Name: genomic transformation of the picoeukaryote ostreococcus tauri
Uploaded: 2012-07-13T13:00:00
Duration: 10 min 45 s
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SynthSys un Centro para la Biología de Sistemas Integral financiado por el BBSRC y adjudicación EPSRC D019621. 6 º PM de la UE Red de Excelencia &quot;Genómica Marina&quot; subvención a FYB ha financiado el desarrollo de métodos de transformación genética.

1. Preparación del material de algas <ol><li> Las células se cultivan en Ostreococcus agua de mar artificial (ASW). Sales del mar (típicamente alrededor de 40 gramos por litro) se disuelven en agua desionizada a una salinidad de 30 ppm, según se mide utilizando un medidor de salinidad. Medio de enriquecimiento 11,12, elementos traza de metales y vitaminas se añaden como se describe en las Tablas 1-3. Los medios de comunicación es entonces esterilizada por filtración a través de un filtro de 0,22 um. </li><li> Para el mantenimiento, las células de la cepa Ostreococcus OTTH95 son sub-cultivadas asépticamente a una dilución de 1/100 en fresco ASW cada 7 días y cultivadas bajo luz constante en una planta de crecimiento incubadora equipado con Moonlight Blue filtro. La intensidad de la luz debe estar cerca de 20 mol m -1 -2 s y la temperatura se mantiene a 20 ° C. Las células no requieren agitación constante, pero se agitó una vez cada 2 a 3 días para evitar la agregación. </li><li> Para cada transformación, 50 ml de células que se requieren en una celda density de 20-30 x 10 6 ml -1, lo que debe ser alcanzado de 5-7 días después de sub-cultivo. Densidad celular aproximado y axeny se puede determinar utilizando citometría de flujo o un hemocitómetro en un mínimo de magnificación x40. </li></ol> 2. La electroporación <ol><li> Preparar ADN para la transformación. Para cada transformación, 5 g de ADN puro, el plásmido linealizado se requiere en una concentración de 1 mg / l en agua desionizada estéril. Para obtener este ADN, los autores recomiendan utilizar un kit de Qiagen Midi de preparación, aunque otros métodos podrían funcionar igualmente bien. Digerir el producto con una enzima que corta en el esqueleto del vector utilizado, pero no en el transgén o gen de selección. Además purificar y concentrar el ADN lineal resultante mediante precipitación con etanol, y resuspender el producto en el volumen adecuado de agua de alta calidad desionizada estéril. </li><li> Preparar tubos de microcentrífuga que contienen 5 mg de ADN para cada transformación. Una controversial con ningún ADN es necesaria para cada línea celular de ser transformado. Mantener estos tubos en hielo, junto con una cubeta de electroporación de 2 mm para cada transformación. </li><li> Preparar 2,2 ml de tampón de resuspensión por transformación. Disolver sorbitol a una solución 1 M en ddH 2 O, añadir 0,1% de ácido Pluronic F68 y filtro esterilizar. </li><li> Añadir ácido Pluronic F68, a una concentración final de 0,1% a las células, y el pellet ellos durante 10 minutos a 8000X g en 10 ° C en un tubo de 50 ml con fondo cónico. Inmediatamente resuspender las células en 1 ml de tampón de resuspensión pipeteando arriba y hacia abajo, y transferir a un tubo de microcentrífuga. Haga girar durante 10 minutos a 8000 xg a 10 ° C, y trabajar con rapidez, repita este paso de lavado, una vez más. </li><li> Con una punta de corte, resuspender cada final precipitado en 40 l de tampón de resuspensión. Añadir 40 l de las células resuspendidas a cada tubo de ADN linealizado en hielo, mezclar suavemente y transferir a la cubeta de electroporación. </li><li> Colocar la cubeta en el electroporación de la máquina. Cambie la configuración de 6 kV cm -1, 600 Ω y 25 mF. Electroporate las células. </li><li> Se incuban las células electoporated en las cubetas a temperatura ambiente durante 10 minutos, y utilizar ese tiempo para preparar los frascos de cultivo de tejidos. Etiqueta y añadir 30 ml de ASW fresca a cada uno. Tomar 1 ml de cada frasco y agregar suavemente a la cubeta correspondiente. Incubar durante 2 minutos y retire con cuidado la ASW, que ahora contiene el glóbulo de las células y suave y lentamente la pipeta directamente en la guerra antisubmarina en el frasco de cultivo. </li><li> Las células suelen permanecer en un glóbulo. Tenga cuidado de no mover o perturbar