Name: genomic transformation of the picoeukaryote ostreococcus tauri
Uploaded: 2012-07-13T13:00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri at JoVE.com

SynthSys et Senter for Integrative Systems Biology finansiert av BBSRC og EPSRC prisen D019621. EU FP6 Network of Excellence &quot;Marine Genomics&quot; tilskudd til FYB har finansiert utviklingen av genetiske transformasjon metoder.

1. Utarbeidelse av algetoksiner Material <ol><li> Ostreococcus celler dyrkes i kunstige sjøvann (ASW). Sea salter (typisk ca 40 gram per liter) blir oppløst i avionisert vann til en salinitet på 30 ppt, målt med en saltholdighet meter. Berikelse medium 11,12, sporelement elementer og vitaminer er lagt inn som beskrevet i tabell 1-3. Mediene er da filter-steriliseres gjennom en 0,22 mikrometer filter. </li><li> For vedlikehold, celler av Ostreococcus belastninger OTTH95 er sub-kulturperler aseptisk ved en fortynning på 1/100 i frisk ASW hver 7. dag og dyrket under konstant lys i en plantevekst inkubator utstyrt med Moonlight blå filter. Lysintensiteten bør være nær 20 mikromol m -2 s -1, og temperaturen holdes på 20 ° C. Celler ikke krever konstant agitasjon, men er rystet gang hver 2 til 3 dager for å unngå aggregering. </li><li> For hver transformasjon, er 50 ml celler kreves ved en celle density på 20-30 x 10 6 -1 ml, som skal oppnås 5-7 dager etter sub-dyrking. Tilnærmet celle tetthet og axeny kan bestemmes ved hjelp av enten flowcytometri eller en haemocytometer på et minimum av x40 forstørrelse. </li></ol> 2. Electroporation <ol><li> Forbered DNA for transformasjon. For hver transformasjon, er 5 mikrogram av ren, lineære plasmid DNA som kreves ved en konsentrasjon på 1 mg / mL i sterilt avionisert vann. For å oppnå dette DNA, forfatterne anbefaler å bruke en Qiagen midi prep kit, men andre metoder kan fungere like godt. Fordøye sitt produkt med et enzym som kutter i ryggraden i vektor brukt, men ikke i transgene eller valg genet. Videre rense og konsentrere den resulterende lineære DNA av etanol nedbør, og resuspender produktet i riktig volum av høy kvalitet sterilt avionisert vann. </li><li> Forbered Mikrosentrifugerør inneholder 5 mikrogram DNA for hver transformasjon. En control uten DNA er nødvendig for hver celle linje å bli forvandlet. Hold disse rørene på is, sammen med en 2 mm electroporation kyvette for hver transformasjon. </li><li> Forbered 2,2 ml resuspensjon buffer per transformasjon. Løs Sorbitol til en 1 M løsning i DDH 2 O, legg 0,1% pluronic syre F68 og filter-sterilisere. </li><li> Legg pluronic syre F68, til en endelig konsentrasjon på 0,1% til cellene, og pellet dem i 10 minutter ved 8000x g ved 10 ° C i 50 ml tube med konisk bunn. Umiddelbart resuspender cellene i 1 ml resuspensjon buffer ved pipettering opp og ned, og overføre til en microfuge tube. Spinn ned i 10 minutter ved 8000 xg ved 10 ° C, og jobbe raskt, gjenta dette vasketrinn igjen. </li><li> Med et kutt tips, resuspender hver endelig pellet i 40 mL av resuspensjon buffer. Legg 40 mL av resuspendert cellene til alle rør av lineære DNA på is, bland forsiktig og overføre til electroporation kyvetten. </li><li> Sett kyvetten i electroptale maskin. Endre innstillingene til 6 kV -1 cm, 600 Ω, og 25 μF. Electroporate cellene. </li><li> Inkuber electoporated cellene i kyvettene ved romtemperatur i 10 minutter, og bruke denne tiden til å forberede vevskulturstudier kolbene. Merke dem og tilsett 30 ml av frisk ASW til hver. Ta 1 ml ut av hver kolbe og tilsett det til tilsvarende kyvetten. Inkuber i 2 minutter og fjern forsiktig ASW, nå inneholder Globule av celler og forsiktig og langsomt pipetter direkte inn i ASW i kulturen kolben. </li><li> Celler vanligvis forblir i en Globule. Pass på å ikke riste eller forstyrre de