Name: gene transfer into older chicken embryos by ex ovo electroporation
Uploaded: 2012-07-27T12:00:00
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Este trabalho foi financiado por uma doação da Fundação Alemã de Pesquisa (DFG; LU1455/1-1).

1. Cultura Ex ovo <ol><li> Frescas ovos fertilizados são colocados em seu lado mais longo em uma forçada projecto incubadora (BSS160, Ehret, Alemanha) a 37,5 ° C com umidade de 60% para a incubação. Ovos armazenados a 12 ° C durante mais de uma semana não deve ser utilizado. </li><li> Após a incubação durante 2,5 dias (cerca de estágio HH17), retire os ovos e rotular o topo com um lápis para indicar a direção para quebrar. </li><li> Antes de craqueamento, verter cerca de 20 ml de água destilada...

<ol>
	<li>Momose, T., Tonegawa, A., Takeuchi, J., Ogawa, H., Umesono, K., Yasuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation.">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).</li><li>Luo, J., Ju, M. J., Lin, J., Yan, X., Markus, A., Mix, E., Rolfs, A., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-20+expression+by+motor+neurons+is+regulated+by+Sonic+hedgehog+during+spinal+cord+development.">Cadherin-20 expression by motor neurons is regulated by Sonic hedgehog during spinal cord development.</a> NeuroReport. 20, 365-370 (2009).</li><li>Luo, J., Ju, M. J., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regionalized+cadherin-7+expression+by+radial+glia+is+regulated+by+Shh+and+Pax7+during+chicken+spinal+cord+development.">Regionalized cadherin-7 expression by radial glia is regulated by Shh and Pax7 during chicken spinal cord development.</a> Neuroscience. 142, 1133-1143 (2006).</li><li>Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-+and+loss-of-function+in+chick+embryos+by+electroporation.">Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation.</a> Mech. Dev. 121, 1137-1143 (2004).</li><li>Dai, F., Yusuf, F., Farjah, G. H., Brand-Saberi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi-induced+targeted+silencing+of+developmental+control+genes+during+chicken+embryogenesis.">RNAi-induced targeted silencing of developmental control genes during chicken embryogenesis.</a> Dev. Biol. 258, 80-90 (2005).</li><li>Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+comparative+study+of+RNAi+methodologies+by+in+ovo+electroporation+in+the+chick+embryo.">In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo.</a> Dev. Dyn. 231, 592-600 (2004).</li><li>Kos, R., Tucker, R. P., Hall, R., Duong, T. D., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+introducing+morpholinos+into+the+chicken+embryo.">Methods for introducing morpholinos into the chicken embryo.</a> Dev. Dyn. 226, 470-477 (2003).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li><li>Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+procedure+for+the+long-term+cultivation+of+chicken+embryos.">A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev. Biol. 10, 391-394 (1974).</li><li>Luo, J., Treubert-Zimmermann, U., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherins+guide+migrating+Purkinje+cells+to+specific+parasagittal+domains+during+cerebellar+development.">Cadherins guide migrating Purkinje cells to specific parasagittal domains during cerebellar development.</a> Mol. Cell. Neurosci. 25, 138-152 (2004).</li><li>Luo, J., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+ovo+electroporation+for+gene+transfer+into+older+chicken+embryos.">Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos.</a> Dev. Dyn. 233, 1470-1477 (2005).</li><li>Treubert-Zimmermann, U., Heyers, D., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+axons+to+specific+fiber+tracts+in+vivo+by+altering+cadherin+expression.">Targeting axons to specific fiber tracts in vivo by altering cadherin expression.</a> J. Neurosci. 22, 7617-7626 (2002).</li></ol>

