Name: genomic transformation of the picoeukaryote ostreococcus tauri
Uploaded: 2012-07-13T13:00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri at JoVE.com

SynthSys Центра интегративной системной биологии финансируемых СИББН и EPSRC награду D019621. ЕС FP6 сети Excellence &quot;Морская геномика», грант FYB финансирует развитие методов генетической трансформации.

1. Подготовка материала водорослей <ol><li> Ostreococcus клетки культивируют в искусственной морской воде (ASW). Морской соли (обычно около 40 граммов на литр), растворяют в дистиллированной воде с соленостью 30 п.п., а измеряется с помощью солености метр. Обогащение средней 11,12, микроэлементы металлов и витамины добавляются как описано в таблицах 1-3. Средства массовой информации, то фильтр стерилизовать через 0,22 мкм фильтр. </li><li> Для обеспечения, клетки Ostreococcus штамм OTTH95 суб-культурных асептически в разведении 1/100 в свежих ASW каждые 7 дней и вырос под постоянным светом в рост растений инкубатор оснащен Moonlight синий фильтр. Интенсивность света должна быть близка к 20 мкмоль м -2 с -1, а температура поддерживается на уровне 20 ° C. Клетки не требуют постоянного волнения, но потрясен каждые 2 до 3 дней для предотвращения агрегации. </li><li> Для каждой трансформации, 50 мл клеток необходимы в клетке-де-nsity 20-30 х 10 6 мл -1, которые должны быть достигнуты через 5-7 дней после высеве. Приблизительная плотность клеток и axeny может быть определена с использованием либо проточной цитометрии или гемоцитометра как минимум увеличение x40. </li></ol> 2. Электропорация <ol><li> Подготовка ДНК для трансформации. Для каждой трансформации, 5 мкг чистого линеаризованной плазмиды ДНК требуется при концентрации 1 мкг / мкл стерильной дистиллированной водой. Чтобы получить эту ДНК, авторы рекомендуют использовать Qiagen миди подготовительные комплект, хотя и другими методами может работать одинаково хорошо. Дайджест продукта с ферментом, который режет в основной вектор использовать, но не в трансгенов или выбор ген. Далее очищать и концентрировать полученной линейной ДНК осаждением этанолом, и ресуспендируют продукт в соответствующем объеме высококачественного стерильной дистиллированной водой. </li><li> Подготовить микроцентрифужных пробирок, содержащих 5 мкг ДНК для каждого преобразования. Controл с ДНК не является необходимым для каждой клеточной линии должны быть преобразованы. Храните эти трубы на льду, вместе с 2 мм электропорации кюветы для каждого преобразования. </li><li> Подготовить 2,2 мл буфера ресуспендирования в преобразовании. Растворите Сорбит в 1 М раствор в DDH 2 O, добавить 0,1% плуроник кислоты F68 и фильтр-стерилизации. </li><li> Добавить плуроник кислоты F68, до конечной концентрации от 0,1% до клетки и гранул их в течение 10 минут 8000X г при 10 ° С в 50 мл трубки с коническим дном. Сразу ресуспендирования клеток в 1 мл ресуспендирования буфера с помощью пипетки вверх и вниз, и передать микроцентрифужную трубку. Спином вниз в течение 10 минут при 8000 х г при 10 ° С, а работать быстро, повторите этот шаг мыть еще раз. </li><li> В разрезе наконечник, ресуспендируют каждый конечный осадок в 40 мкл буфера ресуспендирования. Добавить 40 мкл ресуспендированного клеток каждый трубку линеаризованной ДНК на льду, аккуратно перемешать и передать электропорации кюветы. </li><li> Поместите кювету в electropречь машине. Изменение параметров до 6 кВ см -1, 600 Ω и 25 мкФ. Electroporate клеток. </li><li> Инкубируйте electoporated клеток в кювет при комнатной температуре в течение 10 минут, а использовать это время для подготовки колбы культуре ткани. Назовите их и добавить 30 мл свежего ASW каждому. Принимать по 1 мл из каждой колбы и осторожно добавить его к соответствующей кюветы. Выдержите в течение 2 минут и осторожно удалите ASW, теперь содержащие глобулы клеток и медленно и осторожно пипетировать непосредственно в ASW в культуре колбу. </li><li> Клетки обычно остаются в глобулы. Будьте