a las células agregadas en este momento. Permitir a las células para recuperar en la incubadora durante 1-2 horas, a continuación, volver a suspender agitando los frascos. En este momento, las células deben resuspender libremente y sin grumos debe ser visible. Deja las culturas para recuperar toda la noche en la incubadora. </li></ol> 3. La inclusión de las células en las placas en un medio semisólido <ol><li&gt; Al día siguiente, autoclave una solución de bajo punto de fusión 2,1% de agarosa en ddH 2 O en una botella que contiene una varilla de agitación. Mantener fundido a 65-90 ° C en un vaso de precipitados grande que contiene agua en un agitador magnético calefacción. Para cada transformación preparar 8 placas de Petri (55 mm de diámetro) y 8 x 15 ml conteniendo cada uno los tubos 9 ml de ASW más la selección requerida. Si se utiliza nourseothricin o G418, utiliza 2 mg / ml. </li><li> Recoger las células transformadas de la incubadora. Trabajar en un Flowhood estéril, añadir 1 ml de la ebullición de agarosa LMP a la 9 ml en uno de los tubos. Cerrar el tubo y mezclar por inversión. A continuación, agregue 0,5 ml de células recién transformadas, mezclar rápidamente y verter en el plato. Repita este proceso con los restantes 7 tubos y luego proceder a la transformación del frasco siguiente. </li><li> Deja las placas de abrir en la campana de flujo durante una hora, por la agarosa a establecer. A continuación, cierre las placas y los transfieren a los grandes cuadrados placas de Petri, que tendrá 4 platos cada una. Selle el ingenio placas cuadradash parafilm. Nótese que las placas no se establece completamente, y como resultado, el gel es muy frágil. Se debe tener cuidado de no romper el gel al manipular las placas. Coloque todos los platos cuadrados en la incubadora. </li></ol> 4. La selección de colonias transformadas <ol><li> Las colonias deben aparecer después de 10 a 21 días en las placas de transformación, pero no en las placas falsas transformadas. Para escoger las colonias con una pipeta 200 l con corte de puntas. Sólo tiene que seleccionar las colonias libres y aspirar a la colonia de color verde. Tenga cuidado de no incluir a todas las células de las colonias vecinas. </li><li> Transferir las células a 2 ml de medio líquido que contiene la selección, en una placa de 24 pocillos. Cuando se utiliza nourseothricin, utilice 1,75 mg / ml. Mezclar pipeteando arriba y hacia abajo. Seleccione 24-50 colonias por la transformación. Sellar las placas con parafilm y la transferencia a la incubadora. </li><li> Después de una semana, deben verterse 100 l de cada pocillo a 2 ml fresca ASW con la selección en una placa de 24 pozos y crecer de una additional 7 días. Supervivientes líneas celulares pueden ser utilizados para estudios posteriores. Integración estable en el genoma y número de inserción debe ser analizado mediante PCR y Southern Blot. El ADN genómico puede obtenerse para estos fines utilizando cualquier método estándar abajo en escala de planta para la extracción de ADN. </li></ol> 5. Los resultados representativos Las células dividir 1/100 alcanza una densidad de 25 millones de células por mililitro después de crecer durante 7 días. La electroporación de las células con los ajustes apropiados como resultado una constante de tiempo de entre 10 y 14 milisegundos. Cuando las células se transfirieron a un medio en matraces de cultivo, un glóbulo de células deben formar. Al agitarse ligeramente después de una hora, las células con facilidad, deben suspender de nuevo. La inclusión de 1 ml de células transformadas en agar LMP 0,2% debería resultar en un consistente, pero sólo gel semi-sólido. Las colonias deben aparecer después de 10 a 21 días. Cuando la transformación de 5 ug de ADN linealizado utilizando el protocolo anterior, 50-100 colonias por la transformaciónplaca se espera normalmente, versus ninguno en las placas de control negativo. ~ 80% de las colonias recogidas fueron seleccionados positivamente por la resistencia a los antibióticos en medio líquido y se utilizaron en los estudios posteriores. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> La concentración final </td><td> Solución madre </td><td> Volumen para 1 litro </td></tr><tr><td> NaNO 3 </td><td> 8,83 x 10 -4 M </td><td> 75 g / l H2O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td> 3,63 x 10 -5 M </td><td> 2,68 g / L de H2O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> β-glicerofosfato </td><td> 1 x 10 -5 M </td><td> 2,16 g / L de H2O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> H 2 SEO 3 </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 1,29 mg / L de H2O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Tris-base (pH 7,2) </td><td> 1 x 10 -3 M </td><td> 121,1 g / L de H2O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> K traza solución de metal </td><td></td><td> Tabla 2 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> f / 2 solución de vitaminas </td><td></td><td> Tabla 3 </td><td> 0,5 ml </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Los componentes del medio de crecimiento de O. tauri 11, 12. conseguir un volumen total de 1 litro de agua de mar artificial a una salinidad de 30 ppm, y añadir los componentes anteriores de soluciones madre como se indica. Filtrar a esterilizar el medio y su uso dentro de una semana. Las existencias de todos los compuestos excepto la solución de vitaminas pueden ser agrupados para añadir 6 ml de esta solución por cada litro de medio. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> La concentración final </td><td> Solución madre </td><td> Cantidad para 1 litro </td></tr><tr><td> Na 2 </sub&gt; EDTA • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 -4 M </td><td></td><td> 41,6 g </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td> 1 x 10 -5 M </td><td></td><td> 3,15 g </td></tr><tr><td> Na 2 MoO 4 • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 6,3 g / L de H2O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 22,0 g / L de H2O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6H 2 O </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 10,0 g / L de dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 180,0 g / L de H2O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 9,8 g / L dH <sub&gt; 2 S </td><td> 1 ml </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Trazar solución de metal 11,12. Hacer hasta un total de 1 litro, en dH 2 O, y el calor para disolver. Alícuota de la solución y congelación para su almacenamiento. Las concentraciones finales indicadas se refieren al medio final no, la solución de metales traza. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> La concentración final </td><td> Solución madre </td><td> Cantidad para 1 litro </td></tr><tr><td> La vitamina B 12 </td><td> 1 x 10 -10 M </td><td> 1 g / l DH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Biotina </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 0,1 g / L de dH 2 O </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> • Tiamina HCl </td><td> 1 x 10 -7 M </td><td></td><td> 200 mg </td></tr></tbody></table> Tabla 3. f / 2la vitamina solución de 11. Completar hasta un total de 1 litro en dH 2 O, el filtro a esterilizar, alicuotar y congelar. Las concentraciones finales indicadas se refieren al medio final no, la solución de vitaminas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig1.jpg" /> Figura 1. Representación gráfica del procedimiento de transformación. Representación esquemática del procedimiento para transformar genéticamente Ostreococcus tauri por electroporación. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig2.jpg" /> Figura 2. Las células de crecimiento Cultura. Son sub-cultivados asépticamente en una dilución de 1/100 en agua dulce ASW cada 7 días y crecido bajo la luz constante en un crecimiento de la planta incubadora equipado con filtro de luz de la luna azul. La intensidad de la luz debe estar cerca de 20 mol m -2 s -1 y la temperatura se mantiene a 20 ° C las células no requieren agitación constante, pero son shaken una vez cada 2 a 3 días para evitar la agregación. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig3.jpg" /> Figura 3. La formación de colonias en el 0,2% de agarosa LMP. Transferencia de 4 platos a un plato de Petri gran plaza, y el sello con parafilm (arriba izquierda). Cuando las colonias se han formado, sólo tiene que seleccionar libres (lo ideal es de forma cónica) colonias (arriba derecha) y aspirar a salir de la placa con una pipeta P200. No debe haber colonias en el control negativo (inferior derecha).

