Name: genomic transformation of the picoeukaryote ostreococcus tauri
Uploaded: 2012-07-13T13:00:00
Duration: 10 min 45 s
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BBSRC과 EPSRC 수상 D019621에 의해 자금 지원 통합 시스템 생물학을위한 센터 SynthSys. FYB에 우수 &#39;마린 지​​노 믹스 &quot;보조금의 유럽 연합 (EU) FP6 네트워크는 유전자 변형 방법의 개발 자금을하고있다.

1. Algal 재료의 준비 <ol><li> Ostreococcus 전지는 인공 해수 (ASW)에서 배양해 있습니다. 바다 소금이 (리터당 일반적으로 약 40g) 30의 염분에 deionised 물속에 녹아있다 PPT 등 염도 측정기를 사용하여 측정. 1-3 테이블에 설명된대로 농축 매체 11,12, 미량 금속 원소와 비타민이 추가됩니다. 미디어는 0.22 μm의 필터를 통해 다음 필터 소독입니다. </li><li> 유지 보수의 경우 Ostreococcus 변형 OTTH95의 세포는 신선한 ASW 매 7 일 이내에 1백분의 1의 희석에 무균 하위 교양이며, 문라이트 블루 필터를 들으며 식물 성장 배양기에서 지속적인 불빛 아래에서 성장. 광 강도 가까운 20 μmol m -2 s의 -1에 있어야하며 온도는 20 ° C.에서 관리하고 있습니다 세포는 지속적인 교반이 필요하지 않지만 모든 2-3일가 집계를 방지하기 위해 한 번 흔들리고있다. </li><li> 각 변환의 경우 세포의 50 ML는 셀 드에 필요합니다하위 culturing 따라 5-7일 획득하여야 20-30 X 10 6 ML -1의 nsity. 대략 셀 밀도와 axeny는 x40의 배율의 최소한 유동세포계측법 또는 혈구계 중 하나를 사용하여 확인할 수 있습니다. </li></ol> 2. Electroporation <ol><li> 변환을 위해 DNA를 준비합니다. 각 변환의 경우 순수한 플라스미드 DNA를 linearised 5 μg은 멸균 deionised 물 1 μg / μl의 농도가 필요합니다. 다른 방법은 동일하게 잘 작동 수도 있지만이 DNA를 얻으려면, 저자, Qiagen MIDI 준비 키트를 사용하는 것이 좋습니다. 사용된 벡터의 중추에서 차단 된 것을 효소 아니라 transgene 또는 선택 유전자와 제품을 소화. 또한 정화 및 에탄올 침전에 의해 결과로 선형 DNA를 집중하고, 고품질 무균 deionised 물의 적절한 볼륨의 제품을 resuspend. </li><li> 각 변형에 5 μg의 DNA를 포함하는 microcentrifuge 튜브를 준비합니다. contro각 세포주를 변환할 수 있도록없이 DNA와 나 필요합니다. 각각의 변환을위한 2 밀리미터의 electroporation cuvette과 함께 얼음이 튜브를 유지. </li><li> 변환 당 resuspension 버퍼의 2.2 ML을 준비합니다. ddH 2 O에서 1 M 솔루션에 대한 Sorbitol 디졸브, 0.1 %의 pluronic 산 F68 및 필터 - 소독을 추가합니다. </li><li> 원뿔 바닥과 50 ML 관에 최종 세포에 0.1 %의 농도 및 10에서 8000x g에서 10 분 펠릿 그들 ° C로 pluronic 산 F68을 추가합니다. 즉시 아래로 pipetting 및하여 resuspension 버퍼 1 ML에서 세포를 resuspend하고 microfuge 튜브로 전송할 수 있습니다. 10 ° C에서 8,000 XG에 10 분 동안 다운 던가, 그리고 신속하게 작업을 한번 더이 세차 단계를 반복하십시오. </li><li> 컷 팁으로 resuspension 버퍼의 40 μl 각 최종 펠렛을 resuspend. 