Name: genomic transformation of the picoeukaryote ostreococcus tauri
Uploaded: 2012-07-13T13:00:00
Duration: 10 min 45 s
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BBSRCとEPSRC賞D019621によって資金を供給統合システム生物学センターSynthSys。 FYBへエクセレンス &quot;マリンゲノム&quot;助成金EUのFP6ネットワークは、遺伝的形質転換法の開発に資金を提供しています。

1。藻類材料の調製<ol><li> Ostreococcus細胞は 、人工海水（ASW）で培養されています。塩分濃度計を用いて測定された海塩（1リットル当たり典型的には約40グラム）が、pptの30の塩分濃度に脱イオン水に溶解されています。表1-3で説明したように増菌培地11,12、微量金属元素やビタミンが追加されます。メディアは、0.22μmのフィルターを通して、フィルター滅菌します。 </li><li>メンテナンスのため、Ostreococcus株 OTTH95の細胞は新鮮なASW 7日ごとに1/100の希釈で無菌的に継代培養で、ムーンライトブルーフィルターを装備し、植物成長のインキュベーター内で一定の光の下で成長した。光強度に近い20モルm -2 s -1でのあるべきであり、温度を20℃に維持されてい細胞は一定の撹拌を必要としませんが、凝集を防ぐために、2〜3日後に動揺しています。 </li><li>各変換のために、細胞を50mlのセル·ドで必要とされる継代培養後に5-7日間を達成すべきである20から30×10 6 ml -1の 、のnsity。おおよその細胞密度とaxenyは、フローサイトメトリーまたはX40倍率の少なくともhaemocytometerのいずれかを使用して決定することができます。 </li></ol> 2。エレクトロポレーション<ol><li>形質転換用DNAを調製する。各形質転換のために、純粋な、線状化プラスミドDNA5μgを滅菌脱イオン水では1μg/μlの濃度で必要とされています。このDNAを得るために、著者らは他の方法が同様に働くかもしれませんが、キアゲンミディプレップキットを使用することをお勧めします。使用するベクターのバックボーンにカットする酵素ではなく、遺伝子または選択遺伝子でで製品を消化。さらに精製し、エタノール沈殿によって得られた直鎖DNAを集中し、高品質の滅菌脱イオン水の適切な量の製品を再懸濁します。 </li><li>各変換のための5μgのDNAを含むマイクロチューブを準備します。 controないDNAとlが変換される各セルの行が必要です。各変換のための2mmのエレクトロポレーションキュベットと一緒に、氷の上でこれらのチューブを保持します。 </li><li>変換ごとに再懸濁バッファー2.2 mlを準備します。のddH 2 O中1M溶液に溶解させるソルビトール、0.1％プルロニック酸F68とフィルター滅菌を追加します。 </li><li>円錐形の底の50 mlチューブに、最終的な細胞に0.1％の濃度、および10で8000X gで10分間ペレットそれら℃にプルロニック酸F68を追加します。すぐに上下にピペッティングによる再懸濁緩衝液1mlで細胞を再懸濁して、遠心管に移す。 10°Cで8000 xgで10分間スピンダウンし、すぐに作業を、もう一度、この洗浄ステップを繰り返します。 </li><li>カットチップで、再懸濁バッファー40μlで各最終ペレットを再懸濁します。氷の上で線状化DNAのすべてのチューブに再懸濁した細胞の40μlを加え、穏やかに混合し、エレクトロポレーションキュベットに移す。 </li><li> electropにキュベットを入れ演説のマシン。 6 kVのcm -1で 、600Ω、25μFに設定を変更します。細胞をエレクトロポ。 </li><li> 10分間室温でキュベットにelectoporated細胞をインキュベートし、組織培養フラスコを準備するその時間を使用しています。それらにラベルを付け、それぞれに新鮮なASWの30ミリリットルを追加します。各フラスコから1mlを取り出し、優しく対応するキュベットに追加します。 2分間インキュベートし、ゆっくりとASWを削除するには、現在のセルの球を含み、優しくゆっくりと培養フラスコにASWに直接ピペット。 </li><li>細胞は一般的に球に残っています。この瞬間に集約された細胞を振るか、邪魔しないように注意してください。フラスコを振盪することにより再懸濁した後、細胞が1-2時間インキュベーターに回復することができます。この時、細胞は自由に再懸濁するべきでない塊は見えないはずです。インキュベーターで一晩回復するために文化を残す。 </li></ol> 3。半固形培地で細胞をプレートに含めること<ol><li&gt;の次の日は、攪拌棒の入ったボトルでのddH 2 O 2.1％低融点アガロース溶液をオートクレーブします。加熱マグネチックスターラーの上に水を含む大きなビーカーに65から90°Cで溶融保持します。各変換に9 ASWのmlに加えて必要な選択を含む8ペトリ皿（55 mm径）と8×15 mlチューブにそれぞれが準備します。 