Name: processing of primary brain tumor tissue for stem cell assays and flow sorting
Uploaded: 2012-09-25T11:55:00
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この作品は、がん研究のオンタリオ研究所（OICR）、テリー·フォックス財団と脳神経外科協会によって資金を供給された。

1。脳腫瘍組織の文化<ol><li> 37℃の水浴中に15 mlの人工CSF（ACSF- 表1参照）と場所に200μlの解凍リベラーゼ（ロシュ·ダイアグノスティックス）を追加します。リベラーゼTMは、一次組織サンプルと同様に、培養tumorspheresを解離させるために使用されるタンパク質分解酵素の混合物である。トリプシン-EDTAとは異なり、リベラーゼ法は表面抗原CD133を保持します。約0.5cm 3の組...

<ol>
	<li>Ohgaki, H., Kleihues, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+etiology+of+gliomas.">Epidemiology and etiology of gliomas.</a> Acta Neuropathol. 109, 93 (2005).</li><li>Huse, J. T., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+brain+cancer:+advances+in+the+molecular+pathology+of+malignant+glioma.">Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma.</a> 10, 319 (2010).</li><li>Wechsler-Reya, R., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+biology+of+brain+tumors.">The developmental biology of brain tumors.</a> Annu. Rev. Neurosci. 24, 385 (2001).</li><li>Singh, S. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AC133,+a+novel+marker+for+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">AC133, a novel marker for human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Blood. 90, 5002 (1997).</li><li>Yu, Y., Flint, A., Dvorin, E. L., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AC133-2,+a+novel+isoform+of+human+AC133+stem+cell+antigen.">AC133-2, a novel isoform of human AC133 stem cell antigen.</a> J. Biol. Chem. 277, 20711 (2002).</li><li>Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sorting:+automated+separation+of+mammalian+cells+as+a+function+of+intracellular+fluorescence.">Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence.</a> Science. 166, 747 (1969).</li><li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256, 495 (1975).</li><li>Barrett, L. 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J., KAErn, M., Cantor, C. R., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+in+eukaryotic+gene+expression.">Noise in eukaryotic gene expression.</a> Nature. 422, 633 (2003).</li><li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297, 1183 (2002).</li><li>Maheshri, N., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+with+noisy+genes:+how+cells+function+reliably+with+inherent+variability+in+gene+expression.">Living with noisy genes: how cells function reliably with inherent variability in gene expression.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 413 (2007).</li><li>Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4, e309 (2006).</li><li>Ross, I. L., Browne, C. M., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+individual+genes+in+eukaryotic+cells+occurs+randomly+and+infrequently.">Transcription of individual genes in eukaryotic cells occurs randomly and infrequently.</a> Immunol. Cell Biol. 72, 177 (1994).</li><li>Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+real-time+polymerase+chain+reaction.">The real-time polymerase chain reaction.</a> Mol. 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白血病21内の作業に基づいて、がん幹細胞仮説10、乳癌11、脳腫瘍4,5、腫瘍内の細胞の唯一の比較的小さな部分と呼ばれるがん幹細胞は、広範囲に増殖する能力と自己を持っていることを示唆している - 新たにする。腫瘍細胞のほとんどは、彼らは、腫瘍の表現型の署名になる細胞に分化するように増殖し、自己複製する能力を失う。腫瘍を維持することがで?...

