Name: automated quantification of synaptic fluorescence in c. elegans
Uploaded: 2012-08-10T12:00:00
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Gli autori desiderano ringraziare A. Benham per l&#39;assistenza allo sviluppo del protocollo. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH concessione NS06747 al BAB

1. Preparazione di Worms per l&#39;imaging Questo segmento del protocollo si basa su Published C. tecniche di coltura elegans 1,2, e viene illustrato in Figura 1. <ol><li> Crescere vermi su alti peptoni piastre di agar NGM (10 cm) con teste di serie NA22 E. coli fino quasi morire di fame. Se immunostaining, una piastra in modo affidabile a sufficienza per produrre i vermi 1 macchia individuale, tenendo conto delle perdite lungo la stra...

<ol>
	<li>Christensen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primary+culture+system+for+functional+analysis+of+C.+elegans+neurons+and+muscle+cells.">A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells.</a> Neuron. 33, 503-514 (2002).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li><li>Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+accumulation+of+the+terminal+differentiation+factor+LIN-29+during+Caenorhabditis+elegans+development.">Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development.</a> Development. 122, 2517-2527 (1996).</li><li>Davis, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+lysosomal+trafficking+as+a+mechanism+for+regulating+GABAA+receptor+abundance+at+synapses+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulated lysosomal trafficking as a mechanism for regulating GABAA receptor abundance at synapses in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell Neurosci. 44, 307-317 (2010).</li><li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans.">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li><li>Rowland, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+terminals+independently+regulate+synaptic+clustering+and+autophagy+of+GABAA+receptors+in+Caenorhabditis+elegans.">Presynaptic terminals independently regulate synaptic clustering and autophagy of GABAA receptors in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 26, 1711-1720 (2006).</li><li>Burbea, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+and+AP180+regulate+the+abundance+of+GLR-1+glutamate+receptors+at+postsynaptic+elements+in+C.+elegans.">Ubiquitin and AP180 regulate the abundance of GLR-1 glutamate receptors at postsynaptic elements in C. elegans.</a> Neuron. 35, 107-120 (2002).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Oda, S., Tomioka, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+regulated+by+the+insulin-like+signaling+pathway+underlies+salt+chemotaxis+learning+in+Caenorhabditis+elegans.">Neuronal plasticity regulated by the insulin-like signaling pathway underlies salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurophysiol. 106, 301-308 (2011).</li><li>Sankaranarayanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity.">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li><li>McDonald, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+functional+characterization+of+fluorescent,+N-terminally+tagged+CB1+receptor+chimeras+for+live-cell+imaging.">Generation and functional characterization of fluorescent, N-terminally tagged CB1 receptor chimeras for live-cell imaging.</a> Mol. Cell Neurosci. 35, 237-248 (2007).</li><li>Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+neuropeptide+release+induced+by+octopamine+without+Ca2++entry+into+the+nerve+terminal.">Synaptic neuropeptide release induced by octopamine without Ca2+ entry into the nerve terminal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4477-4481 (2011).</li></ol>

Il metodo qui presentato è stato progettato per estrarre quantitativi multi-parametri dati per grandi popolazioni di sinapsi in C. elegans, massimizzando al contempo la coerenza all&#39;interno dei gruppi di trattamento. Tre caratteristiche contribuiscono a questi obiettivi. In primo luogo, immunostaining viene eseguita su popolazioni sincroni a vite senza fine di garantire che tutti gli animali sono la stessa età. Questo passaggio è fondamentale dato che il regolamento per lo sviluppo dei livelli di espress...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del software </td><td> Azienda </td><td></td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Volocity v4.0 o superiore </td><td> PerkinElmer / Improvision </td><td></td><td> Controlla il tuo impianto locale nucleo di imaging per l&#39;accesso a questo software. Il software demo è disponibile sul sito PerkinElmer. Questo metodo richiede solo il modulo La determinazione quantitativa di Volocity. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 2. Reagenti e attrezzature specifiche. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Egg tampone </td><td> NaCl KCl CaCl 2 MgCl 2 HEPES (Regolare il pH a 7.3) </td> &lt;td&gt; 118 mm 48 mM 2 mM 2 mM 24 mM </td></tr><tr><td> Ipoclorito alcalino (per 5 ml) </td><td> Candeggina Fresh (scartare flacone 30 giorni dopo l&#39;apertura) 10 N NaOH ddh 2 O </td><td> 1,0 ml 0,25 ml 3,75 ml </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 1. Solutions. </td></tr></tbody></table>

