Name: genomic transformation of the picoeukaryote ostreococcus tauri
Uploaded: 2012-07-13T13:00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri at JoVE.com

SynthSys ett centrum för integrativ systembiologi finansieras av BBSRC och EPSRC utmärkelse D019621. EU FP6 Network of Excellence &quot;marina Genomics&quot; bidrag till FYB har finansierat utvecklingen av genetisk transformation metoder.

1. Framställning av algmaterial <ol><li> Ostreococcus celler odlas i artificiellt havsvatten (ASW). Havssalter (typiskt omkring 40 gram per liter) löses i avjoniserat vatten till en salthalt av 30 ppt, mätt med användning av en salthalt mätare. Anrikningssubstrat 11,12, spårämnen metall och vitaminer läggas till som beskrivs i tabellerna 1-3. Medierna är då filtersteriliserades genom ett 0,22 pm filter. </li><li> För underhåll, celler av Ostreococcus stam OTTH95 är subodlas aseptiskt vid en utspädning av 1/100 i färsk ASW var 7 dagar och vuxit under konstant ljus i en växters tillväxt inkubator försedd med Moonlight blått filter. Ljusintensiteten ska vara nära 20 mol m -2 s -1 och temperatur hålls vid 20 ° C. Celler kräver inte konstant omrörning, men skakas gång var 2 till 3 dagar för att förhindra aggregation. </li><li> För varje transformation är 50 ml celler krävs vid en cell density av 20-30 x 10 6 ml -1, som skall uppnås 5-7 dagar efter subodling. Ungefärliga celldensitet och axeny kan bestämmas med användning av antingen flödescytometri eller en hemocytometer vid ett minimum av x40 förstoring. </li></ol> 2. Elektroporering <ol><li> Framställa DNA för transformation. För varje transformation, 5 | ig av ren, lineariserad plasmid-DNA som krävs vid en koncentration av 1 pg / pl i sterilt avjoniserat vatten. För att erhålla detta DNA, författarna rekommendera att använda en Qiagen Midi prep-kit, även om andra metoder kan fungera lika bra. Digerera med ett enzym som klyver i huvudkedjan av den använda vektorn, men inte i transgen eller selektionsgen. Ytterligare rena och koncentrera den resulterande linjära DNA genom etanolprecipitering och återsuspendera produkten i en lämplig volym av hög kvalitet sterilt avjoniserat vatten. </li><li> Förbered mikrocentrifugrör innehållande 5 ng DNA för varje transformation. En kontrol med ingen DNA som är nödvändigt för varje cellinje som skall transformeras. Håll dessa rör på is tillsammans med en 2 mm elektroporering kyvett för varje transformation. </li><li> Förbered 2,2 ml återsuspensionsbufferten per omvandling. Lös Sorbitol till en 1 M lösning i ddHaO 2 O, tillsätt 0,1-syra% pluronic F68 och filtersterilisera. </li><li> Tillsätt pluronsyra F68, till en slutlig koncentration av 0,1% till cellerna, och pelleten dem under 10 minuter vid 8000x g vid 10 ° C i en 50 ml rör med konisk botten. Omedelbart återsuspendera cellerna i 1 ml resuspensionsbuffert genom pipettering upp och ner, och överför till ett mikrofugrör. Snurra i 10 minuter vid 8000 xg vid 10 ° C, och arbetar snabbt, upprepa detta tvättsteg gång. </li><li> Med en cut spets, resuspendera varje slutliga pelleten i 40 | il av återsuspensionsbufferten. Tillsätt 40 pl av de återsuspenderade cellerna till varje rör av lineariserad DNA på is, blanda försiktigt och överföra till elektroporation kuvetten. </li><li> Sätt kyvetten i electroporation maskin. Ändra inställningarna till 6 kV cm -1, 600 Ω och 25 uF. Elektroporera cellerna. </li><li> Inkubera electoporated cellerna i kyvetten vid rumstemperatur under 10 minuter, och använda denna tidpunkt för att framställa de vävnadsodlingskolvar. Etikettera dem och tillsätt 30 ml färsk ASW till varje. Tag 1 ml av varje kolv och försiktigt lägga till motsvarande kyvetten. Inkubera i 2 minuter och ta försiktigt bort ASW, som nu innehåller globule av celler och försiktigt och långsamt pipettera direkt in i ASW i kulturen kolven. </li><li> Celler förblir vanligtvis i en kula. Var