脳腫瘍は、ヒトでは知られている最も積極的かつ異種の癌の一つです。彼らの早期発見と診断が現代のニューロイメージング技術によって促進されてきたが、我々はまだ、特にびまん性、侵襲性のもの、あるいは脳の奥深くに位置するもののために、多くの脳腫瘍の治癒を目指した治療法を欠いている。 脳腫瘍は、彼らの非常に積極的かつ頻繁に不治の性質に起因する小児におけるがん死亡の主要な原因を表す。神経膠芽腫（GBM）の、大人の中で最も一般的な原発性脳腫瘍は、その一様に致命的な予後1の恐れ、最も積極的なヒトの癌の一つです。この高度悪性星細胞腫（WHOグレード4）は、通常成人の大脳半球に発生し、また、幼い子供や乳児に発生する可能性があります。その成長は、迅速かつ浸潤であり、診断病理学的特徴は、核多形性、微小血管の増殖、壊死2,3が含まれています。 adul用新たに診断されたGBMのtsは、生存期間の中央値はほとんどすべての治療法に一般的に貧しい応答で、12ヶ月の1を超えて拡張しません。私たちは、体性幹細胞とがん細胞が共有する多くの機能と遺伝的類似性があることに留意し、正常な脳の発達を調節する分子経路はしばしば癌で異常調節されていること。脳腫瘍の研究に幹細胞生物学のパラダイムを適用することで、我々は将来に向かってin vitroで4とで増殖、自己再生および分化の幹細胞の特性を示した人間性GBMからの細胞の亜集団を特定し、浄化した最初の研究者であった生体内 5。私たちは、もともと複数の小児および成人の脳腫瘍にインビトロ 6,7 で正常な神経幹細胞（NSC）を特徴づけるために使用される培養条件およびアッセイを適用、及びCD133 8神経前駆細胞表面マーカーのために細胞選別によって、これらの幹細胞様細胞が濃縮さ、9。 CD133 +脳腫瘍率は、NOD-SCIDマウスの脳の5,10のCD133-フラクションよりも腫瘍の開始のはるかに高い周波数を持っていた細胞を含んでいた。これは、正式に名前を付け、 &quot;脳腫瘍開始細胞&quot;または &quot;BTICs&quot;を獲得し、幹細胞の性質を有する脳腫瘍細胞の唯一の珍しいサブセットが腫瘍開始されていることを確立した。 BTICsの新規同定は多くの固形腫瘍の基礎としての癌幹細胞仮説10月13日のための強力なサポートを与えて、人間の脳の腫瘍形成に新たな洞察を提供し、より効果的ながん治療14から20のための新規細胞標的を確立します。腫瘍の大部分を殺すことに焦点を当て、腫瘍が成長し続けることができ、珍しい幹様分数を見逃す可能性がある治療法。がん幹細胞を死滅させるに焦点を当てた脳腫瘍患者のためのより良い治療と予後を提供することができることを治療。 BTIC集団を研究するために、我々は我々cultuを洗練しました特に幹細胞の特性を有するヒト脳腫瘍内の細胞集団を選択するためのプロトコルを再。無血清、神経幹細胞（NSC）の媒体が未分化の幹細胞状態の維持を可能にし、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、上皮増殖因子（EGF）を添加すること、および白血病抑制因子（LIF）が可能にマルチ強力な増殖、自己再生、そして拡張可能な人間tumorspheres。ここでは、原発性脳腫瘍とBTIC集団を豊かにするためのNSC培地で培養しての処理に関与する方法を説明します我々は、我々の実験モデル系、これらの細胞は最小限しか幹の下で培養されているという事実を強調するために&quot;BTIC患者分離株&quot;と呼ばれています幹細胞集団を選択するためのセル条件。キーなど、CD133やCD15などの幹細胞マーカーおよびフローサイトメトリー分析のためBTIC集団のその後の免疫標識も記載されている。次に、限界希釈法を議論これはBTICsの自己再生の可能性を研究することにも役立ちます。最後に、我々はAmpliGridスライド上に単一細胞を選別し、単一細胞RT-PCRを行うことにより、これらの希少細胞の遺伝子発現解析を探る。これらの技術はまた、髄芽腫、上衣腫と小児神経膠腫などの他の脳腫瘍に適用されます。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>午前1時01 DMEM：F12 </td><td>インビトロジェン</td><td> 11320-082 </td></tr><tr><td> N2サプリメント</td><td>インビトロジェン</td><td> 17502-048 </td></tr><tr><td> 1M HEPES </td><td> Wisent </td><td> 330から050-EL </td></tr><tr><td>グルコース</td><td>インビトロジェン</td><td> 15023-021 </td></tr><tr><td> N-アセチルシステイン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A9165-25G </td></tr><tr><td>神経生存因子-1（NSF-1） </td><td>ロンザClonetics社</td><td> CC-4323 </td></tr><tr><td>上皮成長因子（EGF） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> E9644 </td></tr><tr><td>塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF） </td><td>インビトロジェン</td><td> PHG0261 </td></tr><tr><td>白血病阻害因子（LIF） </td><td>ミリポア</td><td> LIF1010 </td></tr><tr><td>真菌性抗生物質/ </td><td> Wisent </td><td> 450から115-EL </td></tr><tr><td>リベラーゼTM </td><td>ロッシュ</td><td> 05 401 119 001 </td></tr><tr><td>塩化アンモニウム溶液</td><td>電池技術を食い止める</td><td> 07850 </td></tr></tbody></table>