NourseothricinまたはG418を使用している場合は、2 mg / mlのを使用しています。 </li><li>インキュベーターから形質転換細胞を収集します。滅菌flowhoodで働いて、チューブのいずれかで9ミリリットルを沸騰LMPアガロース1mlを追加します。チューブを閉じ、転倒混和する。その後、新たに形質転換細胞の0.5mlを加え素早く混合し、プレートに注ぐ。残りの7つの管で、このプロセスを繰り返しますし、次の変換フラスコに進みます。 </li><li>アガロースを設定するためのプレートは、時間のフローフード内で開いたまま。その後、プレートを閉じて、4枚それぞれを保持する大きな正方形をペトリ皿にそれらを転送します。正方形のプレートウィットを封印Hパラフィルム。プレートが完全に設定されていないことに注意してください、その結果、ゲルは非常に壊れやすいものです。ケアは、プレートを取り扱う際にはゲルを壊さないように注意する必要があります。インキュベーター内のすべての正方形のプレートを置きます。 </li></ol> 4。形質転換コロニーの選択<ol><li>コロニーは、形質転換プレート上ではなく、モック変換プレート上で10から21日後に表示されます。コロニーを選択するカットオフヒントを200μlのピペットを使用しています。単に自由なコロニーを選択し、緑色のコロニーを吸い出す。近隣のコロニーから任意のセルが含まれていないように注意してください。 </li><li> 24ウェルプレートに、選択を含む液体培地2mlにセルを転送します。 Nourseothricinを使用する場合は、1.75 mg / mlのを使用しています。上下にピペッティングにより混和する。変換ごとに24から50コロニーを選択します。パラフィルムとインキュベータへの転送でプレートをシールします。 </li><li>一週間後、24ウェルプレートの選択で2 mlの新鮮なASWを各ウエルに100μlを転送し、additionaために成長するL 7日。生き残った細胞株は、さらなる研究のために使用することができます。ゲノムおよび挿入数に安定した統合は、PCRおよびサザンブロット法を用いて分析する必要があります。ゲノムDNAは、植物DNA抽出のための任意のダウンスケーリングされた標準的な方法を用いてこれらの目的のために取得することができます。 </li></ol> 5。代表的な結果細胞は、1/100、7日間の成長後、ミリリットルあたり2500万個の細胞密度に達して分割します。適切な設定を持つ細胞のエレクトロポレーションは、時定数10〜14ミリ秒となりました。細胞は培養フラスコに培地に移している場合、セルの球を形成する必要があります。軽く時間後に振とうした場合、細胞が容易に懸濁する必要があります。 0.2％LMP寒天に1ミリリットルの形質転換細胞の包含は、一貫しただけの半固体ゲルになるはずです。コロニーは10から21日後に表示されます。変換ごとに上記のプロトコルを使用して線状化DNAの5μgを変換し、50から100コロニープレートは、通常、負の制御プレート上なしと比べ、期待されていた。 〜選んだコロニーの80％が積極的に液体培地に抗生物質耐性によって選択されたと、その後の研究で使用されていた。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 最終濃度 </td><td> ストック溶液 </td><td> 1リットルのボリューム </td></tr><tr><td> NaNO 3を </td><td> 8.83×10 -4 M </td><td> 75グラム/ LのdH 2 O </td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td> NH 4 Clを</td><td> 3.63×10 -5 M </td><td> 2.68グラム/ LのdH 2 O </td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td> β-グリセロリン酸</td><td> 1×10 -5 M </td><td> 2.16グラム/ LのdH 2 O </td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td> H 2 SEO 3 </td><td> 1×10 -8 M </td><td> 1.29 mg / LでのdH 2 O </td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td>トリスベース液（pH7.2） </td><td> 1×10 -3 M </td><td> 121.1グラム/ LのdH 2 O </td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td> K微量金属溶液</td><td></td><td>表2 </td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td> f / 2のビタミン溶液</td><td></td><td>表3 </td><td> 0.5 mLの</td></tr></tbody></table> 表1。 