Este protocolo fornece um guia para a transferência de genes em embriões de galinha mais velhos (por exemplo, para o tecto óptico em E6) por electroporação in ovo ex. Este método estende a utilização de electroporação de embriões de galinha mais velhos e pode ser facilmente aplicado a muitos laboratórios para estudar a função do gene in vivo em fases posteriores. Embriões de E4, a pelo menos E7 pode com sucesso ser electroporado por este método e os embriões eletroporados pode ser sobr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> Electroporator </td><td> Nepa Gene, Japão </td><td> CUY21-Edit </td></tr><tr><td> Eletrodos </td><td> Nepa Gene, Japão </td><td> CUY661-3x7 </td></tr><tr><td> Ovo incubadora </td><td> Ehret, Alemanha </td><td> BSS160 </td></tr><tr><td> Embrião incubadora </td><td> BINDER GmbH, Alemanha </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio fluorescente </td><td> Keyence, Deutschland GmbH </td><td> BZ-8000 </td></tr><tr><td> Placa de Petri </td><td> Greiner Bio-One GmbH, Alemanha </td><td></td></tr><tr><td> Extrator de microeletrodos </td><td> Mundo Precision Instruments, Alemanha </td><td> PUL-100 </td></tr></tbody></table>

gene transfer into older chicken embryos by ex ovo electroporation

O embrião de galinha fornece um sistema modelo excelente para estudar a função e regulação de genes durante o desenvolvimento embrionário. Em electroporação in ovo é um método poderoso para sobre-expressar genes exógenos ou para baixo-regular os genes endógenos in vivo em embriões de galinha 1. Diferentes estruturas, tais como genes de DNA plasmídeos codificando 2-4, pequena interferência RNA (siRNA) plasmídeos 5, pequeno sintético RNA oligos 6, e os oligonucleótidos anti-sentido morfolino 7 pode ser facilmente transfectado em embriões de galinha por electroporação. No entanto, a aplicação de eletroporação em ovo é limitada aos embriões em estágios iniciais de incubação (menores de estágio HH20 - de acordo com Hamburgo e Hamilton) 8 e existem algumas desvantagens para a sua aplicação em embriões em estágios mais avançados (com mais de estágio HH22 - cerca de 3,5 dias de desenvolvimento). Por exemplo, a membrana vitelina em fases posteriores é usualiado preso à membrana devem e abrir uma janela no shell provoca ruptura dos vasos, resultando na morte dos embriões; embriões mais velhos são cobertos por vitelina e alantóide navios, onde é difícil de acessar e manipular os embriões; embriões mais velhos mover vigorosamente e é difícil de controlar a orientação através de uma janela relativamente pequena na concha. Neste protocolo, demonstramos um método de eletroporação ex ovo de transferência de genes em embriões de galinha em estágios mais avançados (com mais de estágio HH22). Para eletroporação in ovo ex, os embriões são cultivadas em placas de Petri de 9 e vitelina e alantóide embarcações são amplamente difundidos. Sob estas condições, os embriões de galinha mais velhos são facilmente acessíveis e manipulado. Portanto, este método supera as desvantagens de ovo em electroporação aplicado aos embriões de galinha mais velhos. Usando este método, os plasmídeos podem ser facilmente transfectado em diferentes partesdos embriões de galinha mais velhos 10-12.

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Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

Um método de transferência de genes em embriões de galinha em fases posteriores de incubação (com mais de Hamburger e Hamilton fase (HH) 22) é descrito. Este método supera as desvantagens dos<em&gt; In ovo</emEletroporação&gt; aplicado aos embriões de galinha e mais velhos é uma técnica útil para estudar a função e regulação gênica em estádios mais avançados de desenvolvimento.

Transferência de Embriões em Gene de frango por mais velhos<em&gt; Ovo ex</em&gt; Eletroporação

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

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Transferência nuclear em oócitos de camundongos

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Biologia

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos

In Utero injeção intraventricular e eletroporação de embriões de camundongos E15

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

Fator de Crescimento colocando-Revestido Beads em embriões de galinha Early Stage

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

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Em Electroporations Ovo de Estágio HH 10 embriões de galinha

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

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Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

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No útero e ex eletroporação in vivo para Expressão Gênica em células ganglionares da retina do rato

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

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Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...