aggregerte cellene i dette øyeblikk. La cellene å komme i inkubator i 1-2 timer, deretter resuspender ved å riste flaskene. På denne tiden, bør cellene resuspender fritt og ingen klumper skal være synlig. La kulturer å gjenopprette natten i kuvøse. </li></ol> 3. Inkludering av Celler på Plater i Semi-Solid Medium <ol><li&gt; Dagen autoklaver en løsning på 2,1% lavt smeltepunkt agarose i DDH 2 O i en flaske som inneholder en rørepinne. Hold smeltet ved 65-90 ° C i en større begerglass som inneholder vann på en oppvarming magnetrører. For hver transformasjon forberede 8 petriskåler (55 mm diameter) og 8 x 15 ml rør hver inneholder 9 ml av ASW pluss ønsket valg. Hvis du bruker Nourseothricin eller G418, bruk 2 mg / ml. </li><li> Samle de transformerte cellene fra inkubatoren. Arbeid i et sterilt flowhood, tilsett 1 ml kokende LMP agarose til 9 ml i en av rørene. Lukk røret, og bland ved å snu. Deretter legger 0,5 ml fersk transformerte celler, raskt blande og helle inn på platen. Gjenta denne prosessen med de resterende 7 rørene og deretter gå videre til neste transformasjon kolben. </li><li> La platene åpner i flyten hette for en time, for agarose å sette. Deretter lukker platene og overføre dem til store kvadratiske petriskåler, som vil holde 4 plater hver. Tett torget platene viddh Parafilm. Merk at platene ikke vil sette helt, og som et resultat, er det gel svært skjøre. Forsiktighet bør utvises for ikke å bryte den gelen ved håndtering av platene. Legg alle kvadratiske plater i kuvøse. </li></ol> 4. Valg av transformerte Colonies <ol><li> Kolonier bør vises etter 10 til 21 dager på transformasjon platene, men ikke på mock transformerte platene. Å plukke kolonier bruke en 200 mL pipette med cut-off tips. Bare velg frie kolonier og suge ut den grønne kolonien. Pass på å ikke inkludere noen celler fra nærliggende kolonier. </li><li> Overfør cellene til 2 ml væske medium som inneholder valg, i en 24 brønner plate. Når du bruker Nourseothricin, bruker 1,75 mg / ml. Bland ved pipettering opp og ned. Velg 24-50 kolonier per transformasjon. Forsegle platene med Parafilm og overføring til inkubatoren. </li><li> Etter en uke, overføre 100 mL av hver brønn til 2 ml frisk ASW med utvalget i en 24 brønner plate og vokse for en additional 7 dager. Gjenlevende cellelinjer kan brukes til videre studier. Stabil integrering i genomet og innsetting nummer bør analyseres ved hjelp av PCR og Southern Blot. Genomisk DNA kan fås til disse formålene med noen down-skalert standard metode for plante DNA-ekstraksjon. </li></ol> 5. Representative Resultater Celler delt 1/100 nådde en tetthet på 25 millioner celler per milliliter etter å ha vokst i 7 dager. Electroporation av cellene med de riktige innstillingene resulterte i en tid-konstant mellom 10 og 14 millisekunder. Når cellene blir overført til medium i kultur flakonger, bør en Globule av celler danner. Når lett rystet etter en time, bør cellene lett resuspender. Inkludering av 1 ml forvandlet celler til 0,2% LMP agar bør resultere i en konsistent, men bare halvfast gel. Kolonier bør vises etter 10 til 21 dager. Når transformerer 5 mikrogram av lineære DNA ved hjelp av protokollen over, 50-100 kolonier pr transformasjonplate var typisk forventet versus ingen på den negative kontrollen platene. ~ 80% av kolonier plukket ble positivt valgt ut av antibiotikaresistens i flytende medium og ble brukt i senere studier. