G. P., Gan, L., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+ultrastructure+of+O.+tauri:+electron+cryotomography+of+an+entire+eukaryotic+cell.">3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell.</a> PLoS One. 2, e749 (2007).</li><li>O'Neill, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+persist+without+transcription+in+a+eukaryote.">Circadian rhythms persist without transcription in a eukaryote.</a> Nature. 469, 554-558 (2011).</li><li>van Ooijen, G., Dixon, L. E., Troein, C., Millar, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+function+is+required+for+biological+timing+throughout+the+twenty-four+hour+cycle.">Proteasome function is required for biological timing throughout the twenty-four hour cycle.</a> Curr. Biol. 21, 869-875 (2011).</li><li>Troein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+light+inputs+to+a+simple+clock+circuit+allow+complex+biological+rhythms.">Multiple light inputs to a simple clock circuit allow complex biological rhythms.</a> Plant. J. 66, 375-385 (2011).</li><li>Corellou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clocks+in+the+green+lineage:+comparative+functional+analysis+of+the+circadian+architecture+of+the+picoeukaryote+ostreococcus.">Clocks in the green lineage: comparative functional analysis of the circadian architecture of the picoeukaryote ostreococcus.</a> Plant Cell. 21, 3436-3449 (2009).</li><li>O'Neill, J. S., Reddy, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+clocks+in+human+red+blood+cells.">Circadian clocks in human red blood cells.</a> Nature. 469, 498-503 (2011).</li><li>Monnier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrated+transcription+of+biological+processes+in+the+marine+picoeukaryote+Ostreococcus+exposed+to+light/dark+cycles.">Orchestrated transcription of biological processes in the marine picoeukaryote Ostreococcus exposed to light/dark cycles.</a> B.M.C. Genomics. 11, 192 (2010).</li><li>Le Bihan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+proteomic+analysis+of+the+unicellular+alga+Ostreococcus+tauri.">Shotgun proteomic analysis of the unicellular alga Ostreococcus tauri.</a> J. Proteomics. 74, 2060-2070 (2011).</li><li>Corellou, F., Bouget, F. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+polypeptides+from+the+nuclear+genome+of+Ostreococcus+sp.">Expression of polypeptides from the nuclear genome of Ostreococcus sp.</a> US application patent. , (2010).</li><li>Guillard, R. R. L., Ryther, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+marine+planktonic+diatoms.+I.+Cyclotella+nana+Hustedt,+and+Detonula+confervacea+(cleve)+Gran.">Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran.</a> Can. J. Microbiol. 8, 229-239 (1962).</li><li>Keller, M. D., Selvin, R. C., Claus, W., Guillard, R. R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media+for+the+culture+of+oceanic+ultraphytoplankton.">Media for the culture of oceanic ultraphytoplankton.</a> J. Phycol. 23, 633-638 (1987).</li><li>Djouani-Tari, e. l. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phosphate-regulated+promoter+for+fine-tuned+and+reversible+overexpression+in+Ostreococcus:+Application+to+circadian+clock+functional+analysis.">A phosphate-regulated promoter for fine-tuned and reversible overexpression in Ostreococcus: Application to circadian clock functional analysis.</a> PLoS One. 6, e28471 (2011).</li><li>Moulager, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+light+signals+by+the+retinoblastoma+pathway+in+the+control+of+S+phase+entry+in+the+picophytoplanktonic+cell+Ostreococcus.">Integration of light signals by the retinoblastoma pathway in the control of S phase entry in the picophytoplanktonic cell Ostreococcus.</a> PLoS. Genet. 6, e1000957 (2010).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