Oの成長のための培地成分タウリ 11、12は 30 pptの塩分に人工海水1リットルの総量を確認し、示されているようにストック溶液から上記のコンポーネントを追加します。週間以内に培地および使用をフィルター滅菌する。ビタミン溶液を除くすべての化合物のストックは、媒体のすべてのリットルのこの溶液6mlを追加するためにプールすることができます。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 最終濃度 </td><td> ストック溶液 </td><td> 1リットルの金額 </td></tr><tr><td>のNa 2 </sUB&gt; EDTA•2H 2 O </td><td> 1×10 -4 M </td><td></td><td> 41.6グラム</td></tr><tr><td>のFeCl 3•6H 2 O </td><td> 1×10 -5 M </td><td></td><td> 3.15グラム</td></tr><tr><td>のNa 2たMoO 4•2H 2 O </td><td> 1×10 -8 M </td><td> 6.3グラム/ LのdH 2 O </td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td>硫酸亜鉛4•7H 2 O </td><td> 1×10 -9 M </td><td> 22.0グラム/ LのdH 2 O </td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td>のCoCl 2•6H 2 O </td><td> 1×10 -9 M </td><td> 10.0グラム/ LのdH 2 O </td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td>のMnCl 2•4H 2 O </td><td> 1×10 -8 M </td><td> 180.0グラム/ LのdH 2 O </td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td>のCuSO 4•5H 2 O </td><td> 1×10 -8 M </td><td> 9.8グラム/ LのdH <sub&gt; 2 O </td><td> 1 mLの</td></tr></tbody></table> 表2。金属溶液11,12をトレースします 。のdH 2 Oで1リットルの合計、および溶解する熱に構成しています。ストレージ用に小分け液と凍結。最終濃度は、最終的な培地ではなく、微量金属溶液を参照して示された。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 最終濃度 </td><td> ストック溶液 </td><td> 1リットルの金額 </td></tr><tr><td>ビタミンB 12 </td><td> 1×10 -10 M </td><td> 1グラム/ LのdH 2 O </td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td>ビオチン</td><td> 1×10 -9 M </td><td> 0.1グラム/ LのdH 2 O </td><td> 10 mLの</td></tr><tr><td>チアミン塩酸• </td><td> 1×10 -7 M </td><td></td><td> 200 mgの</td></tr></tbody></table> 表3。 F / 2ビタミン溶液11のdH 2 O、フィルター滅菌し、分注し、凍結で1リットルの合計を最大にします。最終濃度は、最終的な培地ではなく、ビタミン溶液を参照して示された。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig1.jpg" /> 図1。変換手順のグラフィカルな概要。遺伝的エレクトロポレーションによってOstreococcusタウリ型を変換する手順の模式図。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig2.jpg" /> 図2。培養増殖。細胞は7日ごとに新鮮なASWの1/100の希釈で無菌的に継代培養であり、インキュベーターがムーンライトブルーフィルタを装着し、植物の成長に一定の光の下で成長した。光強度に近いから20マイクロモルm -2 s -1である必要があり、温度を20℃に維持するC細胞は、一定の撹拌を必要としますが、sではありません凝集を防ぐために2〜3日おきに一度ハーケン。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig3.jpg" /> 図3。 0.2パーセントLMPアガロース大きな正方形のペトリ皿に転送4プレート、パラフィルム（左上）とシールのコロニー形成 。コロニーが形成されている場合は、単にフリー（理想的には円錐形）コロニー（右上）を選択し、P200のピペットを用いてプレートからそれらを吸う。ネガティブコントロール（右下）にはコロニーがあってはなりません。