얼음 linearised DNA의 모든 튜브에 resuspended 세포의 40 μl를 추가, 부드럽게 믹스 앤 electroporation의 cuvette에 전송할 수 있습니다. </li><li> electrop에 cuvette을 넣고연설 기계. 6 kV cm -1, 600 Ω, 25 μF로 설정을 변경합니다. 세포를 Electroporate. </li><li> 10 분 동안 상온에서 cuvettes의 electoporated 세포를 부화하고, 조직 문화 flasks를 준비하는 그 시간을 사용합니다. 그들을 분류하고 각각 신선한 ASW의 30 ML에 추가합니다. 각 플라스크 1 ML을 타고 부드럽게 해당 cuvette에 추가합니다. 2 분 동안 품어 부드럽게 ASW을 제거, 지금 부드럽게 세포의 작은 구체를 포함하고 천천히 문화 플라스크에 ASW에 직접 피펫. </li><li> 세포는 일반적으로 소구에 남아 있습니다. 이 순간 집계 세포를 흔들거나 방해하지 않도록주의를 기울입니다. 세포 1-2 시간 동안 인큐베이터에 복구하도록 허용 후 flasks 흔들어하여 resuspend. 이때 세포 자유롭게 resuspend해야하며 어떤 대단히 짧은 볼 수 없습니다. 배양기에서 하룻밤 복구하는 문화를 남겨주세요. </li></ol> 3. 세미 솔리드 중간에있는 접시에 세포의 포함 <ol><lI&gt; 그 다음날에, 저어 막대가 들어있는 병에 ddH 2 O의 2.1 % 낮은 용융 점 아가로 오스의 솔루션을 압력솥. 가열 자기 활동가에 물이 들어있는 큰 비커에 65-90 ° C에서 용융 유지. 각각의 변환 9 ASW의 ML 플러스 필요한 선택을 포함하는 8 페트리 요리 (55 밀리미터 직경), 8 X 15 ML 튜브 각각 준비합니다. Nourseothricin 또는 G418를 사용하는 경우, 2 밀리그램 / ML을 사용합니다. </li><li> 인큐베이터에서 변형 세포를 수집합니다. 멸균 flowhood에서 근무, 튜브 하나에 9 ML에 끓는 LMP 아가로 오스의 1 ML을 추가합니다. 튜브를 닫고 반전으로 섞는다. 그런 다음, 갓 변형 세포의 0.5 ML을 추가 신속하게 믹스 앤 접시에 붓는다. 나머지 7 튜브와 함께이 과정을 반복하고 다음 변환 플라스크로 진행합니다. </li><li> 아가로 오스가 설정하기 위해 번호판, 1 시간 동안 유동 후드에서 열어 둡니다. 그런 다음 접시를 닫고 4 접시를 각각 개최됩니다 커다란 사각형 배양 접시에 그들을 전송합니다. 사각형 접시의 지혜를 밀봉H parafilm. 접시가 완전히 설정되지 않습니다, 그리고 그 결과로 젤은 매우 불안정합니다. 케어는 접시를 다룰 때 젤을 깰하지 않도록 촬영해야합니다. 인큐베이터에있는 모든 사각형 접시를 놓습니다. </li></ol> 4. 변환 콜로니의 선택 <ol><li> 식민지가 변환 접시에 10~21일 후 아니라 모의 변형 접시에 나타납니다. 식민지 컷 - 오프 조언과 함께 200 μl 피펫을 사용하여 선택합니다. 간단하게 무료로 식민지를 선택하고 녹색 식민지를 빨아. 인근의 식민지에서 모든 세포를 포함하면 안됩니다. </li><li> 24 우물 판에, 선택을 포함하는 액체 매질의 2 ML로 세포를 전송합니다. Nourseothricin을 사용할 때, 1.75 밀리그램 / ML을 사용합니다. 아래로 pipetting 및하여 섞는다. 변환 당 24-50 식민지를 선택합니다. parafilm 및 보육에 대한 전송과 함께 번호판을 밀봉합니다. </li><li> 일주일 후, 24 웰스 플레이트의 선택과이 ML 신선한 ASW 각도 100 μl를 전송하고 additiona위한 성장리터 칠일. 살아남은 세포 라인들은 더욱 연구에 사용될 수 있습니다. 