נייד axeny המדינה והתרבות היא בעלת חשיבות מכרעת לתהליך השינוי. למרות שתאי נשמרים בדרך כלל מחזורים של 12 שעות אור, 12 שעות חושך, יעילות השינוי בתאים הגדלים בתנאים הללו נמצאו מספיק. במהלך pelleting / resuspension צעדים חוזרים ונשנים, התאים תמיד צריך resuspend בקלות. אם תאים צבירה, או חומר דמוי ריר נוכח, עדיף להתחיל את התהליך מההתחלה שוב. בדרך כלל, ~ 50 מושבות ניתן לצפות על כל צלחת שינוי, לעומת אף על צלחת הביקורת השלילית. במקרה של יעילות הטרנספורמציה נמוכה, תנאי culturing צריכים להיות מגוונים על מנת להבטיח התאים נמצאים במצב אופטימלי. המשתנים המשפיעים על יעילות השינוי כוללים טמפרטורת הסביבה במעבדה (צריך להיות קרוב ל 20 מעלות צלזיוס) ומהירות הטיפול (נוהל מ pelleting תאים [2.3] להחלמה [2.7] צריך לקחת ~ 1 שעה). כמו כן, חשוב כי כל כמה פתרונותRe עשה טרי לפני כל שינוי. עבור הכללה צלחות, ריכוז LMP agarose הוא קריטי. תאים Ostreococcus לא יגדל ב ריכוזים גבוהים agarose, ויהיה לפזר בריכוזים נמוכים. שלושה וקטורים שינוי עבור Ostreococcus פורסמו בעבר 6, ו וקטורים נוספים צפויים להיות שנוצר ופורסם זמן קצר. וקטור קיים פוט לוק 6 מאפשר שימוש promotor הבחירה בשילוב עם תג גחלילית בטרמינל C-בלוציפראז המאפשר בחירת הקו מהונדס מהיר בתוספת דפוסי הביטוי צייתן, בעוד וקטור Potox 6 נושא מושרה חזק 13 promotor שנלקח Ostreococcus זיקה גבוהה פוספט Transporter (HAPT) הגן ביטוי יתר של הגן של עניין. וקטור Potox לוק נובע Potox, נושא בלוציפראז סמן נוסף שניתן להשתמש בו לבחירה ישירה של קווי overexpression <sעד&gt; 14. סמנים בחירה מוצלחת על וקטורים אלו Nourseothricin ו G148. עם זאת, תאים Ostreococcus עמידות מאוד בפני אנטיביוטיקה רבים, ריכוזי חומרים הדרושים מבחר מהונדס לתאי Ostreococcus הוא גבוה יותר מאשר עבור מערכות המודל המקובל (2 מ&quot;ג / מ&quot;ל). אמנם התהליך נראה בלתי יעיל, מספר גדול של תאים ו-DNA פלסמיד צורך בהליך זה אינו מהווה מכשול משמעותי. הגבלה גדולה יותר היא שכל קו שנוצר כי הוא עמיד בפני סמן לבחירה צריך להיות מנותח בנפרד כדי לבדוק את המבנה כולו משולב ב-DNA. ראינו דוגמאות שבהן ביטוי מוצלח של סמן לבחירה לא תואמות את הכניסה של הגן בפועל של עניין, כלומר אינטגרציה חלקי יכול להתרחש. ככל הנראה, הכניסה אקראי לתוך הגנום גם אומר שאין שליטה על הכניסה לאתר באמצעות שיטה זו, ושיטות בased על רקומבינציה הומולוגיים כרגע בשלבי פיתוח. עם זאת, השיטה המתוארת כאן היא, למיטב ידיעתנו, כיום השיטה מאופיינת רק כדי לייצר תאים Ostreococcus מהונדסים גנטית. כמו Ostreococcus tauri רק לאחרונה נעשה שימוש כאורגניזם מודל ניסיוני, רוב שיטות עבודה עם תאים אלה עשוי להתפתח להיות מעודן על ידי קהילת המחקר הגוברת מעורב. פרוטוקול זה נועד לעזור לאנשים להתחיל לעבוד עם Ostreococcus, אבל בשום פנים ואופן לא מתיימר לתאר את כל מה שיש לדעת על שינוי גנטי של microalga זה. אמון המחברים כי הקוראים יוכלו להתאים את פרוטוקול לצרכים שלהם כמו הבדלים קטנים חממות (רמות האור או איכות) ופרמטרים נוספים יהיו קיימים וסביר צריך להיות מותאם במעבדה כל אדם לקבל את התרבויות בריאים הדרושים לכך פרוטוקול. לאחר שליטה בטכניקות שתוארו כאן,וקטורים ניתן לבנות ליצור זורח, פלורסנט, או קווים אחרים היתוך מתוייגים תחת שליטה של ​​מגוון רחב של promotors. זו פלטפורמה מרגש ניסיוני הספר יהיה שימושי ללמוד כמה בעיות ביוכימיות מסובכות נפתרות ב eukaryote מורכבות מופחתת, בו גישות תרופתי הם הקלו מאוד 3.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="4"> בינוני מרכיבים </td></tr><tr><td> כימי </td><td colspan="2" > מספר קטלוגי </td><td> ספק </td></tr><tr><td> מיידית האוקיינוס ​​ימית מלח </td><td colspan="3"> מ <a href="http://amazon.co.uk" target="_blank">amazon.co.uk</a> או <a href="http://rocketaquatics.co.uk" target="_blank">rocketaquatics.co.uk</a> </td></tr><tr><td> NANO 3 </td><td colspan="2"> S5506-250 גרם </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td colspan="2"> A9434-500 גרם </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> 2-גליצרול פוספט הרכב: מימה מלח </td><td colspan="2"> G9422-100 גרם </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> H 2 3 SEO </td><td colspan="2"> 84920-250 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> אולטרה טהורים