noga med att inte skaka eller störa aggregerade cellerna just nu. Tillåta cellerna återhämta sig under inkubator under 1-2 timmar, därefter återsuspendera genom skakning av flaskorna. Vid denna tid bör cellerna blandas fritt och inga klumpar ska vara synligt. Lämnar kulturerna återhämta sig över natten i inkubatorn. </li></ol> 3. Införande av celler på plattor i halvfast medium <ol><li&gt; Nästa dag autoklaveras en lösning av 2,1% låg smältpunkt agaros i ddHaO 2 O i en flaska som innehåller en omrörningstav. Hålla smält vid 65-90 ° C i en större bägare som innehåller vatten på en uppvärmning magnetomrörare. För varje transformation förbereda 8 petriskålar (55 mm diameter) och 8 x 15 ml rör var och en innehåller 9 ml av ASW plus önskad valet. Om du använder Nourseothricin eller G418, använda 2 mg / ml. </li><li> Samla de transformerade cellerna från inkubatorn. Arbetar i en steril flowhood, tillsätt 1 ml kokande LMP-agaros till 9 ml i ett av rören. Stänga röret och blanda genom att invertera. Tillsätt sedan 0,5 ml färskt transformerade celler, snabbt blanda och hälla in i plattan. Upprepa denna process med de återstående 7 rören och sedan gå vidare till nästa transformation kolven. </li><li> Lämnar plattorna öppna i dragskåp under en timme, för agaros härda. Stäng sedan plattorna och överföra dem till stora torget petriskålar, som kommer att hålla 4 plattor vardera. Täta torget plattor with parafilm. Notera att plattorna inte kommer att helt och hållet, och som ett resultat, är gelén mycket bräcklig. Försiktighet bör iakttas för att inte bryta gelen vid hantering av plattorna. Placera alla fyrkantiga plattor i inkubatorn. </li></ol> 4. Selektion av transformerade kolonier <ol><li> Kolonier ska visas efter 10 till 21 dagar om ombildning plattorna, men inte på de omvandlade håna plattorna. Att plocka kolonier använda en 200 ul pipett med cut-off tips. Välj helt enkelt fria kolonier och suga ut den gröna kolonin. Var noga med att inte innehåller några celler från närliggande kolonier. </li><li> Överföra cellerna till 2 ml flytande medium innehållande markeringen i en 24 brunnars platta. När du använder Nourseothricin använder 1,75 mg / ml. Blanda genom att pipettera upp och ner. Välj 24-50 kolonier per omvandling. Försegla plattorna med parafilm och överföring till inkubatorn. </li><li> Efter en vecka, överför 100 pl av varje brunn till 2 ml färsk ASW med selektion i en 24 brunnars platta och växa för en additional 7 dagar. Överlevande cellinjer kan användas för ytterligare studier. Stabil integrering in i genomet och infogning antal bör analyseras med användning av PCR och Southern blöt. DNA-materialet kan erhållas för dessa ändamål med hjälp av någon ned-skalat standardmetod för växt-DNA-extraktion. </li></ol> 5. Representativa resultat Cellerna delades 1/100 nått en densitet på 25 miljoner celler per milliliter efter odling i 7 dagar. Elektroporering av cellerna med lämpliga inställningar resulterade i en tid konstant mellan 10 och 14 millisekunder. När cellerna överförs till medium i odlingsflaskor, bör en kula av celler bildas. Då skakas lätt efter en timme, bör cellerna blandas lätt. Införande av 1 omvandlade ml celler till 0,2% LMP agar bör resultera i en enhetlig men bara halvfast gel. Kolonier ska visas efter 10 till 21 dagar. När transformerande 5 pg av lineariserad DNA med användning av protokollet ovan, 50-100 kolonier per transformationplatta vanligtvis förväntas jämfört med ingen på de negativa kontroll plattorna. ~ 80% av plockade kolonier positivt ut av antibiotikaresistens i flytande medium och användes i efterföljande studier. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Slutkoncentration </td><td> Stamlösning </td><td> Volym för 1 liter </td></tr><tr><td> NaNOs 3 </td><td> 8,83 x 10 -4 M </td><td> 75 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> NH4Cl- </td><td> 3,63 x 10 -5 M </td><td> 2,68 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> β-glycerofosfat </td><td> 1 x 10-5M </td><td> 2,16 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> H 2 SeO 3 </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 1,29 mg / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Tris-bas (pH 7,2) </td><td> 1 x 10 M -3 </td><td> 121,1 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> K spårmetall-lösning </td><td></td><td> Tabell 2 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> f / 2 vitamin-lösning </td><td></td><td> Tabell 3 </td><td> 0,5 ml </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Beståndsdelarna i mediet för tillväxt av O. Tauri 11, 12. Fyll en total volym på 1 liter konstgjorda havsvatten till en salthalt på 30 ppt och lägger komponenterna ovan från lager lösningar anges. Filtersterilisera mediet och använd inom en vecka. Lager av alla föreningar utom vitaminlösning kan slås samman för att lägga 6 ml av denna lösning till varje liter medium. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Slutkoncentration </td><td> Stamlösning </td><td> Belopp för 1 liter </td></tr><tr><td> Na 2 </sUB&gt; EDTA • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 -4 M </td><td></td><td> 41,6 g </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td> 1 x 10-5M </td><td></td><td> 3,15 g </td></tr><tr><td> Na 2 Moo 4 • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 6,3 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td> 1 x10-9 M </td><td> 22,0 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6H 2 O </td><td> 1 x10-9 M </td><td> 10,0 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> MnCb 2 • 4 H2O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 180,0 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 9,8 g / L dH <sub&gt; 2 O </td><td> 1 ml </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Spårmetallösning 11,12. Fyll till totalt 1 liter i dH 2 O, och värme för att lösa. Alikvotera lösningen och frysa för lagring. Slutkoncentrationer som anges avser den slutliga mediet, inte spårmetall-lösning. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Slutkoncentration </td><td> Stamlösning </td><td> Belopp för 1 liter </td></tr><tr><td> Vitamin B 12 </td><td> 1 x 10 -10 M </td><td> 1 g / L dH 2 O </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Biotin </td><td> 1 x10-9 M </td><td> 0,1 g / L dH 2 O </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Tiamin • HCl </td><td> 1 x 10 -7 M </td><td></td><td> 200 mg </td></tr></tbody></table> Tabell 3. f / 2vitamin lösning 11. Fyll upp till totalt 1 liter i dH 2 O, filter-sterilisera, alikvot och frys. Slutkoncentrationer som anges avser den slutliga mediet, inte vitaminlösning. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig1.jpg" /> Figur 1. Grafisk översikt av transformationsproceduren. Schematisk representation av processen för att genetiskt transformera Ostreococcus Tauri genom elektroporation. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig2.jpg" /> Figur 2. Kultur tillväxt. Celler är subodlas aseptiskt vid en utspädning av 1/100 i färsk ASW var 7 dagar och vuxit under konstant ljus i en växters tillväxt inkubator försedd med Moonlight blått filter. Ljusintensiteten ska vara nära 20 mol m -2 s -1 och temperatur hålls vid 20 ° C-celler inte kräver konstant omrörning, men är sHaken gång var 2 till 3 dagar för att förhindra aggregation. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig3.jpg" /> Figur 3. Kolonibildning på 0,2% LMP agaros. Transfer 4 plattor för en stor fyrkantig petriskål och tätning med parafilm (överst till vänster). När kolonierna har bildat väljer du helt enkelt gratis (helst koniskt formade) kolonier (överst till höger) och suga ut dem av plattan med en P200 pipett. Det bör inte finnas några kolonier på den negativa kontrollen (nederst till höger).