осторожны, не трясите и не нарушать агрегированных клеток в данный момент. Дайте клеткам восстановиться в инкубаторе в течение 1-2 часов, затем ресуспендируют путем встряхивания колб. В это время клетки должны ресуспендируют свободно и без скопления должны быть видны. Оставьте культур для восстановления в течение ночи в инкубаторе. </li></ol> 3. Включение Ячейки плит в полу-твердые среднего <ol><lя&gt; На следующий день, автоклав раствор 2,1% с низкой температурой плавления агарозы в DDH 2 O во флакон, содержащий перемешивании стержня. Имейте в расплавленном 65-90 ° С в больших стакан с водой на отопление магнитной мешалкой. Для каждого преобразования подготовить 8 чашек Петри (55 мм) и 8 х 15 мл пробирок в каждом из которых 9 мл ASW плюс необходимый выбор. При использовании нурсеотрицина или G418, использовать 2 мг / мл. </li><li> Соберите трансформированные клетки из инкубатора. Работа в стерильных flowhood, добавить 1 мл кипящей LMP агарозы в 9 мл в одной из труб. Закройте трубы, и смешивать обращением. Затем добавить 0,5 мл свежей трансформированных клеток, быстро перемешать и вылить в тарелку. Повторите этот процесс с оставшимися 7 труб, а затем переходите к следующему колбу трансформации. </li><li> Оставьте пластин открыть в потоке капот в течение часа, для агарозы, чтобы установить. Затем закройте плиты и переносить их на большие квадратные чашки Петри, которая состоится 4 пластин в каждой. Печать площади остроумие пластинч парафильмом. Следует отметить, что пластины не будет устанавливать полностью, и, как следствие, гель очень хрупкая. Следует проявлять осторожность, чтобы не сломать гель при обработке пластин. Поместите все квадратные плиты в инкубаторе. </li></ol> 4. Выбор трансформированных колоний <ol><li> Колонии должны появиться после 10 до 21 дней на преобразование пластин, а не на макете преобразован пластин. Чтобы выбрать колоний используют 200 мкл пипетку с запорными советы. Просто выберите свободный колониями и высасывают зеленые колонии. Будьте осторожны, чтобы не включать любые клетки из соседних колоний. </li><li> Передача клеток по 2 мл жидкой среды, содержащей выделения, в 24 пластин скважин. При использовании нурсеотрицина, используйте 1,75 мг / мл. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз. Выберите 24-50 колоний на преобразование. Уплотнение пластин с парафильмом и трансфер в инкубаторе. </li><li> Через неделю, передавать по 100 мкл в каждую лунку по 2 мл свежего ASW с выбором в 24 пластин скважин и расти additionaл 7 дней. Выжившие клеточные линии могут быть использованы для дальнейших исследований. Стабильная интеграция в число генома и вставки должны быть проанализированы с помощью ПЦР и Южной Blot. Геномная ДНК могут быть получены для этих целей с помощью любого вниз масштабных стандартный метод выделения ДНК растения. </li></ol> 5. Представитель Результаты Клетки разделены 1/100 достигли плотности 25 миллионов клеток на миллилитр, увеличившись на 7 дней. Электропорация клеток с соответствующими параметрами в результате постоянной времени от 10 до 14 миллисекунд. Когда клетки переносятся в среду в области культуры фляги, глобулы клетки должны сформироваться. Когда слегка потряс через час, клетки должны легко ресуспендирования. Включение 1 мл трансформированных клеток в 0,2% LMP агар должно привести к последовательной, но только полутвердый гель. Колонии должны появиться после 10 до 21 дней. При преобразовании 5 мкг линеаризованной ДНК с использованием протокола выше, 50-100 колоний на преобразованиеплита, как правило, ожидается, по сравнению с ни на отрицательные пластины контроля. ~ 80% колоний взял положительно выбран устойчивости к антибиотикам в жидкой среде и были использованы в последующих исследованиях. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Конечная концентрация </td><td> Основной раствор </td><td> Объем за 1 литр </td></tr><tr><td> NaNO 3 </td><td> 8,83 х 10 -4 М </td><td> 75 г / л дН 2 O </td><td> 1 мл </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td> 3,63 х 10 -5 М </td><td> 2,68 г / л дН 2 O </td><td> 1 мл </td></tr><tr><td> β-глицерофосфата </td><td> 1 х 10 -5 М </td><td> 2,16 г / л дН 2 O </td><td> 1 мл </td></tr><tr><td> H 2 SeO 3 </td><td> 1 х 10 -8 М </td><td> 1,29 мг / л дН 2 O </td><td> 1 мл </td></tr><tr><td> Трис-основание (рН 7,2) </td><td> 1 х 10 -3 М </td><td> 121,1 г / л дН 2 O </td><td> 1 мл </td></tr><tr><td> К следов металла решения </td><td></td><td> Таблица 2 </td><td> 1 мл </td></tr><tr><td> е / 2 витамин решение </td><td></td><td> Таблица 3 </td><td> 0,5 мл </td></tr></tbody></table> Таблица 1. Средние составляющие для роста О. 11 Тельца, 12. Составьте общий объем 1 литра искусственной морской воды с соленостью 30 п.п., а также добавлять компоненты со склада выше решения, как указано. Фильтр-стерилизации среды и использования в течение недели. Акции всех соединений, кроме решения витамина могут быть объединены, чтобы добавить 6 мл этого раствора на каждый литр среды. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Конечная концентрация </td><td> Основной раствор </td><td> Сумма за 1 литр </td></tr><tr><td> Na 2 </sиь&gt; ЭДТА • 2H 2 O </td><td> 1 х 10 -4 М </td><td></td><td> 41,6 г </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td> 1 х 10 -5 М </td><td></td><td> 3,15 г </td></tr><tr><td> Na 2 MoO 4 • 2H 2 O </td><td> 1 х 10 -8 М </td><td> 6,3 г / л дН 2 O </td><td> 1 мл </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td> 1 х 10 -9 М </td><td> 22,0 г / л дН 2 O </td><td> 1 мл </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6H 2 O </td><td> 1 х 10 -9 М </td><td> 10,0 г / л дН 2 O </td><td> 1 мл </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td> 1 х 10 -8 М </td><td> 180,0 г / л дН 2 O </td><td> 1 мл </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td> 1 х 10 -8 М </td><td> 9,8 г / л дН <sub&gt; 2 O </td><td> 1 мл </td></tr></tbody></table> Таблица 2. Трассировка металл решение 11,12. Макияж в общей сложности 1 литр, в дН 2 O, и тепло, чтобы раствориться. Алиготе решение и заморозить для хранения. Окончательные концентрации указаны ссылки на окончательный средний, а не решение следов металла. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Конечная концентрация </td><td> Основной раствор </td><td> Сумма за 1 литр </td></tr><tr><td> Витамин B 12 </td><td> 1 х 10 -10 М </td><td> 1 г / л дН 2 O </td><td> 1 мл </td></tr><tr><td> Биотин </td><td> 1 х 10 -9 М </td><td> 0,1 г / л дН 2 O </td><td> 10 мл </td></tr><tr><td> Тиамин • HCl </td><td> 1 х 10 -7 М </td><td></td><td> 200 мг </td></tr></tbody></table> Таблица 3. е / 2Витамин решение 11. Сделайте в общей сложности до 1 литра в дН 2 O, фильтр-стерилизации, аликвоты и заморозить. Окончательные концентрации указаны ссылки на окончательное среде, не витамин решение. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig1.jpg" /> Рисунок 1. Графическое представление преобразования процедуры. Схематическое изображение процедуры генетически трансформировать Ostreococcus Тельца путем электропорации. <img alt="Рисунок 2" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig2.jpg" /> Рисунок 2. Культура роста. Клетки суб-культурных асептически в разведении 1/100 в свежих ASW каждые 7 дней и вырос под постоянным светом в рост растений инкубатор оснащен Moonlight синий фильтр. Интенсивность света должна быть близка к 20 мкмоль м -2 с -1 и поддерживается температура 20 ° С клетки не нуждаются в постоянной тревоге, но сХакен каждые 2 до 3 дней для предотвращения агрегации. <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig3.jpg" /> Рисунок 3. Колония образования на 0,2% агарозном LMP. Передача 4 пластин большой площади чашки Петри, а печать с парафильмом (вверху слева). Когда колонии образуются, просто выделите бесплатно (в идеале конической формы), колонии (вверху справа) и сосать их из пластины с пипеткой P200. Там должно быть никаких колоний на отрицательный контроль (внизу справа).