processing of primary brain tumor tissue for stem cell assays and flow sorting

脳腫瘍は、通常、神経系マーカーの多様な表現形態学的に多様な細胞で構成されています。幹細胞の特性を備えた腫瘍内の細胞の唯一の比較的小さな部分と呼ばれる脳の腫瘍開始細胞（BTICs）は、複数の系統に沿って分化、自己複製、及びin vivoで腫瘍を開始する能力を持っています。私たちは、もともと人間の脳の腫瘍の様に通常の神経幹細胞（NSC）のために使用され、この培養方法は、具体的に幹細胞様集団を選択することがわかった培養条件を適用しています。無血清培地（NSC）は未分化幹細胞状態の維持を可能にし、bFGFおよびEGFの添加は、マルチ強力な増殖を可能にする、自己再生、拡張可能tumorspheres。 さらに各腫瘍のBTIC人口を特徴付けるために、我々は、フローサイトメトリーにより細胞表面マーカーを評価します。我々はまた、より具体的なcharacterizため興味のある集団を並べ替えることもできation。自己再生アッセイは、96ウェルプレートにソート単一BTICs上で実行されます。tumorspheresの形成は37℃インキュベーションに続いて℃で幹細胞または前駆細胞の存在を示しています。特定の集団の複数のセル番号は、自己再生能力を分析するために、希釈分析を制限するための異なるウェルに並べ替えることができます。我々はまた、単一細胞RT-PCR法を使用して、特定の細胞集団内で異なる遺伝子発現を調べることができます。 次のプロトコルはBTIC集団、ならびにtumorspheresの解離のために豊かにするために、プライマリヒト試料の解離および培養のための私達の手順について説明します。また、フローサイトメトリー分析やソート、自己複製アッセイ、および単一細胞RT-PCRのために染色するためのプロトコルも含まれています。

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Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

脳腫瘍開始細胞（BTICs）、幹細胞特性を有する異種腫瘍内の希少な細胞の同定は、ヒトの脳の腫瘍の病因に新たな洞察を提供しています。我々はBTICsを濃縮するために、特定の培養条件を改良しており、我々は日常的に、さらに、これらの集団を豊かにするためにフローサイトメトリーを使用しています。単一細胞RT-PCR法による自己再生アッセイおよび転写産物の解析が続いてこれらの単離された細胞で行うことができます。

ソート幹細胞アッセイおよびフローの原発性脳腫瘍組織の処理

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells MDSC from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting AutoMACS

フローサイトメトリーおよび自動化された磁気活性化細胞選別（AutoMACS）を使用して、ナイーブ膵腫瘍を有するマウスからミエロイド系のサプレッサー細胞（MDSC）の調製

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological ...

医学

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

事後組織から心筋細胞核の分離

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

単離、特徴付けと二つの異なる方法を使用して永久歯に由来するヒト歯髄幹細胞の分化の比較

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

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CD133の患者由来の細胞培養および分離<sup&gt; +</supメラノーマから&gt;推定されるがん幹細胞

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

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新規高分解能<em生体内で&gt;</em腫瘍増殖と治療に頭蓋内構造物の動的応答を研究する&gt;イメージング技術

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

臨床および前臨床研究用途のための半自動循環腫瘍細胞（CTC）アッセイの適応

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

マルチとシングルセルベース球アッセイを用いてヒト卵巣癌細胞における幹細胞特性の評価

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

原発腫瘍と肺転移を研究するためのMEF細胞の単離

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

血液脳関門メッシュ様血管形成および崩壊を評価するためのインビトロアッセイ

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

サンプリング戦略とブタの生物医学的モデルからバイオバンク組織サンプルの処理

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...