<ol>
	<li>Derelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+analysis+of+the+smallest+free-living+eukaryote+Ostreococcus+tauri+unveils+many+unique+features.">Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).</li><li>Henderson, G. P., Gan, L., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+ultrastructure+of+O.+tauri:+electron+cryotomography+of+an+entire+eukaryotic+cell.">3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell.</a> PLoS One. 2, e749 (2007).</li><li>O'Neill, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+persist+without+transcription+in+a+eukaryote.">Circadian rhythms persist without transcription in a eukaryote.</a> Nature. 469, 554-558 (2011).</li><li>van Ooijen, G., Dixon, L. E., Troein, C., Millar, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+function+is+required+for+biological+timing+throughout+the+twenty-four+hour+cycle.">Proteasome function is required for biological timing throughout the twenty-four hour cycle.</a> Curr. Biol. 21, 869-875 (2011).</li><li>Troein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+light+inputs+to+a+simple+clock+circuit+allow+complex+biological+rhythms.">Multiple light inputs to a simple clock circuit allow complex biological rhythms.</a> Plant. J. 66, 375-385 (2011).</li><li>Corellou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clocks+in+the+green+lineage:+comparative+functional+analysis+of+the+circadian+architecture+of+the+picoeukaryote+ostreococcus.">Clocks in the green lineage: comparative functional analysis of the circadian architecture of the picoeukaryote ostreococcus.</a> Plant Cell. 21, 3436-3449 (2009).</li><li>O'Neill, J. S., Reddy, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+clocks+in+human+red+blood+cells.">Circadian clocks in human red blood cells.</a> Nature. 469, 498-503 (2011).</li><li>Monnier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrated+transcription+of+biological+processes+in+the+marine+picoeukaryote+Ostreococcus+exposed+to+light/dark+cycles.">Orchestrated transcription of biological processes in the marine picoeukaryote Ostreococcus exposed to light/dark cycles.</a> B.M.C. Genomics. 11, 192 (2010).</li><li>Le Bihan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+proteomic+analysis+of+the+unicellular+alga+Ostreococcus+tauri.">Shotgun proteomic analysis of the unicellular alga Ostreococcus tauri.</a> J. Proteomics. 74, 2060-2070 (2011).</li><li>Corellou, F., Bouget, F. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+polypeptides+from+the+nuclear+genome+of+Ostreococcus+sp.">Expression of polypeptides from the nuclear genome of Ostreococcus sp.</a> US application patent. , (2010).</li><li>Guillard, R. R. L., Ryther, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+marine+planktonic+diatoms.+I.+Cyclotella+nana+Hustedt,+and+Detonula+confervacea+(cleve)+Gran.">Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran.</a> Can. J. Microbiol. 8, 229-239 (1962).</li><li>Keller, M. D., Selvin, R. C., Claus, W., Guillard, R. R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media+for+the+culture+of+oceanic+ultraphytoplankton.">Media for the culture of oceanic ultraphytoplankton.</a> J. Phycol. 23, 633-638 (1987).</li><li>Djouani-Tari, e. l. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phosphate-regulated+promoter+for+fine-tuned+and+reversible+overexpression+in+Ostreococcus:+Application+to+circadian+clock+functional+analysis.">A phosphate-regulated promoter for fine-tuned and reversible overexpression in Ostreococcus: Application to circadian clock functional analysis.</a> PLoS One. 6, e28471 (2011).</li><li>Moulager, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+light+signals+by+the+retinoblastoma+pathway+in+the+control+of+S+phase+entry+in+the+picophytoplanktonic+cell+Ostreococcus.">Integration of light signals by the retinoblastoma pathway in the control of S phase entry in the picophytoplanktonic cell Ostreococcus.</a> PLoS. Genet. 6, e1000957 (2010).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