게놈 및 삽입 숫자로 안정적인 통합은 PCR 및 남부 얼룩을 사용하여 분석해야한다. 게놈 DNA가 식물의 DNA 추출을위한 다운 스케일 표준 방법을 사용하여 이러한 목적을 위해 얻을 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 셀 1 / 100은 7 일 동안 성장 후 밀리리터 당 25,000,000 세포 밀도에 도달 나누었습니다. 적절한 설정으로 세포 Electroporation은 시간 상수를 10 ~ 14 밀리초 결과. 세포 배양 flasks의 매체로 전송하면, 세포의 소구가 형성됩니다. 가볍게 시간 이후에 떨면서 때, 세포는 쉽게 resuspend한다. 0.2 % LMP 한천 개를 1 ML 변형 세포의 포함은 일관되지만 세미 솔리드 겔을 초래한다. 식민지는 10-21일 후에 나타납니다. 변환 당 위의 프로토콜을 사용 linearised DNA 5 μg를 변형, 50-100 식민지번호판은 일반적으로 부정적인 컨트롤 플레이트 함 비해, 예상되었다. ~ 고른 식민지의 80 %가 긍정적으로 액체 매질에서 항생제 저항에 의해 선정되었으며 후속 연구에 사용되었다. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 최종 농도 </td><td> 증권 솔루션 </td><td> 1리터위한 볼륨 </td></tr><tr><td> 나노 3 </td><td> 8.83 × 10 -4 M </td><td> 75g / L DH 2 O </td><td> 한 ML </td></tr><tr><td> NH 4 망할 CIA </td><td> 3.63 × 10 -5 M </td><td> 2.68 G / L DH 2 O </td><td> 한 ML </td></tr><tr><td> β-glycerophosphate </td><td> 1 × 10 -5 M </td><td> 2.16 G / L DH 2 O </td><td> 한 ML </td></tr><tr><td> H 2 SEO 3 </td><td> 1 × 10 -8 M </td><td> 1.29 MG / L DH 2 O </td><td> 한 ML </td></tr><tr><td> 트리스베이스 (산도 7.2) </td><td> 1 × 10 -3 M </td><td> 121.1 g / L DH 2 O </td><td> 한 ML </td></tr><tr><td> K 추적 금속 용액 </td><td></td><td> 표 2 </td><td> 한 ML </td></tr><tr><td> F / 2 비타민 용액에게 </td><td></td><td> 표 3 </td><td> 0.5 ML </td></tr></tbody></table> 표 1. O에의 성장을위한 매체 성분 타우 리 11, 12. 30 PPT의 염분에 인공 해수 1 리터 총 볼륨을 확인하고 표시로 주식 솔루션에서 위의 구성 요소를 추가합니다. 주내 매체 및 사용을 필터링 - 소독. 비타민 솔루션을 제외한 모든 화합물의 주식은 매체의 모든 리터를 위해이 솔루션 중 6 ML을 추가할 풀링된 수 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 최종 농도 </td><td> 증권 솔루션 </td><td> 1리터에 대한 금액 </td></tr><tr><td> 나이 </sUB&gt; EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) • 2 시간 2 O </td><td> 1 × 10 -4 M </td><td></td><td> 41.6 g </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td> 1 × 10 -5 M </td><td></td><td> 3.15 g </td></tr><tr><td> 나 2 