<ol>
	<li>Derelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+analysis+of+the+smallest+free-living+eukaryote+Ostreococcus+tauri+unveils+many+unique+features.">Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).</li><li>Henderson, G. P., Gan, L., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+ultrastructure+of+O.+tauri:+electron+cryotomography+of+an+entire+eukaryotic+cell.">3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell.</a> PLoS One. 2, e749 (2007).</li><li>O'Neill, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+persist+without+transcription+in+a+eukaryote.">Circadian rhythms persist without transcription in a eukaryote.</a> Nature. 469, 554-558 (2011).</li><li>van Ooijen, G., Dixon, L. E., Troein, C., Millar, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+function+is+required+for+biological+timing+throughout+the+twenty-four+hour+cycle.">Proteasome function is required for biological timing throughout the twenty-four hour cycle.</a> Curr. Biol. 21, 869-875 (2011).</li><li>Troein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+light+inputs+to+a+simple+clock+circuit+allow+complex+biological+rhythms.">Multiple light inputs to a simple clock circuit allow complex biological rhythms.</a> Plant. J. 66, 375-385 (2011).</li><li>Corellou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clocks+in+the+green+lineage:+comparative+functional+analysis+of+the+circadian+architecture+of+the+picoeukaryote+ostreococcus.">Clocks in the green lineage: comparative functional analysis of the circadian architecture of the picoeukaryote ostreococcus.</a> Plant Cell. 21, 3436-3449 (2009).</li><li>O'Neill, J. S., Reddy, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+clocks+in+human+red+blood+cells.">Circadian clocks in human red blood cells.</a> Nature. 469, 498-503 (2011).</li><li>Monnier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrated+transcription+of+biological+processes+in+the+marine+picoeukaryote+Ostreococcus+exposed+to+light/dark+cycles.">Orchestrated transcription of biological processes in the marine picoeukaryote Ostreococcus exposed to light/dark cycles.</a> B.M.C. Genomics. 11, 192 (2010).</li><li>Le Bihan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+proteomic+analysis+of+the+unicellular+alga+Ostreococcus+tauri.">Shotgun proteomic analysis of the unicellular alga Ostreococcus tauri.</a> J. Proteomics. 74, 2060-2070 (2011).</li><li>Corellou, F., Bouget, F. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+polypeptides+from+the+nuclear+genome+of+Ostreococcus+sp.">Expression of polypeptides from the nuclear genome of Ostreococcus sp.</a> US application patent. , (2010).</li><li>Guillard, R. R. L., Ryther, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+marine+planktonic+diatoms.+I.+Cyclotella+nana+Hustedt,+and+Detonula+confervacea+(cleve)+Gran.">Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran.</a> Can. J. Microbiol. 8, 229-239 (1962).</li><li>Keller, M. D., Selvin, R. C., Claus, W., Guillard, R. R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media+for+the+culture+of+oceanic+ultraphytoplankton.">Media for the culture of oceanic ultraphytoplankton.</a> J. Phycol. 23, 633-638 (1987).</li><li>Djouani-Tari, e. l. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phosphate-regulated+promoter+for+fine-tuned+and+reversible+overexpression+in+Ostreococcus:+Application+to+circadian+clock+functional+analysis.">A phosphate-regulated promoter for fine-tuned and reversible overexpression in Ostreococcus: Application to circadian clock functional analysis.</a> PLoS One. 6, e28471 (2011).</li><li>Moulager, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+light+signals+by+the+retinoblastoma+pathway+in+the+control+of+S+phase+entry+in+the+picophytoplanktonic+cell+Ostreococcus.">Integration of light signals by the retinoblastoma pathway in the control of S phase entry in the picophytoplanktonic cell Ostreococcus.</a> PLoS. Genet. 6, e1000957 (2010).