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	<li>Derelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+analysis+of+the+smallest+free-living+eukaryote+Ostreococcus+tauri+unveils+many+unique+features.">Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).</li><li>Henderson, G. P., Gan, L., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+ultrastructure+of+O.+tauri:+electron+cryotomography+of+an+entire+eukaryotic+cell.">3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell.</a> PLoS One. 2, e749 (2007).</li><li>O'Neill, J. 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No hay conflictos de interés declarado.

Axeny Celular Estado y la cultura es de vital importancia para el procedimiento de transformación. Aunque las células se mantienen normalmente en ciclos de 12 horas de luz, 12 horas oscuro, la eficiencia de transformación en las células cultivadas bajo estas condiciones se encontraron a ser insuficiente. Durante los repetidos granulación / resuspensión pasos, las células deben siempre resuspender fácilmente. Si el agregado células, o de una sustancia con apariencia de moco está presente, es mejor iniciar el procedimiento desde el principio otra vez. Típicamente, ~ 50 colonias se puede esperar en cada placa de transformación, frente a ninguno en la placa de control negativo. En el caso de la eficiencia de transformación bajo, condiciones de cultivo deben ser variados para asegurar las células están en el estado óptimo. Variables que afectan la eficiencia de transformación se encuentran la temperatura ambiente en el laboratorio (en caso de estar cerca de 20 ° C) y velocidad de manipulación (Procedimiento de la sedimentación de células [2,3] para la recuperación [2,7] se deberían tener aproximadamente 1 hora). También es importante que todas las soluciones aRe frescas antes de cada transformación. Para su inclusión en las placas, la concentración de agarosa LMP es crucial. Células Ostreococcus no crecerá en altas concentraciones de agarosa, y se difundirá en bajas concentraciones. Tres vectores de transformación para Ostreococcus han sido publicados anteriormente 6, y más vectores se espera que se genera y se publicará en breve. El vector existente Pot-Luc 6 permite el uso de un promotor de elección en combinación con una etiqueta C-terminal de la luciferasa de luciérnaga permitiendo la selección de línea más rápida transgénico más manejables patrones de expresión, mientras que el vector Potox 6 lleva el promotor inducible fuerte 13 tomada desde el Ostreococcus Fosfato de alta afinidad Transportador (HAPT) de genes para la sobreexpresión del gen de interés. El vector Potox-Luc deriva de Potox, llevando un marcador luciferasa adicional que puede ser utilizado para la selección indirecta de las líneas de sobreexpresión <sa&gt; 14. El éxito de los marcadores de selección en estos vectores son nourseothricin y G148. Sin embargo, las células Ostreococcus son altamente resistentes a muchos antibióticos, y las concentraciones de los compuestos necesarios para la selección de las células transgénicas Ostreococcus es mayor que para los sistemas de modelo convencional (2 mg / ml). Aunque el proceso parece ineficiente, el gran número de células y el ADN plásmido necesaria para este procedimiento no plantea ningún obstáculo significativo. Una limitación más importante es que cada línea generada que es resistente al marcador seleccionable necesita ser analizada individualmente para comprobar que toda la estructura se integra en el ADN. Hemos observado ejemplos en los que la expresión con éxito de la marcador seleccionable no corresponden a la inserción del gen de interés real; integraciones parciales, es decir puede ocurrir. Evidentemente, la inserción aleatoria en el genoma también significa que no hay control de la zona de inserción utilizando este método, y b métodoson base en la recombinación homóloga se están desarrollando actualmente. Sin embargo, el método descrito aquí es, a nuestro leal saber y entender, actualmente el único método caracterizado para generar células modificadas genéticamente Ostreococcus. Como Ostreococcus tauri sólo recientemente ha sido utilizado como un organismo modelo experimental, la mayoría de los métodos de trabajo con estas células es probable que evolucionar y ser refinado por la comunidad científica cada vez más involucrados. Este protocolo está pensado para ayudar a la gente a iniciar el trabajo con Ostreococcus, pero de ninguna manera pretende describir todo lo que hay que saber acerca de la transformación genómica de esta microalga. Los autores la confianza que los lectores serán capaces de adaptar este protocolo a sus propias necesidades como las pequeñas diferencias en las incubadoras (los niveles de luz o de calidad) y otros parámetros que existen y que probablemente tienen que ser optimizadas en cada laboratorio en particular para obtener las culturas saludables necesarios para este protocolo. Después de dominar las técnicas descritas aquí,vectores pueden ser construidos para generar fluorescente luminiscente, u otros etiquetados líneas de fusión bajo el control de una amplia gama de promotores. Esta plataforma apasionante novela experimental será útil para estudiar cómo complicados problemas bioquímicos se resuelven en un eucariota de la reducción de la complejidad, en que los enfoques farmacológicos son muy facilitada 3.