무 4 • 2 시간 2 O </td><td> 1 × 10 -8 M </td><td> 6.3 G / L DH 2 O </td><td> 한 ML </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td> 1 × 10 -9 M </td><td> 22.0 g / L DH 2 O </td><td> 한 ML </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6H 2 O </td><td> 1 × 10 -9 M </td><td> 10.0 g / L DH 2 O </td><td> 한 ML </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td> 1 × 10 -8 M </td><td> 180.0 g / L DH 2 O </td><td> 한 ML </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td> 1 × 10 -8 M </td><td> 9.8 G / L DH <sub&gt; 2 O </td><td> 한 ML </td></tr></tbody></table> 표 2. 금속 용액 11,12를 추적. DH 2 O 1 리터의 총, 그리고 해산하는 열을까지합니다. 저장 나누어지는 솔루션 및 동결. 최종 농도는 최종 매체가 아닌 추적 금속 솔루션을 참조하십시오 지적했다. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 최종 농도 </td><td> 증권 솔루션 </td><td> 1리터에 대한 금액 </td></tr><tr><td> 비타민 B 12 </td><td> 1 × 10 -10 M </td><td> 1g / L DH 2 O </td><td> 한 ML </td></tr><tr><td> 비오틴 </td><td> 1 × 10 -9 M </td><td> 0.1 G / L DH 2 O </td><td> 10 ML </td></tr><tr><td> 티아민 • HCL </td><td> 1 × 10 -7 M </td><td></td><td> 200 MG </td></tr></tbody></table> 표 3. F / 2비타민 용액 11. DH 2 O, 필터 소독, 나누어지는 및 동결 1 리터의 총까지합니다. 최종 농도는 최종 매체가 아닌 비타민 솔루션을 참조하십시오 지적했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig1.jpg" /> 1 그림. 변환 절차의 그래픽 개요가. 유전자 electroporation에 의해 Ostreococcus 타우 리를 변환하기위한 절차의 도식 표현. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig2.jpg" /> 그림 2. 문화의 성장. 세포는 신선한 ASW의 1백분의 1의 희석 매 7 일마다에서 무균 하위 교양이며, 문라이트 블루 필터를 들으며 식물 성장 배양기에서 지속적인 불빛 아래에서 성장. 광 강도 가까운 20 μmol m -2의 -1과 온도 ° C의 세포가 일정한 교반이 필요하지 않은 20에서 관리하고 있습니다 있겠지만의 위치해야합니다집합을 방지하기 위해 모든 2-3일 회 haken. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig3.jpg" /> 그림 3. 0.2 % LMP 아가로 오스의 콜로니 형성. 큰 사각형 배양 접시에 전송 4 접시, 그리고 parafilm (맨 왼쪽)과 인감. 콜로니가 형성되면, 단순히 무료 (이상적으로 conically 모양의) 식민지 (오른쪽 위)를 선택하고 p200의 피펫과 접시 밖으로 빨아. 부정적인 컨트롤 (오른쪽 하단)에는 식민지이 없어야합니다.

