Name: processing of primary brain tumor tissue for stem cell assays and flow sorting
Uploaded: 2012-09-25T11:55:00
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Ce travail a été financé par l&#39;Institut ontarien de recherche sur le cancer (IORC), la Fondation Terry Fox et l&#39;American Association of Neurological Surgeons.

1. Culture de tissus tumeur au cerveau <ol><li> Ajouter 200 ul Libérase décongelés (Roche Applied Science) à 15 ml de LCR artificiel (ACSF-voir le tableau 1), puis placer en bain à 37 ° C de l&#39;eau. Liberase TM est un mélange d&#39;enzymes protéolytiques utilisés pour dissocier les échantillons de tissus primaires, ainsi que tumorspheres cultivées. Contrairement à la trypsine-EDTA, la méthode Libérase préserve l&#39;antigène de surface CD133. Pour un échantillon de tissu d&#39;envi...

<ol>
	<li>Ohgaki, H., Kleihues, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+etiology+of+gliomas.">Epidemiology and etiology of gliomas.</a> Acta Neuropathol. 109, 93 (2005).</li><li>Huse, J. T., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+brain+cancer:+advances+in+the+molecular+pathology+of+malignant+glioma.">Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma.</a> 10, 319 (2010).</li><li>Wechsler-Reya, R., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+biology+of+brain+tumors.">The developmental biology of brain tumors.</a> Annu. Rev. Neurosci. 24, 385 (2001).</li><li>Singh, S. 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L&#39;hypothèse de cellules souches du cancer 10, basé sur le travail dans la leucémie 21, le cancer du sein 11 et 4,5 le cancer du cerveau, suggère que seule une fraction relativement faible de cellules dans la tumeur, appelées cellules souches cancéreuses, possèdent une capacité à proliférer et largement auto renouveler. La plupart des cellules tumorales perdent leur capacité à proliférer et à se renouveler car ils se différencient en cellules qui deviennent l...