automated quantification of synaptic fluorescence in c. elegans

Forza Synapse si riferisce alla ampiezza delle risposte post-sinaptici a eventi presinaptici di rilascio dei neurotrasmettitori, e ha un impatto significativo sulla funzione complessiva del circuito neurale. Synapse forza dipende in modo critico l&#39;abbondanza di recettori neurotrasmettitori raggruppati in siti sinaptici sulla membrana postsinaptica. Livelli di recettori sono stabiliti evolutivamente, e può essere alterato da traffico tra i diversi centri del recettore di superficie localizzato, subsynaptic e intracellulare, che rappresentano importanti meccanismi di plasticità sinaptica e neuromodulazione. Metodi rigorosi per quantificare sinapticamente-localizzato abbondanza recettore del neurotrasmettitore sono essenziali per studiare lo sviluppo e la plasticità sinaptica. Microscopia a fluorescenza è un approccio ottimale perché conserva l&#39;informazione territoriale, distinguendo da synaptic non-sinaptici piscine e discriminando tra le popolazioni dei recettori localizzati a diversi tipi di sinapsi. Il modello genetico dell&#39;organismo Caenorhabditis elegans è particolarmente adatto per questi studi a causa della piccola dimensione e la relativa semplicità del suo sistema nervoso, la trasparenza, e la disponibilità di potenti tecniche genetiche, consentendo l&#39;esame di sinapsi nativi in animali intatti. Qui vi presentiamo un metodo per quantificare marcato in fluorescenza recettori dei neurotrasmettitori sinaptici in C. elegans. La sua caratteristica fondamentale è l&#39;identificazione automatica e l&#39;analisi delle singole sinapsi in tre dimensioni in multi-piano i file di output microscopio confocale, la posizione tabulazione, volume, intensità di fluorescenza e fluorescenza totale per ogni sinapsi. Questo approccio ha due vantaggi principali rispetto analisi manuale di Z-Plane proiezioni di dati confocale. In primo luogo, perché ogni piano del set di dati confocale è incluso, nessun dato viene perso attraverso z-piano di proiezione, in genere basato sulle medie intensità pixel o massimi. In secondo luogo, l&#39;identificazione delle sinapsi è automatizzato, ma può essere ispezionati da exsperimentatore, come procede l&#39;analisi dei dati, che consente l&#39;estrazione rapida e precisa di dati provenienti da un gran numero di sinapsi. Centinaia di migliaia di sinapsi per campione può essere facilmente ottenuto, producendo grandi quantità di dati per massimizzare la potenza statistica. Considerazioni per la preparazione di C. elegans per l&#39;analisi e l&#39;esecuzione confocale a minimizzare la variabilità tra gli animali all&#39;interno dei gruppi di trattamento vengono anche discussi. Nonostante sia stato sviluppato per analizzare C. recettori postsinaptici elegans, questo metodo è generalmente utile per qualsiasi tipo di sinapticamente-localizzata proteina, o addirittura, qualsiasi segnale di fluorescenza che è localizzato a cluster discreti, puncta o organelli. La procedura viene eseguita in tre fasi: 1) preparazione dei campioni, 2) confocale, e 3) analisi delle immagini. I passi 1 e 2 sono specifici per C. elegans, mentre il punto 3 è generalmente applicabile a qualsiasi segnale di fluorescenza puntata al microscopio confocale.

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Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

L&#39;abbondanza dei recettori dei neurotrasmettitori a livello delle sinapsi cluster influenza fortemente la forza sinaptica. Questo metodo quantifica recettori dei neurotrasmettitori marcato in fluorescenza in tre dimensioni con un singolo sinapsi risoluzione<em&gt; C. elegans</em&gt;, Consentendo a centinaia di sinapsi di essere rapidamente caratterizzato all&#39;interno di un campione unico senza distorsioni introdotte dal z-piano di proiezione.

Quantificazione automatica di fluorescenza in Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

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