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	<li>Derelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+analysis+of+the+smallest+free-living+eukaryote+Ostreococcus+tauri+unveils+many+unique+features.">Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).</li><li>Henderson, G. P., Gan, L., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+ultrastructure+of+O.+tauri:+electron+cryotomography+of+an+entire+eukaryotic+cell.">3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell.</a> PLoS One. 2, e749 (2007).</li><li>O'Neill, J. 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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

세포 주 및 문화 axeny은 변환 과정에 중요한 중요하다. 세포는 일반적으로 빛의 12 시간주기에서 유지되고 있지만, 12 시간 어둡고, 이러한 조건 하에서 성장 세포의 변환 효율이 부족한 것으로 밝혀졌다. 반복 pelleting / resuspension 단계 동안, 세포는 항상 쉽게 resuspend한다. 세포의 집계, 또는 가래 같은 물질이 존재할 경우, 다시 처음부터 절차를 시작하는 것이 좋습니다. 일반적으로 ~ 50 콜로니는 부정적인 컨트롤 접시 없음 비해, 각 변환 접시에 기대할 수 있습니다. 낮은 변환 효율 경우에는 culturing 조건은 세포가 최적의 상태에 있도록 다양한되어야합니다. 변환 효율에 영향을 미치는 변수는 주위 실험실에서 온도 (주변 20 ° C로 함) 및 처리 속도를 (세포에게 [2.3] 회복에 대한 [2.7]을 pelleting의 절차 ~ 1 시간 정도 소요됩니다)가 있습니다. 그것은 또한 중요하다 모든 솔루션다시 각각의 변형 전에 신선했다. 접시에 포함시킬 경우, LMP 아가로 오스의 농도는 Ostreococcus 전지는 높은 아가로 오스의 농도에서 성장하지 않습니다. 중요하고, 낮은 농도로 확산됩니다. Ostreococcus 위해 만세 변환 벡터는 이전에 다음 여섯 출판되었으며, 더 많은 벡터가 생성하고 곧 출판할 예정이다. Potox 벡터 6 Ostreococcus에서 촬영한 강력한 inducible 13 promotor를 전해준 반면 기존의 벡터 주전자 룩 6, 빠른 유전자 변형 라인 선택 플러스 다루기 쉬운 표현 패턴을 허용 C-단자 반딧불 루시페라제 태그와 함께 선택의 promotor의 사용을 허용 관심있는 유전자의 overexpression에 대한 고친 화성 인산 수송 (HAPT) 유전자. Potox 룩 벡터는 overexpression 라인 간접 선택에 사용할 수있는 추가 루시페라제 마커를 들고, Potox에서 유래 <s14&gt;까지. 이러한 벡터에 대한 성공적인 선택 마커 Nourseothricin와 G148입니다. 그러나 Ostreococcus 세포는 여러 항생제에 높은 내성이며, 유전자 변형 Ostreococcus 전지의 선정에 필요한 화합물의 농도는 기존 모델 시스템 (2 밀리그램 / ML)에 비해 높다. 프로세스가 비효율적 보이지만 세포이 절차에 필요한 플라스미드 DNA의 다수는 더 큰 장애물을 포즈 없습니다. 큰 제한은 선택 마커에 강한있는 모든 생성된 라인 전체 구조는 DNA에 통합되어 있는지 확인하기 위해 개별적으로 분석해야한다는 것입니다. 우리는 선택할 수있는 마커를 성공적으로 표현 관심의 실제 유전자의 삽입에 해당하지 않은 것들에 예제를 감찰하러 온 적도, 즉 부분적인 통합이 발생할 수 있습니다. 결국, 게놈에 무작위로 삽입도이 방법을 사용하여 삽입 사이트에 대한 통제가 없다는 것을 의미하고, 방법 B동종 재조합에 ased 현재 개발되고있다. 그러나, 방법은, 우리의 가장 중요한 지식까지, 여기 유전자 변형 Ostreococcus 세포를 생성하는 현재 유일한 특성화 방법을 설명했다. Ostreococcus 타우 리가 최근에 실험적인 모델 생물로 사용되고 마찬가지로,이 전지 작업에 대부분의 방법은 진화와 관련된 성장 연구 커뮤니티에 의해 세련되지 가능성이 높습니다. 이 프로토콜은 사람들이 Ostreococcus 함께 작업을 시작할 수 있도록하기위한, 그런데 방법으로이 microalga의 게놈 변이에 대해 알고있다 모두를 설명하는 데 있다고 주장한다. 독자가 작은 incubators의 차이 (조명 수준이나 품질) 및 기타 매개 변수가 존재합니다로서 자신의 요구에이 프로토콜을 적응하고 가능성이 필요한 건강한 문화를 얻기 위해 모든 개별 연구실에 최적화해야 할 수있을 것이라고 저자 신뢰 프로토콜. 습득 후 기술, 여기에 설명된벡터는 promotors의 범위의 통제하에 발광, 형광 또는 기타 태그가 퓨전 라인을 생성하는 건설 수 있습니다. 이 흥미 진진한 소설의 실험 플랫폼은 복잡한 생화 학적 문제 pharmacological 접근은 고도 3 촉진되는 감소 복잡도의 진핵세포 생물에서 해결하는 방법을 공부하는 것이 유용할 것이다.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 중간 성분 </td></tr><tr><td> 화학 </td><td colspan="2" > 카탈로그 번호 </td><td> 공급 </td></tr><tr><td> 인스턴트 오션 마린 솔트 </td><td colspan="3"> 에서 <a href="http://amazon.co.uk" target="_blank">amazon.co.uk</a> 또는 <a href="http://rocketaquatics.co.uk" target="_blank">rocketaquatics.co.uk</a> </td></tr><tr><td> 나노 3 </td><td colspan="2"> S5506-250G </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> NH 4 망할 CIA </td><td colspan="2"> A9434-500G </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> 글리세롤 2 - 포스 페이트 나트륨 소금 하이드 레이트 </td><td colspan="2"> G9422-100G </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> H 2 SEO 3 </td><td colspan="2"> 84920-250G </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> 울트라 순수 트리스 </td><td colspan="2"> 15504-020 