Les tumeurs cérébrales sont parmi les cancers les plus agressifs et hétérogènes connus chez l&#39;homme. Bien que leur détection précoce et le diagnostic ont été facilitées par la neuro-imagerie moderne de la technologie, nous manquons encore de traitement curatif pour les tumeurs cérébrales nombreuses, en particulier pour diffuses, celles envahissantes ou celles situées profondément dans le cerveau. Les tumeurs cérébrales représentent la première cause de mortalité par cancer chez les enfants en raison de leur caractère très agressif et souvent incurable. Le glioblastome (GBM), la tumeur cérébrale primaire la plus fréquente chez l&#39;adulte, est l&#39;un des cancers les plus agressifs de l&#39;homme, craint pour son pronostic toujours fatale 1. Cette tumeur très maligne astrocytaire (OMS grade 4) se produit généralement dans les hémisphères cérébraux des adultes, et peut également se produire chez les jeunes enfants et les nourrissons. Sa croissance est rapide et infiltrantes et de diagnostic des caractéristiques pathologiques comprennent pléomorphisme nucléaire, la prolifération microvasculaire et une nécrose 2,3. Pour adults avec glioblastome nouvellement diagnostiqué, la médiane de survie dépasse rarement 12 mois 1, avec des réponses généralement pauvres à toutes les modalités thérapeutiques. Nous avons remarqué qu&#39;il ya beaucoup de similitudes fonctionnelles et génétiques partagées par les cellules souches somatiques et les cellules cancéreuses, et que les voies moléculaires qui régulent le développement normal du cerveau sont souvent dérégulée dans le cancer. En appliquant les paradigmes en biologie des cellules souches à l&#39;étude des tumeurs du cerveau, nous étions les premiers chercheurs à identifier de manière prospective et purifier une sous-population de cellules de GBM de l&#39;homme qui présentaient les propriétés des cellules souches de la prolifération, l&#39;autorenouvellement et la différenciation in vitro 4 et dans vivo 5. Nous avons appliqué les conditions de culture et les dosages utilisés à l&#39;origine pour caractériser les cellules souches neurales normales (NSC) in vitro à de multiples 6,7 tumeurs cérébrales pédiatriques et adultes, et enrichi par ces cellules souches comme par tri cellulaire pour le marqueur de surface des cellules progénitrices neurales CD133 8 ,9. Le CD133 + fraction tumeur au cerveau contient des cellules qui ont une fréquence beaucoup plus élevée de l&#39;initiation tumorale que le CD133-fraction dans les cerveaux de souris NOD-SCID 5,10. Cette formellement établi que seul un sous-ensemble rare de cellules tumorales du cerveau avec des propriétés de cellules souches sont des tumeurs initier, de les gagner le nom de «tumeur au cerveau cellules initiatrices» ou «BTICs&quot;. L&#39;identification roman de BTICs offre de nouvelles perspectives sur la tumorigenèse cerveau humain, accordant son soutien résolu à l&#39;hypothèse des cellules souches cancéreuses 10-13 comme base pour de nombreuses tumeurs solides, et établit une nouvelle cible cellulaire pour des thérapies plus efficaces contre le cancer 14-20. Thérapies qui mettent l&#39;accent sur les tuant la majeure partie de la tumeur risquent de rater le rare tige-comme fraction, permettant à la tumeur de continuer à croître. Thérapies qui mettent l&#39;accent sur la destruction des cellules souches du cancer peut offrir un meilleur traitement et le pronostic des patients atteints de tumeurs cérébrales. Afin d&#39;étudier les populations BTIC, nous avons affiné notre culture protocoles spécifiquement sélectionnées pour les populations de cellules au sein des tumeurs cérébrales humaines qui possèdent des propriétés de cellules souches. Sans sérum, les cellules souches neurales (NSC) permet moyen pour le maintien d&#39;un état de cellules souches non différenciées, et l&#39;addition de facteur de croissance des fibroblastes basique (bFGF), le facteur de croissance épidermique (EGF), le facteur inhibiteur de leucémie et (LIF) permet de la prolifération des multi-puissant, d&#39;auto-renouvellement et extensibles tumorspheres de l&#39;homme. Ici, nous décrivons les méthodes impliquées dans le traitement des tumeurs cérébrales primaires et leur culture dans un milieu de NSC pour enrichir les populations BTIC. Nous avons appelé notre modèle expérimental &quot;isolats de patients BTIC» pour souligner le fait que ces cellules sont très peu cultivées dans des souches conditions de la cellule pour sélectionner des populations de cellules souches. immunomarquage ultérieur des populations BTIC pour les principaux marqueurs de cellules souches telles que CD133 et CD15 et l&#39;analyse par cytométrie en flux est également décrit. Nous discutons ensuite l&#39;analyse de dilution limitante,qui aide à étudier le potentiel d&#39;auto-renouvellement de BTICs. Enfin, nous explorons l&#39;analyse de l&#39;expression des gènes de ces cellules rares en triant les cellules simples sur des lames AmpliGrid et l&#39;exécution seule cellule RT-PCR. Ces techniques sont également applicables aux autres tumeurs cérébrales telles que le médulloblastome, épendymome et les gliomes pédiatriques.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> 01:01 DMEM: F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-082 </td></tr><tr><td> Supplément N2 </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> Wisent </td><td> 330-050 EL- </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Invitrogen </td><td> 15023-021 </td></tr><tr><td> N-acétylcystéine </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A9165-25g </td></tr><tr><td> Facteur de survie des neurones -1 (NSF-1) </td><td> Lonza Clonetics </td><td> CC-4323 </td></tr><tr><td> Facteur de croissance épidermique (EGF) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> E9644 </td></tr><tr><td> Facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0261 </td></tr><tr><td> Facteur inhibiteur de leucémie (LIF) </td><td> Millipore </td><td> LIF1010 </td></tr><tr><td> Antibiotique / antimycotique </td><td> Wisent </td><td> 450-115 EL- </td></tr><tr><td> Libérase TM </td><td> Roche </td><td> 05 401 119 001 </td></tr><tr><td> Une solution de chlorure d&#39;ammonium </td><td> Technologies des cellules souches </td><td> 07850 </td></tr></tbody></table>