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Endelig konsentrasjon </td><td> Lager løsning </td><td> Volum for 1 liter </td></tr><tr><td> NANO 3 </td><td> 8,83 x 10 -4 M </td><td> 75 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td> 3,63 x 10 -5 M </td><td> 2,68 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> β-glycerophosphate </td><td> 1 x 10 -5 M </td><td> 2,16 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> H 2 SEO 3 </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 1,29 mg / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> Tris-base (pH 7,2) </td><td> 1 x 10 -3 M </td><td> 121,1 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> K sporelement løsning </td><td></td><td> Tabell 2 </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> f / 2 vitamin løsning </td><td></td><td> Tabell 3 </td><td> 0,5 mL </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Middels bestanddeler for vekst av O. 11 Tauri, 12. Fyll opp et totalt volum på 1 liter av kunstige sjøvann til en salinitet på 30 ppt, og legg komponentene ovenfor fra stamløsninger som angitt. Filter-sterilisere medium og bruk innen en uke. Beholdning av alle forbindelser unntatt vitamin løsningen kan samordnes for å legge til 6 ml av denne løsningen for hver liter medium. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Endelig konsentrasjon </td><td> Lager løsning </td><td> Beløp i 1 liter </td></tr><tr><td> Na 2 </sUB&gt; EDTA • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 -4 M </td><td></td><td> 41,6 g </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td> 1 x 10 -5 M </td><td></td><td> 3,15 g </td></tr><tr><td> Na 2 Moo 4 • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 6,3 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 22,0 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6H 2 O </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 10,0 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 180,0 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 9,8 g / L dH <sub&gt; 2 O </td><td> 1 mL </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Sporelement løsning 11,12. Fyll opp til totalt en liter, i dH 2 O, og varme til å oppløse. Delmengde løsningen og fryse for lagring. Endelige konsentrasjoner angitt refererer til den endelige medium, ikke sporelement løsningen. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Endelig konsentrasjon </td><td> Lager løsning </td><td> Beløp i 1 liter </td></tr><tr><td> Vitamin B 12 </td><td> 1 x 10 -10 M </td><td> 1 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> Biotin </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 0,1 g / L dH 2 O </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Tiamin • HCl </td><td> 1 x 10 -7 M </td><td></td><td> 200 mg </td></tr></tbody></table> Tabell 3. f / 2vitamin løsning 11. Fyll opp til totalt en liter i dH 2 O, filter-sterilisere, alikvoter og fryse. Endelige konsentrasjoner angitt refererer til den endelige medium, ikke vitamin løsningen. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig1.jpg" /> Figur 1. Grafisk oversikt over transformasjonen prosedyren. Skjematisk fremstilling av prosedyren for å genetisk forandre Ostreococcus Tauri av electroporation. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig2.jpg" /> Figur 2. Kultur vekst. Cellene er sub-kulturperler aseptisk ved en fortynning på 1/100 i frisk ASW hver 7. dag og dyrket under konstant lys i en plantevekst inkubator utstyrt med Moonlight blå filter. Lysintensiteten bør være nær 20 mikromol m -2 s -1, og temperaturen holdes på 20 ° C Cells ikke krever konstant agitasjon, men er sHaken gang hver 2 til 3 dager for å unngå aggregering. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig3.jpg" /> Figur 3. Colony formasjon på 0,2% LMP agarose. Transfer 4 plater til et stort torg petriskål, og tetning med Parafilm (øverst til venstre). Når kolonier har dannet, velger du bare gratis (ideelt Konisk formet) kolonier (øverst til høyre) og suge dem ut av platen med en P200 pipette. Det bør ikke være kolonier på den negative kontrollen (nederst til høyre).