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Los componentes del medio </td></tr><tr><td> Químico </td><td colspan="2" > Número de catálogo </td><td> Proveedor </td></tr><tr><td> Instant Ocean Marine Sal </td><td colspan="3"> de <a href="http://amazon.co.uk" target="_blank">amazon.co.uk</a> o <a href="http://rocketaquatics.co.uk" target="_blank">rocketaquatics.co.uk</a> </td></tr><tr><td> NaNO 3 </td><td colspan="2"> S5506-250G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td colspan="2"> A9434-500G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Glicerol 2-fosfato disódico hidrato de sal </td><td colspan="2"> G9422-100G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> H 2 SEO 3 </td><td colspan="2"> 84920-250G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Ultrapura tris </td><td colspan="2"> 15504-020 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Na 2 EDTA • 2H 2 O </td><td colspan="2"> BPE120-500G </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 157740 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Na 2 MoO 4 • 2H 2 O </td><td colspan="2"> 31439-100G-R </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td colspan="2"> Z0251 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 31277 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td colspan="2"> 203734-5G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td colspan="2"> C8027 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> La vitamina B 12 (cianocobalamina) </td><td colspan="2"> V2876 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Biotina </td><td colspan="2"> 47868 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> • Tiamina HCl </td><td colspan="2"> T4625 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Ampicilina </td><td colspan="2"> A9518-25G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Neomicina </td><td colspan="2"> N6386 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Kanamicina </td><td colspan="2"> K4000 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td colspan="4"> Consumibles para el cultivo </td></tr><tr><td colspan="2"> Artículo </td><td> Número de catálogo </td><td> Proveedor </td></tr><tr><td colspan="2"> Cultivo de Tejidos Flask T25 cultivos en suspensión ventilados con Verter Canal </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Cultivo de Tejidos matraz T75 cultivos en suspensión ventilados con Verter Canal </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Cultivo de Tejidos Flask T175 cultivos en suspensión ventilados con Verter Canal </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP filtros para botellas, 1l, completos </td><td> 99950T </td><td> Bioscience Helena </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP filtros para botellas, 500 ml, </td><td> 99500T </td><td> Bioscience Helena </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP filtros para botellas, 250ml, </td><td> 99250T </td><td> Bioscience Helena </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP filtros para botellas, 150ml, </td><td> 99150T </td><td> Bioscience Helena </td></tr><tr><td colspan="2"> La salinidad del medidor para el Acuario Marino </td><td> DSG-10 </td><td> Daeyoon </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="3" > Productos químicos para la transformación </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Catálogonúmero </td><td> Proveedor </td></tr><tr><td> D-Sorbitol </td><td> S6021-1kg </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Pluronic F-68 solución </td><td> P5556-100ML </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> ClonNat </td><td> 51000 </td><td> Werner </td></tr><tr><td> Bajo punto de fusión de agarosa </td><td> 16520-050 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td colspan="3"> Consumibles para la transformación </td></tr><tr><td> Artículo </td><td> Número de catálogo </td><td> Proveedor </td></tr><tr><td> Cultivo de Tejidos Flask T25 cultivos en suspensión ventilados con Verter Canal </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Cultivo de Tejidos matraz T75 cultivos en suspensión ventilados con Verter Canal </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Frasco de cultivo de tejidos T175 Suspensión Cultures ventilados con Verter Canal </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Greiner tubos de centrifugación de 50 ml </td><td> 227261 </td><td> GBO </td></tr><tr><td> Gene Pulser / MicroPulser Cubetas, 0,2 cm, la brecha 50 </td><td> 165-2086 </td><td> Bio-Rad </td></tr><tr><td> Petri plato redondo PS 3 ORIFICIOS H14.2 Φ55 </td><td> 391-0895 </td><td> VWR International </td></tr><tr><td> Placa de Petri cuadrada con cuatro orificios de poliestireno estéril por 120 mm de la irradiación clara </td><td> FB51788 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Moonlight Blue filtro de luz </td><td> 183 </td><td> Lee Lighting </td></tr></tbody></table>