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Сотовые axeny государства и культуры имеет решающее значение для превращения процедуры. Хотя клетки, как правило, сохраняется в циклах 12 часов света, 12 часов темного, эффективность трансформации в клетки, выращенные в этих условиях оказались недостаточными. При повторном гранулирования / ресуспендирования шаги, клетки должны всегда ресуспендируют легко. Если ячейки совокупности, или слизь, как вещество присутствует, то лучше начать процедуру с самого начала еще раз. Как правило, около 50 колоний, можно ожидать на каждом преобразовании пластины, по сравнению с ни на отрицательной пластине управления. В случае низкой эффективности преобразования, условия культивирования должны быть изменены, чтобы обеспечить клетки находятся в оптимальном состоянии. Переменные, которые влияют на эффективность трансформации включают температуру окружающей среды в лаборатории (должна быть близка к 20 ° С) и скорости обработки (процедура от гранулирования клеток [2,3] для восстановления [2,7] должно ~ 1 час). Важно также, что все решенияповторно сделал свежий перед каждой трансформации. Для включения в виде пластин, концентрация агарозы LMP имеет решающее значение. Ostreococcus клетки не будут расти в высокой концентрации агарозы, и будут распространять в низких концентрациях. Три преобразование векторов Ostreococcus были опубликованы ранее 6 и более векторов, как ожидается, будет создан и опубликован в ближайшее время. Существующий вектор Pot-Люк 6 позволяет использование промотора выбора в сочетании с С-концевыми люциферазы светляков тег позволяет быстрее трансгенных выбор линии плюс послушный моделей выражения, в то время как вектор Potox 6 несет сильный индуцируемый промотор 13 взята из Ostreococcus высокое сродство фосфат Transporter (HAPT) гена гиперэкспрессией гена. Potox-Люк вектор происходит от Potox, проведение дополнительных маркеров люциферазы, который можно использовать для косвенного отбора гиперэкспрессия линии <sдо&gt; 14. Успешный выбор маркеров на эти векторы нурсеотрицина и G148. Тем не менее, Ostreococcus клетки очень устойчивы ко многим антибиотикам, и концентрации соединений, необходимых для отбора трансгенных клеток Ostreococcus выше, чем у обычных систем модели (2 мг / мл). Хотя этот процесс представляется неэффективной, большое количество клеток и ДНК плазмиды, необходимых для этой процедуры не представляет серьезное препятствие. Больше ограничений в том, что каждый порожденный линии, которая устойчива к выбору маркера необходимо анализировать индивидуально проверить, что вся конструкция интегрирована в ДНК. Мы наблюдали примеры, в которых успешное выражение селективного маркера не соответствует введение фактического гена, то есть частичная интеграция может произойти. Очевидно, что случайные вставки в геном также означает, что нет никакого контроля вставки сайт, используя этот метод, и методы бased на гомологичной рекомбинации в настоящее время разрабатываются. Тем не менее, метод, описанный здесь, чтобы нам известно, в настоящее время характеризуется только метод для создания генетически модифицированных клеток Ostreococcus. Как Ostreococcus Тельца только недавно был использован в качестве экспериментальной модели организма, большинство методов работы с этими клетками, вероятно, будет развиваться и уточняться растущей исследования общины. Этот протокол предназначен, чтобы помочь людям начать работу с Ostreococcus, но отнюдь не претендует, чтобы описать все, что нужно знать о геномной трансформации этой микроводоросли. Авторы доверия, что читатели смогут адаптировать этот протокол для собственных нужд, как небольшие различия в инкубаторах (свет уровня или качества) и другие параметры, будет существовать и, вероятно, должны быть оптимизированы в каждой отдельной лаборатории для получения здоровых культур, необходимых для этого протокол. После освоения методов, описанных здесь,Векторы могут быть построены для создания люминесцентных, люминесцентных и других отмеченных линии слияния под контроль ряд промоторов. Эта замечательная платформа экспериментальный роман будет полезно изучить, как сложный биохимический проблемы решаются в эукариот сокращенного сложности, в которых фармакологических подходов весьма способствовало 3.