<ol>
	<li>Derelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+analysis+of+the+smallest+free-living+eukaryote+Ostreococcus+tauri+unveils+many+unique+features.">Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).</li><li>Henderson, G. P., Gan, L., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+ultrastructure+of+O.+tauri:+electron+cryotomography+of+an+entire+eukaryotic+cell.">3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell.</a> PLoS One. 2, e749 (2007).</li><li>O'Neill, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+persist+without+transcription+in+a+eukaryote.">Circadian rhythms persist without transcription in a eukaryote.</a> Nature. 469, 554-558 (2011).</li><li>van Ooijen, G., Dixon, L. E., Troein, C., Millar, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+function+is+required+for+biological+timing+throughout+the+twenty-four+hour+cycle.">Proteasome function is required for biological timing throughout the twenty-four hour cycle.</a> Curr. Biol. 21, 869-875 (2011).</li><li>Troein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+light+inputs+to+a+simple+clock+circuit+allow+complex+biological+rhythms.">Multiple light inputs to a simple clock circuit allow complex biological rhythms.</a> Plant. J. 66, 375-385 (2011).</li><li>Corellou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clocks+in+the+green+lineage:+comparative+functional+analysis+of+the+circadian+architecture+of+the+picoeukaryote+ostreococcus.">Clocks in the green lineage: comparative functional analysis of the circadian architecture of the picoeukaryote ostreococcus.</a> Plant Cell. 21, 3436-3449 (2009).</li><li>O'Neill, J. S., Reddy, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+clocks+in+human+red+blood+cells.">Circadian clocks in human red blood cells.</a> Nature. 469, 498-503 (2011).</li><li>Monnier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrated+transcription+of+biological+processes+in+the+marine+picoeukaryote+Ostreococcus+exposed+to+light/dark+cycles.">Orchestrated transcription of biological processes in the marine picoeukaryote Ostreococcus exposed to light/dark cycles.</a> B.M.C. Genomics. 11, 192 (2010).</li><li>Le Bihan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+proteomic+analysis+of+the+unicellular+alga+Ostreococcus+tauri.">Shotgun proteomic analysis of the unicellular alga Ostreococcus tauri.</a> J. Proteomics. 74, 2060-2070 (2011).</li><li>Corellou, F., Bouget, F. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+polypeptides+from+the+nuclear+genome+of+Ostreococcus+sp.">Expression of polypeptides from the nuclear genome of Ostreococcus sp.</a> US application patent. , (2010).</li><li>Guillard, R. R. L., Ryther, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+marine+planktonic+diatoms.+I.+Cyclotella+nana+Hustedt,+and+Detonula+confervacea+(cleve)+Gran.">Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran.</a> Can. J. Microbiol. 8, 229-239 (1962).</li><li>Keller, M. D., Selvin, R. C., Claus, W., Guillard, R. R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media+for+the+culture+of+oceanic+ultraphytoplankton.">Media for the culture of oceanic ultraphytoplankton.</a> J. Phycol. 23, 633-638 (1987).</li><li>Djouani-Tari, e. l. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phosphate-regulated+promoter+for+fine-tuned+and+reversible+overexpression+in+Ostreococcus:+Application+to+circadian+clock+functional+analysis.">A phosphate-regulated promoter for fine-tuned and reversible overexpression in Ostreococcus: Application to circadian clock functional analysis.</a> PLoS One. 6, e28471 (2011).</li><li>Moulager, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+light+signals+by+the+retinoblastoma+pathway+in+the+control+of+S+phase+entry+in+the+picophytoplanktonic+cell+Ostreococcus.">Integration of light signals by the retinoblastoma pathway in the control of S phase entry in the picophytoplanktonic cell Ostreococcus.</a> PLoS. Genet. 6, e1000957 (2010).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