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> 나이 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) • 2 시간 2 O </td><td colspan="2"> BPE120-500G </td><td> 피셔 과학 </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 157,740 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> 나 2 무 4 • 2 시간 2 O </td><td colspan="2"> 31439-100G-R </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td colspan="2"> Z0251 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 31,277 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td colspan="2"> 203734-5G </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td colspan="2"> C8027 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> 비타민 B 12 (cyanocobalamin) </td><td colspan="2"> V2876 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> 비오틴 </td><td colspan="2"> 47,868 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> 티아민 • HCL </td><td colspan="2"> T4625 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> 암피실린 </td><td colspan="2"> A9518-25G </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> 네오 마이신 </td><td colspan="2"> N6386 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> Kanamycin </td><td colspan="2"> K4000 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td colspan="4"> culturing위한 소모품 </td></tr><tr><td colspan="2"> 아이템 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 공급 </td></tr><tr><td colspan="2"> 채널을하고 있는걸과 통풍 조직 배양 플라스크 T25 서스펜션 문화 </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> 채널을하고 있는걸과 통풍 조직 배양 플라스크 T75 서스펜션 문화 </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starsted티 </td></tr><tr><td colspan="2"> 채널을하고 있는걸과 통풍 조직 배양 플라스크 T175 서스펜션 문화 </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP 병 톱 필터, 1L, 완료 </td><td> 99950T </td><td> Bioscience 헬레나 </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP 병 상단 필터, 500ml, </td><td> 99500T </td><td> Bioscience 헬레나 </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP 병 톱 필터, 250ml, </td><td> 99250T </td><td> Bioscience 헬레나 </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP 병 톱 필터, 150ml, </td><td> 99150T </td><td> Bioscience 헬레나 </td></tr><tr><td colspan="2"> 해양 수족관을위한 염도 측정기 </td><td> DSG-10 </td><td> Daeyoon </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="3" > 변환을위한 화학 물질 </td></tr><tr><td> 화학 </td><td> 카탈로그번호 </td><td> 공급 </td></tr><tr><td> D-Sorbitol </td><td> S6021-1KG </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> Pluronic F-68 솔루션 </td><td> P5556-100ML </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> ClonNat </td><td> 51,000 </td><td> 베르너 </td></tr><tr><td> 낮은 용융 점 아가로 오스 </td><td> 16520-050 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td colspan="3"> 변환을위한 소모품 </td></tr><tr><td> 아이템 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 공급 </td></tr><tr><td> 채널을하고 있는걸과 통풍 조직 배양 플라스크 T25 서스펜션 문화 </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> 채널을하고 있는걸과 통풍 조직 배양 플라스크 T75 서스펜션 문화 </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> 조직 배양 플라스크는 T175 서스펜션 잘라내기ltures는 채널을하고 있는걸과 통풍 </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Greiner의 원심 분리기 튜브 50ml </td><td> 227,261 </td><td> GBO </td></tr><tr><td> 진 Pulser / MicroPulser Cuvettes 0.2 cm 간격, 50 </td><td> 165-2086 </td><td> 바이오 방사선 </td></tr><tr><td> 페트리 접시 둥근 PS 3 통풍구 H14.2 Φ55 </td><td> 391-0895 </td><td> VWR 인터내셔널 </td></tr><tr><td> 조사 맑은 120mm 의한 멸균 네 통풍구의 폴리스티렌과 페트리 접시 광장 </td><td> FB51788 </td><td> 피셔 과학 </td></tr><tr><td> 문라이트 블루 라이트 필터 </td><td> 183 </td><td> 리 조명 </td></tr></tbody></table>