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Средний составляющих </td></tr><tr><td> Химический </td><td colspan="2" > Номер по каталогу </td><td> Поставщик </td></tr><tr><td> Мгновенный Океан морской соли </td><td colspan="3"> от <a href="http://amazon.co.uk" target="_blank">amazon.co.uk</a> или <a href="http://rocketaquatics.co.uk" target="_blank">rocketaquatics.co.uk</a> </td></tr><tr><td> NaNO 3 </td><td colspan="2"> S5506-250G </td><td> Сигма </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td colspan="2"> A9434-500G </td><td> Сигма </td></tr><tr><td> Глицерин 2-фосфата динатриевая соль гидрата </td><td colspan="2"> G9422-100G </td><td> Сигма </td></tr><tr><td> H 2 SeO 3 </td><td colspan="2"> 84920-250G </td><td> Сигма </td></tr><tr><td> Ультра чистый трис </td><td colspan="2"> 15504-020 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Na 2 EDTA • 2H 2 O </td><td colspan="2"> BPE120-500G </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 157740 </td><td> Сигма </td></tr><tr><td> Na 2 MoO 4 • 2H 2 O </td><td colspan="2"> 31439-100G-R </td><td> Сигма </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td colspan="2"> Z0251 </td><td> Сигма </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 31277 </td><td> Сигма </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td colspan="2"> 203734-5G </td><td> Сигма </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td colspan="2"> C8027 </td><td> Сигма </td></tr><tr><td> Витамин B 12 (цианокобаламин) </td><td colspan="2"> V2876 </td><td> Сигма </td></tr><tr><td> Биотин </td><td colspan="2"> 47868 </td><td> Сигма </td></tr><tr><td> Тиамин • HCl </td><td colspan="2"> T4625 </td><td> Сигма </td></tr><tr><td> Ампициллин </td><td colspan="2"> A9518-25G </td><td> Сигма </td></tr><tr><td> Неомицин </td><td colspan="2"> N6386 </td><td> Сигма </td></tr><tr><td> Канамицин </td><td colspan="2"> K4000 </td><td> Сигма </td></tr><tr><td colspan="4"> Расходные материалы для культивирования </td></tr><tr><td colspan="2"> Пункт </td><td> Номер по каталогу </td><td> Поставщик </td></tr><tr><td colspan="2"> Tissue Culture Настой T25 Подвеска культур вентилируется с Заливка канал </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Tissue Culture Настой T75 Подвеска культур вентилируется с Заливка канал </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedт </td></tr><tr><td colspan="2"> Tissue Culture Настой T175 Подвеска культур вентилируется с Заливка канал </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> ТЭЦ бутылки верхнюю фильтров, 1 л, в комплекте </td><td> 99950T </td><td> Елена Bioscience </td></tr><tr><td colspan="2"> ТЭЦ бутылки верхнюю фильтров, 500, </td><td> 99500T </td><td> Елена Bioscience </td></tr><tr><td colspan="2"> ТЭЦ бутылки верхнюю фильтров, 250 мл, </td><td> 99250T </td><td> Елена Bioscience </td></tr><tr><td colspan="2"> ТЭЦ бутылки верхнюю фильтров, 150 мл, </td><td> 99150T </td><td> Елена Bioscience </td></tr><tr><td colspan="2"> Соленость метр морской аквариум </td><td> DSG-10 </td><td> Daeyoon </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="3" > Химикаты для преобразования </td></tr><tr><td> Химический </td><td> Каталогномер </td><td> Поставщик </td></tr><tr><td> D-сорбит </td><td> S6021-1 кг </td><td> Сигма </td></tr><tr><td> Pluronic F-68 решение </td><td> P5556-100мл </td><td> Сигма </td></tr><tr><td> ClonNat </td><td> 51000 </td><td> Вернер </td></tr><tr><td> Низкая температура плавления агарозы </td><td> 16520-050 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td colspan="3"> Расходные материалы для преобразования </td></tr><tr><td> Пункт </td><td> Номер по каталогу </td><td> Поставщик </td></tr><tr><td> Tissue Culture Настой T25 Подвеска культур вентилируется с Заливка канал </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Tissue Culture Настой T75 Подвеска культур вентилируется с Заливка канал </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Настой культуры ткани T175 Подвеска Cultures вентилируется с Заливка канал </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Greiner пробирок 50мл </td><td> 227261 </td><td> ГБО </td></tr><tr><td> Гена генератор / MicroPulser кювет, 0,2 см зазор, 50 </td><td> 165-2086 </td><td> Bio-Rad </td></tr><tr><td> Петри круглый PS 3 ВЕНТС H14.2 Φ55 </td><td> 391-0895 </td><td> VWR International </td></tr><tr><td> Петри квадратных четыре отверстия полистирола стерильные облучения ясно 120мм </td><td> FB51788 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Лунный свет синий светофильтр </td><td> 183 </td><td> Ли освещение </td></tr></tbody></table>