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	<li>Derelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+analysis+of+the+smallest+free-living+eukaryote+Ostreococcus+tauri+unveils+many+unique+features.">Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).</li><li>Henderson, G. P., Gan, L., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+ultrastructure+of+O.+tauri:+electron+cryotomography+of+an+entire+eukaryotic+cell.">3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell.</a> PLoS One. 2, e749 (2007).</li><li>O'Neill, J. 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利害の衝突が宣言されません。

細胞の状態や文化axenyは、変換手順については、非常に重要である。細胞は通常、光12時間のサイクルで維持されていますが、12時間暗、これらの条件下で培養した細胞の形質転換効率が不十分であることが判明した。繰り返しペレット化/再懸濁ステップ中に、細胞は常に容易に再懸濁する必要があります。細胞の集合体、あるいは粘液様物質が存在する場合は、再度最初から手順を開始することをお勧めします。通常は、〜50のコロニーがネガティブコントロールのプレート上なしと比べ、各形質転換プレートに期待することができます。低い形質転換効率の場合には、培養条件は細胞が最適な状態であることを確認するために変更する必要があります。形質転換効率に影響を与える変数は、周囲の研究室の温度（に近い20°Cなければなりません）と処理速度（ペレット化細胞からの手順[2.3]回復[2.7]〜1時間を取るべきであるから）が含まれています。それはまた重要であるすべてのソリューション再は、各変換の前に新鮮ました。プレートに含めるために、LMPアガロースの濃度が非常に重要です。Ostreococcus細胞が高いアガロース濃度で成長せず、低濃度で拡散します。 Ostreococcusの3つの形質転換ベクターは、以前6公開されており、より多くのベクトルが生成され、まもなく公開されることが期待されています。既存のベクトルポットリュック6 Potoxベクトル6 Ostreococcusから採取した強力な誘導13プロモーターを運ぶのに対し、高速なトランスジェニックラインの選択に加えて扱いやすいの発現パターンを可能にするC-末端ホタルルシフェラーゼタグとの組み合わせで、任意のプロモーターを使用することができます目的の遺伝子の過剰発現に対する高親和性リン酸トランスポーター（HAPT）遺伝子。 Potox-Lucのベクトルが過剰発現株の間接的な選択のために使用できる追加のルシフェラーゼマーカーを運ぶ、Potoxから派生<s14&gt;まで。これらのベクトルに成功した選択マーカーはNourseothricinとG148があります。しかし、Ostreococcus細胞は多くの抗生物質に対して非常に耐性があり、トランスジェニックOstreococcus細胞の選択のために必要な化合物の濃度は、従来のモデルシステム（2 mg / ml）をより高くなっています。 プロセスが非効率に見えますが、この手順に必要な細胞とプラスミドDNAの大規模な数は有意な障害をもたらしません。大きな制限は、選択マーカーに耐性のあるすべての生成された行は、全体構造がDNAに組み込まれていることを確認するために個別に分析する必要があるということです。我々は、選択マーカーの正常な発現は、興味のある実際の遺伝子の挿入に対応していませんでした例を観察している、すなわち部分的な統合が発生する可能性があります。明らかに、ゲノムにランダムに挿入すると、このメソッドを使用して、挿入部位のないコントロールが存在しないことを意味し、メソッドB相同組換えにasedは、現在開発されています。しかし、ここで説明するメソッドは、現在、私たちの最善の知識に、遺伝子組み換えOstreococcus細胞を生成するための唯一の特徴とする方法である。 Ostreococcusタウリはごく最近の実験モデル生物として使用されているように、これらの細胞で働くほとんどのメソッドは進化する可能性があると関わって成長している研究コミュニティによって洗練される。このプロトコルは、人々がOstreococcusで作業を開始する際に役立ちますが、決してこの藻類のゲノム変換について知っているそこにあるすべてを説明するために主張されています。読者はインキュベーターの小さな違い（光のレベルまたは質）およびその他のパラメータが存在し、おそらくこのために必要な健康文化を得るためにすべての個々の研究室で最適化する必要がありますので、自分のニーズに合わせて、このプロトコルを適応させることができると著者らは、信頼プロトコル。マスタリング後の技術は、ここで説明するベクターは、プロモーターの範囲の制御下で発光、蛍光、またはその他のタグ融合行を生成するように構築することができます。このエキサイティングな新しい実験プラットフォームは、どのように複雑な生化学的な問題を勉強するために有用であろう薬理学的ア ​​プローチは、非常に3を容易にされている、複雑さの低減の真核生物で解決されています。