Cellular staten og kultur axeny er av avgjørende betydning for transformasjon prosedyren. Selv om cellene er vanligvis opprettholdt i sykluser på 12 timer lys, ble 12 timers mørke, transformasjon effektivitet i celler dyrket under disse forholdene viser seg å være utilstrekkelig. Under gjentatte pelletering / resuspensjon trinnene, skal cellene alltid resuspender lett. Hvis cellene samlet, eller en slim-lignende substans er til stede, er det bedre å starte prosedyren fra begynnelsen igjen. Vanligvis kan ~~~HEAD=NNS 50 kolonier kan forventes på hver transformasjon plate, kontra ingen på den negative kontrollen plate. Ved lav transformasjon effektivitet, bør dyrking forholdene endres for å sikre celler er i optimal tilstand. Variabler som påvirker transformasjon effektivitet inkluderer omgivelsestemperatur i laboratoriet (bør være nær 20 ° C) og håndtering hastighet (Procedure fra pelletering celler [2,3] til utvinning [2,7] skal ta ~ 1 time). Det er også viktig at alle løsninger enre laget fersk før hver transformasjon. For inkludering i plater, er konsentrasjonen av LMP agarose avgjørende. Ostreococcus cellene vil ikke vokse i høye konsentrasjoner agarose, og vil spre i lave konsentrasjoner. Tre transformasjon vektorer for Ostreococcus har blitt publisert tidligere seks, og flere vektorer forventes å bli generert og publisert kort tid. Den eksisterende vektor Pot-Luc 6 tillater bruk av en promotor av valget i kombinasjon med en C-terminal ildflue luciferase tag tillate raskere transgen linjevalg pluss medgjørlig uttrykk mønstre, mens Potox vektoren 6 bærer sterke induserbar 13 promotor tatt fra Ostreococcus høy affinitet Fosfat Transporter (HAPT) genet for overuttrykte genet av interesse. Den Potox-Luc vektor kommer fra Potox, bærer en ekstra luciferase markør som kan brukes for indirekte valg av overuttrykk linjer <sopp&gt; 14. Vellykkede markeringsindikatorene på disse vektorer er Nourseothricin og G148. Men Ostreococcus celler er svært motstandsdyktig mot mange antibiotika, og konsentrasjonene av forbindelser som er nødvendige for valg av transgene Ostreococcus celler er høyere enn for konvensjonelle modellen systemer (2 mg / ml). Selv om prosessen synes ineffektive, utgjør det store antallet av celler og plasmid DNA som trengs for denne prosedyren ingen vesentlig hindring. En større begrensning er at hver generert linje som er resistent mot valgbar markør må analyseres individuelt for å sjekke at hele konstruksjonen er integrert i DNA. Vi har observert eksempler på at vellykket uttrykk for valgbar markør ikke svarer til innsetting av selve genet av interesse; dvs. delvise integrasjoner kan forekomme. Tydeligvis betyr tilfeldig innsetting i genomet også at det ikke er kontroll av innstikkstedet ved hjelp av denne metoden, og metoder bdessuten økt på homolog rekombinasjon er under utvikling. Men beskrev metoden her er, etter vår beste kunnskap, for tiden den eneste preget metode for å generere genmodifiserte Ostreococcus celler. Som Ostreococcus Tauri har kun nylig blitt brukt som en eksperimentell modell organisme, er de fleste metoder som arbeider med disse cellene sannsynlig å utvikle seg og bli videreutviklet av den voksende forskningsmiljøet involvert. Denne protokollen er ment å hjelpe folk i gang arbeid med Ostreococcus, men på ingen måte påstår å beskrive alt som er å vite om genomisk transformasjon av denne microalga. Forfatterne har tillit til at leserne vil kunne tilpasse denne protokollen til sine egne behov som små forskjeller i kuvøser (lysnivåer eller kvalitet) og andre parametre vil eksistere og sannsynligvis må optimaliseres i hver enkelt laboratorium for å oppnå sunne kulturer trengs for denne protokoll. Etter å mestre teknikkene som beskrives her,vektorer kan være konstruert for å generere selvlysende, fluoriserende, eller andre merkede fusion linjer under kontroll av en rekke promotors. Denne spennende romanen eksperimentelle plattformen vil være nyttig å studere hvordan kompliserte biokjemiske problemer løses i en eukaryote av redusert kompleksitet, der farmakologiske tilnærminger er svært lettet tre.