טריס </td><td colspan="2"> 15504-020 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Na 2 EDTA • 2H 2 O </td><td colspan="2"> BPE120-500 גרם </td><td> פישר סיינטיפיק </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6 שעות 2 O </td><td colspan="2"> 157740 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> Na 2 מו 4 • 2H 2 O </td><td colspan="2"> 31439-100 גרם-R </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td colspan="2"> Z0251 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6 שעות 2 O </td><td colspan="2"> 31277 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td colspan="2"> 203734-5G </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td colspan="2"> C8027 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> ויטמין B 12 (cyanocobalamin) </td><td colspan="2"> V2876 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> ביוטין </td><td colspan="2"> 47868 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> תיאמין • HCl </td><td colspan="2"> T4625 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td colspan="2"> A9518-25 גרם </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> Neomycin </td><td colspan="2"> N6386 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> Kanamycin </td><td colspan="2"> K4000 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td colspan="4"> חומרים מתכלים ל culturing </td></tr><tr><td colspan="2"> פריט </td><td> מספר קטלוגי </td><td> ספק </td></tr><tr><td colspan="2"> תרביות רקמה קנקן T25 מתלה תרבויות פרקו עם יציקת ערוץ </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> תרביות רקמה קנקן T75 מתלה תרבויות פרקו עם יציקת ערוץ </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedלא </td></tr><tr><td colspan="2"> תרביות רקמה קנקן T175 מתלה תרבויות פרקו עם יציקת ערוץ </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> הדף TPP בקבוק מסננים, 1 ליטר, להשלים </td><td> 99950T </td><td> Bioscience הלנה </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP מסננים בקבוק העליון, 500 מ&quot;ל, </td><td> 99500T </td><td> Bioscience הלנה </td></tr><tr><td colspan="2"> הדף TPP בקבוק מסננים, 250 מ&quot;ל, </td><td> 99250T </td><td> Bioscience הלנה </td></tr><tr><td colspan="2"> הדף TPP בקבוק מסננים, 150 מ&quot;ל, </td><td> 99150T </td><td> Bioscience הלנה </td></tr><tr><td colspan="2"> מליחות מטר ימית Aquarium </td><td> DSG-10 </td><td> Daeyoon </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="3" > כימיקלים לשינוי </td></tr><tr><td> כימי </td><td> קטלוגמספר </td><td> ספק </td></tr><tr><td> D-סורביטול </td><td> S6021-1 ק&quot;ג </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> F-68 Pluronic פתרון </td><td> P5556-100 מ&quot;ל </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> ClonNat </td><td> 51000 </td><td> ורנר </td></tr><tr><td> נקודת התכה נמוכה agarose </td><td> 16520-050 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td colspan="3"> מתכלים לשינוי </td></tr><tr><td> פריט </td><td> מספר קטלוגי </td><td> ספק </td></tr><tr><td> תרביות רקמה קנקן T25 מתלה תרבויות פרקו עם יציקת ערוץ </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> תרביות רקמה קנקן T75 מתלה תרבויות פרקו עם יציקת ערוץ </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> תרבות Flask רקמות T175 השעיה Cultures פרקו עם יציקת ערוץ </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> גריינר צינורות צנטריפוגות 50 מ&quot;ל </td><td> 227261 </td><td> GBO </td></tr><tr><td> הגן Pulser / MicroPulser cuvettes, 0.2 הפער ס&quot;מ, 50 </td><td> 165-2086 </td><td> ביו רד </td></tr><tr><td> פטרי צלחת עגולה PS 3 פתחי אוורור H14.2 Φ55 </td><td> 391-0895 </td><td> VWR הבינלאומי </td></tr><tr><td> פטרי צלחת מרובעת עם קלקר פתחי 4 סטרילית ידי 120mm קרינה ברורה </td><td> FB51788 </td><td> פישר סיינטיפיק </td></tr><tr><td> אור ירח כחול בהיר מסנן </td><td> 183 </td><td> לי תאורה </td></tr></tbody></table>