genomic transformation of the picoeukaryote ostreococcus tauri

Los problemas más comunes que impiden un rápido progreso en Ciencias de la planta incluyen tejido celular y la complejidad del organismo, y en particular el alto nivel de redundancia genómica que afecta a la genética simples en las plantas superiores. La novela de organismo modelo Ostreococcus Tauri es la más pequeña de vida libre eucariota conocido hasta la fecha, y posee un tamaño de genoma reducido en gran medida la complejidad celular y 1,2, que se manifiesta por la presencia de sólo uno de la mayoría de los orgánulos (mitocondrias, los cloroplastos, pila de Golgi) por celda, y un genoma que contiene sólo ~ 8000 genes. Además, la combinación de unicellularity y fácil cultivo proporciona una plataforma susceptible de enfoques de biología químicos. Recientemente, Ostreococcus ha sido empleado con éxito para estudiar los mecanismos básicos que subyacen a la hora normal circadiano 3-6. Los resultados de este organismo modelo han tenido un impacto no sólo ciencia de las plantas, sino también la biología de los mamíferos 7. Este ejemplo pone de relieve cómo la experimentación rápida en uneucariota sencillo del linaje verde puede acelerar la investigación en organismos más complejos mediante la generación de hipótesis comprobables mediante métodos técnicamente viables sólo en este contexto de menor complejidad. El conocimiento del genoma y la posibilidad de modificar los genes son herramientas esenciales en cualquier especie de modelo. 1 Genómica, transcriptómica 8, 9 y Proteómica información para esta especie está disponible gratuitamente, mientras que los métodos reportados previamente 6,10 para transformar genéticamente Ostreococcus se sabe que pocos laboratorios en el mundo. En este artículo, los métodos experimentales para transformar genéticamente este organismo modelo nuevo con una sobreexpresión construir mediante electroporación se describen en detalle, así como el método de inclusión de las células transformadas en porcentaje de agarosa de bajo para permitir la selección de líneas transformadas procedentes de una sola transformada celular. A raíz de la aplicación exitosa de OstreocoCCU a la investigación circadiano, el interés creciente en Ostreococcus se puede esperar de diversas áreas de investigación dentro y fuera de las ciencias de las plantas, incluidas las áreas biotecnológicas. Los investigadores de una amplia gama de ciencias biológicas y médicas que trabajan en conservadas vías bioquímicas puede considerar la investigación buscando en Ostreococcus, libre de la complejidad genómica y organismal de las especies modelo más grande.

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Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

En este artículo se describe la transformación genética del alga marina unicelular<em&gt; Ostreococcus tauri</em&gt; Por electroporación. Este organismo eucariota es una plataforma modelo eficaz para las plantas superiores, que parecen haber reducido en gran medida la complejidad genómica y celular y ser fácilmente susceptibles de cultivo celular y biología química.

Transformación de Genómica de la Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

genomic-transformation-of-the-picoeukaryote-ostreococcus-tauri

Research

JoVE Journal

Biology

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

El aislamiento de ADN genómico de colas de ratón

Investigación

Biología

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

Inserte grandes Ambiental Genómica Producción Biblioteca

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Generación de ADN / ARN híbridos en el ADN genómico de transformación utilizando oligonucleótidos de ARN que contiene

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

Genómica resonancia magnética - un recurso público para el estudio de patrones de secuencia en el ADN genómico

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Pantallas competitiva Genómica de Bibliotecas de levadura con código de barras

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Captura selectiva de 5-hidroximetilcitosina a partir de ADN genómico

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

Matriz de hibridación genómica comparada (CGH array) para la detección de número de copias genómicas variantes

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificación, secuenciación de próxima generación, y Genómica Mapeo de ADN retrovirales sitios de integración

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

La secuenciación de ARN dirigidos Ensayo para caracterizar la expresión génica y la genómica alteraciones

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

Preparación e inyección de embriones de mosquitos Culex para generar mutaciones nulas utilizando CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...