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 培地成分 </td></tr><tr><td> 化学物質 </td><td colspan="2" > カタログ番号 </td><td> サプライヤー </td></tr><tr><td>インスタントオーシャンマリンソルト</td><td colspan="3">から<a href="http://amazon.co.uk" target="_blank">amazon.co.uk</a>または<a href="http://rocketaquatics.co.uk" target="_blank">rocketaquatics.co.uk</a> </td></tr><tr><td> NaNO 3を </td><td colspan="2"> S5506-250G </td><td>シグマ</td></tr><tr><td> NH 4 Clを</td><td colspan="2"> A9434-500G </td><td>シグマ</td></tr><tr><td>グリセロール-2 - リン酸二ナトリウム塩水和物</td><td colspan="2"> G9422-100G </td><td>シグマ</td></tr><tr><td> H 2 SEO 3 </td><td colspan="2"> 84920-250G </td><td>シグマ</td></tr><tr><td>超純粋なトリス</td><td colspan="2"> 15504-020 </td><td>インビトロジェン</td></tr><tr><td>のNa 2 EDTA•2H 2 O </td><td colspan="2"> BPE120-500G </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td></tr><tr><td>のFeCl 3•6H 2 O </td><td colspan="2"> 157740 </td><td>シグマ</td></tr><tr><td>のNa 2たMoO 4•2H 2 O </td><td colspan="2"> 31439-100G-R </td><td>シグマ</td></tr><tr><td>硫酸亜鉛4•7H 2 O </td><td colspan="2"> Z0251 </td><td>シグマ</td></tr><tr><td>のCoCl 2•6H 2 O </td><td colspan="2"> 31277 </td><td>シグマ</td></tr><tr><td>のMnCl 2•4H 2 O </td><td colspan="2"> 203734-5G </td><td>シグマ</td></tr><tr><td>のCuSO 4•5H 2 O </td><td colspan="2"> C8027 </td><td>シグマ</td></tr><tr><td>ビタミンB 12（シアノコバラミン） </td><td colspan="2"> V2876 </td><td>シグマ</td></tr><tr><td>ビオチン</td><td colspan="2"> 47868 </td><td>シグマ</td></tr><tr><td>チアミン塩酸• </td><td colspan="2"> T4625 </td><td>シグマ</td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td colspan="2"> A9518-25G </td><td>シグマ</td></tr><tr><td>ネオマイシン</td><td colspan="2"> N6386 </td><td>シグマ</td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td colspan="2"> K4000 </td><td>シグマ</td></tr><tr><td colspan="4"> 培養用消耗品 </td></tr><tr><td colspan="2"> アイテム </td><td> カタログ番号 </td><td> サプライヤー </td></tr><tr><td colspan="2">チャンネルを注ぐと通気組織培養フラスコT25懸濁培養</td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2">チャンネルを注ぐと通気組織培養フラスコT75懸濁培養</td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedトン</td></tr><tr><td colspan="2">チャンネルを注ぐと通気組織培養フラスコT175懸濁培養</td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> TPPボトルトップフィルター、1L、完全な</td><td> 99950T </td><td>バイオヘレナ</td></tr><tr><td colspan="2"> TPPボトルトップフィルター、500ミリリットル、 </td><td> 99500T </td><td>バイオヘレナ</td></tr><tr><td colspan="2"> TPPボトルトップフィルター、250ミリリットル、 </td><td> 99250T </td><td>バイオヘレナ</td></tr><tr><td colspan="2"> TPPボトルトップフィルター、150ミリリットル、 </td><td> 99150T </td><td>バイオヘレナ</td></tr><tr><td colspan="2">海洋水族館のための塩分計</td><td> DSG-10 </td><td> Daeyoon </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="3" > 変換のための化学物質 </td></tr><tr><td> 化学物質 </td><td> カタログ数</td><td> サプライヤー </td></tr><tr><td> D-ソルビトール</td><td> S6021-1KG </td><td>シグマ</td></tr><tr><td>プルロニックF-68ソリューション</td><td> P5556-100ML </td><td>シグマ</td></tr><tr><td> ClonNat </td><td> 51000 </td><td>ウェルナー</td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td> 16520-050 </td><td>インビトロジェン</td></tr><tr><td colspan="3"> 変換のための消耗品 </td></tr><tr><td> アイテム </td><td> カタログ番号 </td><td> サプライヤー </td></tr><tr><td>チャンネルを注ぐと通気組織培養フラスコT25懸濁培養</td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td>チャンネルを注ぐと通気組織培養フラスコT75懸濁培養</td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td>組織培養フラスコT175サスペンションのCu注ぐチャンネルで通気ltures </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td>グライナー遠心管を50ミリリットル</td><td> 227261 </td><td> GBO </td></tr><tr><td>ジーンパルサー/ MicroPulserキュベットは0.2 cmのギャップ、50 </td><td> 165-2086 </td><td>バイオ·ラッド</td></tr><tr><td>ペトリ皿の丸いPS 3通気孔H14.2Φ55 </td><td> 391-0895 </td><td> VWRインターナショナル</td></tr><tr><td>照射明確な120ミリメートルによって滅菌4口のポリスチレンとペトリ皿の正方形</td><td> FB51788 </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td></tr><tr><td>ムーンライトブルー光フィルター</td><td> 183 </td><td>イ·照明</td></tr></tbody></table>