Cellular staten och kultur axeny är av avgörande betydelse för omvandlingen förfarandet. Även celler upprätthålles vanligen i cykler om 12 timmar ljus, var 12 h mörker, transformationseffektiviteten i celler som odlats under dessa betingelser visade sig vara otillräckliga. Under de upprepade pelletering / resuspension steg bör cellerna återsuspendera alltid lätt. Om celler tillsammans, eller en slem-liknande substansen är närvarande är det bättre att börja proceduren från början igen. Normalt kan cirka 50 kolonier kan förväntas på varje transformation plattan, jämfört ingen på den negativa kontrollen plattan. Vid låg transformationseffektivitet bör odlingsbetingelser kan varieras för att säkerställa cellerna är i optimalt tillstånd. Variabler som påverkar transformationseffektivitet inkluderar omgivande temperaturen i laboratoriet (bör vara nära 20 ° C) och hantering hastighet (proceduren från pelletering celler [2,3] till återhämtning [2,7] bör ta ~ 1 timme). Det är också viktigt att alla lösningar enRe gjorde färska före varje transformation. För införande i plattor, är koncentrationen av LMP-agaros avgörande. Ostreococcus celler kommer inte att växa i höga koncentrationer agaros, och kommer att diffundera i låga koncentrationer. Tre transformationsvektorer för Ostreococcus har publicerats tidigare 6, och fler vektorer förväntas genereras och publiceras inom kort. Den existerande vektorn Pot-Luc 6 tillåter användningen av en promotor som väljs i kombination med en C-terminal eldflugeluciferas tagg tillåta snabbare transgen linjeval plus hanterlig mönster expressionsvektorer, medan Potox vektorn 6 bär starkt inducerbara promotom 13 tas från den Ostreococcus hög affinitet Fosfat Transportör (HAPT)-genen för överexpression av genen av intresse. Den Potox-Luc vektor härstammar från Potox, som bär en ytterligare luciferas markör som kan användas för indirekt val av överuttryck linjer <sup&gt; 14. Framgångsrika selektionsmarkörer på dessa vektorer är Nourseothricin och G148. Emellertid Ostreococcus celler är mycket resistent mot många antibiotika, och koncentrationerna av föreningar som är nödvändiga för selektion av transgena Ostreococcus celler är högre än för konventionella modellsystem (2 mg / ml). Även om processen visas ineffektiv, utgör det stora antalet celler och plasmid-DNA som behövs för detta förfarande ingen signifikant hinder. En större begränsning är att varje genererad linje som är resistent mot den selekterbara markören måste analyseras individuellt för att kontrollera att hela konstruktionen är integrerad i DNA. Vi har observerat exempel där lyckade uttryck av den valbara markören inte motsvarar införandet av den faktiska genen av intresse, det vill säga partiella integrationer kan förekomma. Uppenbarligen innebär slumpmässig insättning i genomet också att det inte finns någon kontroll av införingsstället användning av denna metod, och metoder bföljer ofta önskemål om homolog rekombination för närvarande utvecklas. Men beskrivs metoden här är, såvitt vi vet, för närvarande den enda kännetecknas metoden för att skapa genetiskt modifierade Ostreococcus celler. Som Ostreococcus Tauri har först nyligen använts som en experimentell modell organism, är de flesta metoder som arbetar med dessa celler kan utvecklas och förfinas av den växande inblandade forskarsamhället. Detta protokoll är tänkt att hjälpa människor påbörja arbetet med Ostreococcus, men på något sätt anspråk på att beskriva allt som finns att veta om genomisk omvandling av denna mikroalg. Författarna förtroende som läsare kommer att kunna anpassa detta protokoll till sina egna behov som små skillnader i kuvöser (ljusnivåer eller kvalitet) och andra parametrar kommer att finnas och sannolikt måste optimeras i varje enskilt laboratorium för att få de friska kulturerna som behövs för detta protokoll. Efter bemästra de tekniker som beskrivs här,vektorer kan konstrueras för att generera lysande, fluorescerande eller andra taggade linjer fusion under kontroll av en rad promotorer. Denna spännande nya experimentell plattform kommer att vara användbart att studera hur komplicerade biokemiska problem löses i en eukaryot av minskad komplexitet, där farmakologiska metoder är mycket underlättas 3.