genomic transformation of the picoeukaryote ostreococcus tauri

식물 과학의 급속한 발전을 방해 일반적인 문제는 세포, 조직과 전체 유기체의 복잡하고 높은 식물의 간단한 유전자에 영향을 미치는 게놈 중복 특히 높은 수준을 포함​​합니다. 소설 모델 유기체 Ostreococcus 타우 리가 날짜로 알려진 작은 자유 생활 진핵세포 생물이며, 당 가장 organelles 중 하나 (mitochondrion, 엽록체, 잠돌군 Zz 스택)의 존재에 의해 나타냄 크게 감소 게놈의 크기와 셀룰러 복잡성 1,2를 가지고 셀, 오로지 ~ 8000 유전자를 포함하는 게놈. 또한, unicellularity 쉽게 문화의 결합 화학 생물 접근 의무가 플랫폼을 제공합니다. 최근 Ostreococcus이 성공적으로 circadian 측정 3-6 근본 기본적인 메커니즘을 연구하기 위해 고용되었다. 이 모델 생물의 결과는 또한 포유류의 생물학 7 식물 과학뿐만 아니라 영향을했지만. 이 예제에서 얼마나 빠른 실험을 강조녹색 혈통에서 간단한 진핵세포 생물은 낮은 복잡도의 배경으로 기술적으로 실현 가능한 방법을 사용 testable 가설을 생성하여보다 복잡한 유기체의 연구를 가속화할 수 있습니다. 게놈과 유전자를 수정하기위한 가능성에 대한 지식은 어떤 모형 수종에 필수적인 도구입니다. 유전자 Ostreococcus를 변환하기 이전에 보고된 방법 6,10가 전세계적으로 몇 가지 실험실로 알려진 반면 게놈 1, Transcriptomic 8이 종족에 대한 Proteomic 아홉 정보는 자유롭게 사용할 수 있습니다. 이 문서에서는 실험 방법은 유전자 electroporation에 의해 구조가 자세히 설명뿐만 아니라 변형 라인의 선택에서 발생하는 허용하는 낮은 비율 아가로 오스의 변형 세포를 포함하는 방법있다 overexpression로이 소설을 모델 유기체를 변환하는 방법 하나는 휴대폰을 바꾸었다. Ostreoco의 성공적인 응용 프로그램에 따라circadian 연구 ccus, Ostreococcus에 관심이 점점이 biotechnological 분야를 포함하여 식물의 과학, 내 및 외부의 다양한 연구 분야에서 기대할 수 있습니다. 보존 생화 학적 경로에서 작동 생물 학적 및 의료 과학의 광범위한 범위에서 연구가 더 큰 모델 종의 게놈과 organismal 복잡도에서 해방 Ostreococcus에서 추구하는 연구를하는 것이 좋습니다.

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Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

이 문서는 단세포 해양 alga의 유전자 변형을 설명합니다<em&gt; Ostreococcus 타우 리</em&gt; electroporation에 의해. 이것은 진핵 생물은 크게 감소 게놈 및 세포 복잡 possesing과 세포 배양 및 화학 생물학 모두에게 쉽게받을 수있는 권력으로 높은 식물을위한 효과적인 모델의 플랫폼입니다.

Picoeukaryote의 게놈 변환<em&gt; Ostreococcus 타우 리</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

genomic-transformation-of-the-picoeukaryote-ostreococcus-tauri

Research

JoVE Journal

Biology

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

마우스 뒷면에서 게놈 DNA의 분리

연구

생물학

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

대형 삽입 환경 게놈 라이브러리 제작

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

RNA 함유 Oligonucleotides를 사용하여 변환하여 게놈 DNA에서 RNA / DNA 하이브리드의 생성

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

게놈 MRI - 게놈 DNA 시퀀스 내의 패턴을 학습에 대한 공개 자료

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

게놈 DNA에서 도보로 5 hydroxymethylcytosine의 선택적 캡처

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

게놈 복사 번호 변종의 탐지를위한 배열 비교 게놈 교잡 (배열 CGH)

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

RNA 시퀀싱 분석은 유전자 발현 및 게놈 변경을 특성화를 대상으로

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

CRISPR/Cas9를 사용하여 Null 돌연변이를 생성하기 위해 컬렉스 모기의 배아를 준비하고 주입합니다.

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...