genomic transformation of the picoeukaryote ostreococcus tauri

植物科学の急速な進歩を妨げる一般的な問題は、細胞、組織および生物全体の複雑さ、および高等植物の簡単な遺伝学に影響を与えるゲノムの冗長性の特に高いレベルが含まれています。小説のモデル生物Ostreococcusタウリ型は、日付に知られている最小の自由生活真核生物であり、大幅に減少ゲノムサイズと細胞の複雑さの1,2を有しており 、あたりほとんどの細胞小器官の一つの存在（ミトコンドリア、葉緑体、ゴルジスタック）によって明らかにセル、唯一の〜8000の遺伝子を含むゲノム。さらに、unicellularityと容易に文化の組み合わせは、ケミカルバイオロジー的アプローチの影響を受けやすいプラットフォームを提供します。最近、Ostreococcusが正常に概計時3-6基礎となる基本的なメカニズムを研究するために採用されている。このモデル生物からの結果は、植物科学だけでなく、哺乳類の生物学7だけでなく、影響を与えています。この例は、どのように迅速な実験に焦点を当て緑系統からの単純な真核生物は、複雑さの低減のこの背景には技術的に可能な方法を使用して検証可能な仮説を生成することによって、より複雑な生物の研究を加速することができます。ゲノムや遺伝子を変更する可能性の知識はすべてのモデル種で欠かせないツールです。遺伝的Ostreococcusを変換する以前に報告された方法6,10は世界でも数少ない研究室によく知られているのに対し、ゲノムの1、トランスクリプトーム8、この種のプロテオミクス9については、自由に利用可能です。 この記事では、遺伝的に過剰発現してこの小説のモデル生物を変換するための実験方法はから発信された変換線の選択を可能にするためにエレクトロポレーションを用いて詳細に説明されて、同様に低い割合アガロースで形質転換細胞の封入の方法で構築する単一の形質転換細胞。 Ostreocoの成功したアプリケーションは、次概日リズムの研究にccus、Ostreococcusへの関心の高まりは、バイオテクノロジーの領域を含む植物科学、内と外の多様な研究分野から期待することができます。保存された生化学的経路上で動作生物学および医学の広い範囲から研究者が大規模なモデル生物種のゲノムと生物複雑性から自由に、Ostreococcusの研究を追求すると考えるかもしれません。

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Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

この資料では、単細胞の海藻の遺伝的形質転換を説明<em&gt; Ostreococcusタウリ</emエレクトロポレーションによる&gt;。この真核生物では、大幅に減少し、ゲノムと細胞の複雑さを憑依し、細胞培養と化学生物学の両方に容易に従順され、高等植物のための有効なモデルのプラットフォームです。

Picoeukaryoteのゲノム形質転換<em&gt; Ostreococcusタウリ</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

マウスの尾からのゲノムDNAの単離

生物学

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

大規模な挿入環境ゲノムライブラリーの製造

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

RNAを含むオリゴヌクレオチドを​​使用して変換によるゲノムDNAのRNA / DNAハイブリッドの世代

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

ゲノムMRI - ゲノムDNA内の配列パターンを研究するためのパブリックリソース

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

バーコード酵母ライブラリーの競争力のあるゲノム画面

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

ゲノムDNAから5  - ヒドロキシの選択的捕獲

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

ゲノムコピー数変異体の検出のためのアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（アレイCGH）

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

遺伝子発現およびゲノム変化を特徴づけるために、RNAシーケンシングアッセイをターゲットに

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

CRISPR/Cas9を使用してヌル突然変異を生成するための Culex 蚊の胚の調製と注入

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...