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Beståndsdelarna i mediet </td></tr><tr><td> Kemisk </td><td colspan="2" > Katalognummer </td><td> Leverantör </td></tr><tr><td> Instant Ocean Marine Salt </td><td colspan="3"> från <a href="http://amazon.co.uk" target="_blank">amazon.co.uk</a> eller <a href="http://rocketaquatics.co.uk" target="_blank">rocketaquatics.co.uk</a> </td></tr><tr><td> NaNOs 3 </td><td colspan="2"> S5506-250G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> NH4Cl- </td><td colspan="2"> A9434-500G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Glycerol 2-fosfat-dinatriumsalt-hydrat </td><td colspan="2"> G9422-100G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> H 2 SeO 3 </td><td colspan="2"> 84.920-250G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Ultraren tris </td><td colspan="2"> 15504-020 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Na 2 EDTA • 2H 2 O </td><td colspan="2"> BPE120-500G </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 157.740 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Na 2 Moo 4 • 2H 2 O </td><td colspan="2"> 31.439-100G-R </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td colspan="2"> Z0251 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 31.277 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> MnCb 2 • 4 H2O </td><td colspan="2"> 203.734-5G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td colspan="2"> C8027 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Vitamin B 12 (cyanokobalamin) </td><td colspan="2"> V2876 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Biotin </td><td colspan="2"> 47.868 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Tiamin • HCl </td><td colspan="2"> T4625 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td colspan="2"> A9518-25G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Neomycin </td><td colspan="2"> N6386 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Kanamycin </td><td colspan="2"> K4000 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td colspan="4"> Tillsatsmaterial för odling </td></tr><tr><td colspan="2"> Objektet </td><td> Katalognummer </td><td> Leverantör </td></tr><tr><td colspan="2"> Vävnadsodlingskolv T25 Suspensionsodlingar ventileras med hällkanal </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Vävnadsodlingskolv T75 Suspensionsodlingar ventileras med hällkanal </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Vävnadsodlingskolv T175 Suspensionsodlingar ventileras med hällkanal </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP Bottle top filter, 1L, kompletta </td><td> 99950T </td><td> Helena Bioscience </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP Bottle top filter, 500 ml, </td><td> 99500T </td><td> Helena Bioscience </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP Bottle top filter, 250ml, </td><td> 99250T </td><td> Helena Bioscience </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP flasktopp filter, 150 ml, </td><td> 99150T </td><td> Helena Bioscience </td></tr><tr><td colspan="2"> Salthalten mätaren för Marine Aquarium </td><td> DSG-10 </td><td> Daeyoon </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="3" > Kemikalier för transformation </td></tr><tr><td> Kemisk </td><td> Katalogantal </td><td> Leverantör </td></tr><tr><td> D-sorbitol </td><td> S6021-1KG </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Pluronic F-68 lösning </td><td> P5556-100ML </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> ClonNat </td><td> 51 tusen </td><td> Werner </td></tr><tr><td> Agaros med låg smältpunkt </td><td> 16520-050 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td colspan="3"> Förbrukningsmaterial för transformation </td></tr><tr><td> Objektet </td><td> Katalognummer </td><td> Leverantör </td></tr><tr><td> Vävnadsodlingskolv T25 Suspensionsodlingar ventileras med hällkanal </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Vävnadsodlingskolv T75 Suspensionsodlingar ventileras med hällkanal </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Vävnadsodlingskolv T175 suspension Cultures ventileras med hällkanal </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Greiner centrifugrör 50ml </td><td> 227.261 </td><td> GBO </td></tr><tr><td> Gene Pulser / MicroPulser kyvetter, 0,2 cm gap, 50 </td><td> 165-2086 </td><td> Bio-Rad </td></tr><tr><td> Petriskålen rund PS 3 ventilationsöppningar H14.2 Φ55 </td><td> 391-0895 </td><td> VWR International </td></tr><tr><td> Petriskål torg med fyra ventiler polystyren sterila av strålning klart 120mm </td><td> FB51788 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Månljus Blue ljusfilter </td><td> 183 </td><td> Lee Ljus </td></tr></tbody></table>