processing of primary brain tumor tissue for stem cell assays and flow sorting

Les tumeurs cérébrales sont typiquement constitués de cellules morphologiquement différents qui expriment une variété de marqueurs de lignage neural. Seule une fraction relativement faible de cellules dans la tumeur avec des propriétés de cellules souches, appelées cellules tumorales du cerveau d&#39;amorçage (BTICs), possèdent une capacité à différencier selon plusieurs lignées, auto-renouvellement, et d&#39;initier des tumeurs in vivo. Nous avons appliqué les conditions de culture utilisés à l&#39;origine pour les normales des cellules souches neurales (NSC) à une variété de tumeurs cérébrales humaines et a constaté que cette méthode de culture sélectionne spécifiquement pour les souches de type populations. Un milieu sans sérum (NSC) permet le maintien d&#39;un état de cellules souches non différenciées, et l&#39;addition de bFGF et EGF permet la prolifération des multi-puissant, auto-renouvellement, et tumorspheres expansibles. Pour caractériser davantage la population BTIC chaque tumeur, nous évaluons marqueurs de surface cellulaire par cytométrie en flux. Nous pouvons également trier les populations d&#39;intérêt pour characteriz plus spécifiquestion. L&#39;auto-renouvellement des essais sont réalisés sur BTICs simples triés dans des plaques à 96 puits, la formation d&#39;tumorspheres après incubation à 37 ° C indique la présence d&#39;une tige ou d&#39;une cellule progénitrice. Le nombre de cellules multiples d&#39;une population donnée peut également être triées dans différents puits pour limiter l&#39;analyse de dilution, d&#39;analyser la capacité d&#39;auto-renouvellement. Nous pouvons également étudier expression différentielle des gènes dans une population cellulaire particulière en utilisant seule cellule RT-PCR. Les protocoles suivants décrivent les procédures pour la dissociation et de culture primaire d&#39;échantillons humains pour enrichir des populations BTIC, ainsi que la dissociation de tumorspheres. Sont également inclus les protocoles de coloration pour l&#39;analyse de cytométrie de flux ou tri, l&#39;auto-renouvellement des essais, et seule cellule RT-PCR.

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Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

L&#39;identification des cellules tumorales du cerveau d&#39;amorçage (BTICs), les cellules rares, dans un tumorales hétérogènes possédant des propriétés de cellules souches, offre de nouvelles perspectives sur la pathogénie des tumeurs cérébrales humaines. Nous avons amélioré les conditions de culture spécifiques pour enrichir BTICs, et nous avons l&#39;habitude d&#39;utiliser la cytométrie en flux pour enrichir davantage ces populations. D&#39;auto-renouvellement des tests et de l&#39;analyse par transcription seule cellule RT-PCR peut ensuite être effectuée sur ces cellules isolées.

Traitement des tissus de tumeur cérébrale primaire pour les essais sur les cellules souches et les flux de tri

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells MDSC from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting AutoMACS

Préparation de dérivés myéloïdes cellules suppressives (MDSC) de Naive et pancréatique souris porteuses de tumeurs par cytométrie en flux et automatisé de tri magnétique de cellules activées (autoMACS)

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological ...

Recherche

Médecine

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolement des noyaux de cardiomyocytes post-mortem des tissus

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Différenciation isolement, caractérisation et comparative de l&#39;homme dentaires cellules souches de pulpe Dérivé de dents permanentes à l&#39;aide de deux méthodes différentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Culture cellulaire dérivée et isolement de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putatifs cellules souches du cancer du mélanome

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel haute résolution<em&gt; In vivo</em&gt; Technique d&#39;imagerie pour étudier la réponse dynamique des structures intracrâniennes à la croissance tumorale et de thérapeutique

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Adaptation des semi-automatique de circulation des cellules tumorales (CTC) Essais pour les applications cliniques et précliniques de recherche

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Evaluation des propriétés de cellules souches en cellules humaines de l&#39;ovaire Carcinome utilisant MULTI et simples à base de cellules Sphères dosages

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

Tumeur primaire et MEF cellule d&#39;isolement pour étudier métastases pulmonaires

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Essais in vitro pour évaluer la formation et la perturbation du vaisseau en forme de barrière de sang-cerveau

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

Stratégies d’échantillonnage et traitement des échantillons de tissu de la biobanque de modèles biomédicaux porcins

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...