genomic transformation of the picoeukaryote ostreococcus tauri

Общие проблемы, препятствующие быстрому прогрессу в завод наук включают клеточном, тканевом и вся сложность организма, и, в частности высокий уровень избыточности генома, влияющих простой генетики в высших растениях. Роман модель организма Ostreococcus Тельца является самым маленьким свободно живущих эукариот известно на сегодняшний день и обладает значительно уменьшен размер генома и клеточных 1,2 сложностью, которая проявляется наличием только одной из самых органелл (митохондрий, хлоропластов, Гольджи стека) в клетки, и геном, содержащий только ~ 8000 генов. Кроме того, сочетание одноклеточность и легко культура представляет собой платформу поддаются подходов химической биологии. В последнее время Ostreococcus был успешно применен для изучения основных механизмов, лежащих в основе циркадных хронометраж 3-6. Результаты этой модели организм повлияли не только завод науки, но и биологии млекопитающих 7. Этот пример подчеркивает, насколько быстрым экспериментов впростые эукариот из зеленого линии может ускорить исследования в более сложных организмов путем создания проверяемых гипотез методами технически осуществимо только в этом фоне снижение сложности. Знание генома, а также возможность изменять гены являются важными инструментами в любой модели вида. Геномная 1 Transcriptomic 8, 9 и протеомных информации для этого вида находится в свободном доступе, тогда как ранее сообщалось о методах 6,10 генетически трансформировать Ostreococcus, как известно, несколько лабораторий по всему миру. В этой статье, экспериментальные методы генетически трансформировать этот роман организм модель с гиперэкспрессией построить с помощью электропорации изложены в деталях, а также метод включения трансформированных клеток в агарозном низкий процент, чтобы отбор трансформированных линий, исходящих из одной трансформированной клетки. После успешного применения Ostreococcus на циркадный исследования, растет интерес к Ostreococcus можно ожидать от различных областях исследований и за ее пределами завода наук, в том числе биотехнологические области. Исследователи из широкого спектра биологических и медицинских наук, которые работают на сохраняющихся биохимических путей может рассмотреть вопрос проведения исследований в Ostreococcus, свободной от геномных и организменном сложности более крупных видов модели.

Watch this Scientific Journal Video about Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri at JoVE.com

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

В этой статье описывается генетической трансформации одноклеточных морских водорослей<em&gt; Ostreococcus Тельца</em&gt; Путем электропорации. Это эукариотических организмов является эффективной платформой модели для высших растений, possesing значительно снижается геномных и клеточных сложности и быть легко поддаются как культура клеток и химической биологии.

Геномная Трансформация Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus Тельца</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

genomic-transformation-of-the-picoeukaryote-ostreococcus-tauri

Research

JoVE Journal

Biology

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Выделение геномной ДНК из хвостов мышей

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

Большой Вставить экологического производства геномной библиотеки

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Генерация РНК / ДНК гибридов в геномной ДНК с помощью преобразования с помощью РНК-содержащих олигонуклеотидов

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

Геномная МРТ - общественный ресурс для изучения последовательности Шаблоны в геномной ДНК

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Конкурентные Геномная Экраны Barcoded Библиотеки дрожжей

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Селективный захват 5-hydroxymethylcytosine из геномной ДНК

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

Массив сравнительная геномная гибридизация (Array CGH) для обнаружения геномной количество копий Варианты

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, следующего поколения Секвенирование и геномную ДНК Mapping ретровирусных интеграции сайты

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

Целенаправленное РНК Секвенирование анализа к характеризации экспрессии генов и геномных Подгон

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

Подготовка и инъекция эмбрионов комаров Culex для генерации нулевых мутаций с использованием CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...