genomic transformation of the picoeukaryote ostreococcus tauri

Vanliga problem som hindrar snabba framsteg i växtforskning omfattar cell-, vävnads-och hela organismen komplexitet, och i synnerhet den höga genomisk redundans påverkar enkla genetik i högre växter. Den nya modellen organismen Ostreococcus Tauri är den minsta fritt levande eukaryot känt hittills, och har en kraftigt reducerad genomstorlek och cellulära komplexitet 1,2, manifesteras genom närvaron av en enda av de flesta organeller (mitokondrien, kloroplast, Golgi stack) per cellen, och en genom som innehåller endast ~~~HEAD=NNS 8000 gener. Vidare ger kombinationen av unicellularity och enkelt kulturen en plattform mottaglig för strategier Chemical Biology. Nyligen har Ostreococcus framgångsrikt använts för att studera mekanismerna som ligger till grund cirkadiska tidtagning 3-6. Resultat från denna modell organism har påverkat inte bara Plant Science, men också däggdjursbiologi 7. Detta exempel belyser hur snabbt experiment i enenkelt eukaryot från den gröna linjen kan accelerera forskningen i mer komplexa organismer genom att generera testbara hypoteser med hjälp av metoder tekniskt genomförbara bara denna bakgrund av minskad komplexitet. Kunskap om ett genom och möjligheten att ändra gener är viktiga verktyg i alla modeller arter. Genomic 1, Transcriptomic 8 och proteomik 9 för den här arten är fritt tillgänglig, medan de tidigare rapporterade metoder 6,10 genetiskt omvandla Ostreococcus är kända för att få laboratorier över hela världen. I den här artikeln, de experimentella metoder omvandla genetiskt denna roman modellen organism med ett överuttryck konstruktion med hjälp av elektroporation beskrivs i detalj, liksom metoden för införandet av transformerade celler i låg procent agaros för att möjliggöra selektion av transformerade linjer som härrör från en enda transformerad cell. Efter en framgångsrik tillämpning av OstreocoCCU till dygnsrytm forskning kan växande intresse för Ostreococcus kan förväntas av olika forskningsområden inom och utanför växtforskning, inklusive biotekniska områden. Forskare från ett brett spektrum av biologiska och medicinska vetenskaper som arbetar på bevarade biokemiska vägar kan överväga att bedriva forskning inom Ostreococcus, fri från genomiska och organismbiologi komplexitet större modell arter.

Watch this Scientific Journal Video about Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri at JoVE.com

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Denna artikel beskriver genetisk omvandling av encelliga marina algen<em&gt; Ostreococcus Tauri</em&gt; Genom elektroporation. Detta eukaryot organism är en effektiv modell plattform för högre växter, possesing kraftigt reducerad genomisk och cellulär komplexitet och är lätt mottaglig för både cellkultur och kemisk biologi.

Genomiskt Transformation av Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus Tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

genomic-transformation-of-the-picoeukaryote-ostreococcus-tauri

Research

JoVE Journal

Biology

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolering av genomisk DNA från mus Tails

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

Stora Sätt Miljö Genomic Bibliotek Produktion

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Generering av RNA / DNA-hybrider i Genomiskt DNA genom omvandling med hjälp av RNA-innehållande oligonukleotider

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

Genomic MR - en allmän resurs för att studera Sequence Patterns inom Genomiskt DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Konkurrenskraftiga Genomic skärmar av streckkodade Jäst bibliotek

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Selektiv fångst av 5-hydroxymethylcytosine från genomisk DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

Array jämförande genomik hybridisering (Array CGH) för detektion av genomiska Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Förstärkning, Nästa generations sekvensering, och Genomic DNA Kartläggning av retroviral integration webbplatser

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

Riktade RNA Sequencing analys för att karaktärisera Gene Expression och Genomic Ändringar

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

Förbereda och injicera embryon från Culex myggor för att generera nullmutationer med CRISPR / Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...