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Middels bestanddeler </td></tr><tr><td> Kjemisk </td><td colspan="2" > Katalognummer </td><td> Leverandør </td></tr><tr><td> Instant Ocean Marine Salt </td><td colspan="3"> fra <a href="http://amazon.co.uk" target="_blank">amazon.co.uk</a> eller <a href="http://rocketaquatics.co.uk" target="_blank">rocketaquatics.co.uk</a> </td></tr><tr><td> NANO 3 </td><td colspan="2"> S5506-250G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td colspan="2"> A9434-500G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Glyserol 2-fosfat disodium salt hydrat </td><td colspan="2"> G9422-100G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> H 2 SEO 3 </td><td colspan="2"> 84 920-250G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Ultra ren Tris </td><td colspan="2"> 15504-020 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Na 2 EDTA • 2H 2 O </td><td colspan="2"> BPE120-500G </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 157740 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Na 2 Moo 4 • 2H 2 O </td><td colspan="2"> 31 439-100G-R </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td colspan="2"> Z0251 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 31277 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td colspan="2"> 203 734-5G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td colspan="2"> C8027 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Vitamin B 12 (cyanokobalamin) </td><td colspan="2"> V2876 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Biotin </td><td colspan="2"> 47868 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Tiamin • HCl </td><td colspan="2"> T4625 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td colspan="2"> A9518-25G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Neomycin </td><td colspan="2"> N6386 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Kanamycin </td><td colspan="2"> K4000 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td colspan="4"> Forbruksmateriell til dyrkning </td></tr><tr><td colspan="2"> Sak </td><td> Katalognummer </td><td> Leverandør </td></tr><tr><td colspan="2"> Vevskulturstudier termos T25 Suspension Cultures Ventilerte med øsende Channel </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Vevskulturstudier termos T75 Suspension Cultures Ventilerte med øsende Channel </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Vevskulturstudier termos T175 Suspension Cultures Ventilerte med øsende Channel </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP Bottle topp filtre, 1L, komplette </td><td> 99950T </td><td> Helena Biovitenskap </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP Bottle topp filtre, 500ml, </td><td> 99500T </td><td> Helena Biovitenskap </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP Bottle topp filtre, 250ml, </td><td> 99250T </td><td> Helena Biovitenskap </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP Bottle topp filtre, 150ml og </td><td> 99150T </td><td> Helena Biovitenskap </td></tr><tr><td colspan="2"> Salinitet Meter for Marine Aquarium </td><td> DSG-10 </td><td> Daeyoon </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="3" > Kjemikalier til transformasjon </td></tr><tr><td> Kjemisk </td><td> Katalognummer </td><td> Leverandør </td></tr><tr><td> D-Sorbitol </td><td> S6021-1KG </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Pluronic F-68-løsning </td><td> P5556-100ML </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> ClonNat </td><td> 51000 </td><td> Werner </td></tr><tr><td> Lavt smeltepunkt agarose </td><td> 16520-050 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td colspan="3"> Forbruksmateriell til transformasjon </td></tr><tr><td> Sak </td><td> Katalognummer </td><td> Leverandør </td></tr><tr><td> Vevskulturstudier termos T25 Suspension Cultures Ventilerte med øsende Channel </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Vevskulturstudier termos T75 Suspension Cultures Ventilerte med øsende Channel </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures ventileres med øsende Channel </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Greiner sentrifugerør 50ml </td><td> 227261 </td><td> GBO </td></tr><tr><td> Gene Pulser / MicroPulser kyvetter, 0,2 cm gap, 50 </td><td> 165-2086 </td><td> Bio-Rad </td></tr><tr><td> Petriskål runde PS 3 Vents H14.2 Φ55 </td><td> 391-0895 </td><td> VWR International </td></tr><tr><td> Petriskål firkant med fire ventiler polystyren steril ved bestråling klar 120mm </td><td> FB51788 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Moonlight Blått lys filter </td><td> 183 </td><td> Lee Belysning </td></tr></tbody></table>