genomic transformation of the picoeukaryote ostreococcus tauri

בעיות נפוצות פוגע ההתקדמות המהירה במדעי הצמח כולל רקמות הסלולר, והמורכבות האורגניזם כולו, בעיקר רמה גבוהה של יתירות גנומית להשפיע על הגנטיקה פשוטים צמחים גבוהים יותר. אורגניזם מודל הרומן Ostreococcus tauri הוא הקטן ביותר החופשי חי eukaryote הידוע עד כה, ו בעל גודל הגנום הקטינה באופן משמעותי את המורכבות ואת 1,2 הסלולר, באה לידי ביטוי על ידי נוכחות של רק אחד רוב האברונים (mitochondrion, הכלורופלסט, מחסנית Golgi) לכל התא, גנום המכיל רק ~~~HEAD=NNS 8000 גנים. יתר על כן, השילוב של unicellularity והתרבות קל מספק פלטפורמה מקובל גישות וביולוגיה כימית. לאחרונה, Ostreococcus כבר מצליחים ללמוד המנגנונים הבסיסיים העומדים בבסיס מדידת זמן היממה 3-6. תוצאות של אורגניזם מודל זה השפיעו לא רק מדע הצמח, אלא גם בביולוגיה של יונקים 7. דוגמה זו מדגישה עד כמה ניסויים מהירהeukaryote פשוט משושלת ירוק יכול להאיץ מחקר באורגניזמים מורכבים יותר על ידי יצירת השערות לבדוק בדיקה בשיטות אפשרי מבחינה טכנית רק רקע זה של מורכבות מופחתת. ידיעת הגנום ואת האפשרות לשנות את הגנים הם כלים חיוניים כל מין המודל. גנומי 1, Transcriptomic 8, ומידע proteomic 9 על מין זה הוא זמין בחינם, בעוד השיטות שפורסמו בעבר 6,10 גנטית להפוך Ostreococcus ידועים במעבדות ספורות בעולם. במאמר זה, את שיטות ניסיוניות גנטית להפוך את יצור דגם הרומן עם ביטוי יתר לבנות באמצעות electroporation מתוארים בפירוט רב, כמו גם את שיטת הכללת תאים טרנספורמציה של אחוז agarose נמוכה על מנת לאפשר בחירה של קווים ששינו שמקורם אחד הפך התא. בעקבות יישום מוצלח של Ostreococcus למחקר היממה, ההתעניינות הגוברת Ostreococcus ניתן לצפות תחומי מחקר מגוונים בתוך ומחוץ מדעי הצמח, כולל בתחומים ביוטכנולוגיים. חוקרים מגוון רחב של מדעים ביולוגיים ורפואיים שעובדים על הביוכימיים המשתמרים לשקול מחקר ב רודף Ostreococcus, ללא המורכבות גנומית האורגניזם המינים מודל גדולים יותר.

Watch this Scientific Journal Video about Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri at JoVE.com

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

מאמר זה מתאר את השינוי הגנטי של unicellular אצה ימית<em&gt; Ostreococcus tauri</em&gt; על ידי electroporation. זה האורגניזם האיקריוטים הוא פלטפורמה מודל יעיל צמחים גבוהים יותר, possesing המורכבות גנומית הסלולר הקטינה באופן משמעותי ולהיות מקובל בקלות לתרבות הן התא וביולוגיה כימית.

שינוי גנטי של Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

Research

JoVE Journal

Biology

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

בידוד של הדנ&quot;א הגנומי של זנבות עכבר

Large Insert Environmental Genomic Library Production

הכנס גדול הסביבה הגנום ספריית הפקה

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

הדור של RNA / DNA כלאיים ב-DNA הגנום על ידי טרנספורמציה באמצעות RNA המכיל oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

Efficient Polyethylene Glycol PEG Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

פוליאתילן גליקול יעיל (PEG) מתווכת טרנספורמציה של מוס Physcomitrella patens</em

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

הגנום MRI - משאב ציבורי עבור לימוד דפוסי בתוך רצף הדנ&quot;א הגנומי

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

לכידה סלקטיבית של 5-hydroxymethylcytosine מהדנ&quot;א הגנומי

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

מערך השוואתי הגנום הכלאה (Array CGH) לאיתור של הגנום גרסאות מספר עותק

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

ממוקד RNA רצף Assay לאפיון ביטוי גנים ושינויים הגנום

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

הכנה והזרקה של עוברים של יתושי קולקס כדי ליצור מוטציות Null באמצעות CRISPR /Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...