genomic transformation of the picoeukaryote ostreococcus tauri

Vanlige problemer som hindrer rask fremgang i Plant Sciences inkluderer mobilnettet, vev og hele organismen kompleksitet, og særlig det høye genomisk redundans påvirker enkle genetikk i høyere planter. Romanen modell organisme Ostreococcus Tauri er den minste frittlevende eukaryote kjent for å date, og besitter en sterkt redusert genom størrelse og cellulær kompleksitet 1,2, manifestert ved tilstedeværelsen av bare én av de fleste organeller (mitokondrie, kloroplast, Golgi stabel) per celle, og et genom inneholder bare ~~~HEAD=NNS 8000 gener. Videre gir kombinasjonen av unicellularity og enkel kultur en plattform mottagelig for kjemisk biologi tilnærminger. Nylig har Ostreococcus blitt ansatt for å studere grunnleggende mekanismene bak circadian tidtaking 3-6. Resultater fra denne modellen organismen har påvirket ikke bare plante vitenskap, men også hos pattedyr biologi 7. Dette eksemplet viser hvordan rask eksperimentering i enEnkelt eukaryote fra den grønne linjen kan akselerere forskning i mer komplekse organismer ved å generere testbare hypoteser som bruker metoder teknisk gjennomførbare bare i denne bakgrunnen av redusert kompleksitet. Kjennskap til ett genom og muligheten til å endre gener er viktige verktøy i enhver modell arter. Genomisk 1, 8 Transcriptomic, og proteomikk 9 for denne arten er fritt tilgjengelig, mens de tidligere rapporterte metoder 6,10 til genetisk forandre Ostreococcus er kjent for å få laboratorier over hele verden. I denne artikkelen, til de eksperimentelle metoder genetisk transformere denne romanen modell organisme med en overexpression konstruere ved hjelp av electroporation er beskrevet i detalj, samt metode for inkludering av transformerte celler i lav prosentandel agarose å tillate valg av transformerte linjer som stammer fra en enkelt forvandlet celle. Etter den vellykkede anvendelse av Ostreococcus til døgnrytmen forskning, kan økende interesse Ostreococcus forventes fra ulike forskningsområder innenfor og utenfor anlegget fag, deriblant bioteknologiske områder. Forskere fra et bredt spekter av biologiske og medisinske fag som arbeider på bevarte biokjemiske mekanismer kan vurdere å forfølge forskning i Ostreococcus, fri fra genomisk og organismebiologi kompleksiteten større modell arter.

Watch this Scientific Journal Video about Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri at JoVE.com

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Denne artikkelen beskriver genetisk transformasjon av encellet marine alger<em&gt; Ostreococcus Tauri</em&gt; Med electroporation. Dette eukaryot organisme er en effektiv modell plattform for høyere planter, possesing sterkt redusert genomisk og cellulær kompleksitet og være lett mottakelig for både cellekultur og kjemisk biologi.

Genomisk Transformasjon av Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus Tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

genomic-transformation-of-the-picoeukaryote-ostreococcus-tauri

Research

JoVE Journal

Biology

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Selektiv Capture av 5-hydroxymethylcytosine fra genomisk DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

Array Comparative Genomisk Hybridisering (Array CGH) for deteksjon av Genomiske Kopier nummer Varianter

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Forsterkning, Neste generasjons sekvensering, og Genomisk DNA Kartlegging av Retrovirale Integrasjons nettsteder

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

Målrettet RNA sekvense analysen å karakter Gene Expression og Genomisk Endringer

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

Forberede og injisere embryoer av Culex mygg for å generere nullmutasjoner ved hjelp av CRISPR / Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...