Name: purification of pathogen vacuoles from legionella-infected phagocytes
Uploaded: 2012-06-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes at JoVE.com

تم دعم البحوث في المختبر من قبل معهد ماكس فون بيتنكوفر، لودفيج ماكسيميليان ميونيخ الجامعة، ومؤسسة البحوث الألمانية (DFG، مرحبا 1511/3-1)، والفراء Bundesministerium Bildung اوند Forschung (BMBF) &quot;الجينوم العدوى الطبية&quot; مبادرة ( 0315834C).

1. الاستعدادات لعزل LCV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسحة من البكتيريا المنتجة للبنوموفيلا DsRed اكسبريس 13،14 من أسهم الجلسرين على لوحات أجار CYE مع 5 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول (CAM) قبل أربعة أيام العزلة LCV. احتضان هذه البكتيريا عند 37 ?...

<ol>
	<li>Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+spp.+outdoors:+colonization,+communication+and+persistence.">Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence.</a> Environ. Microbiol. Rep. 3, 286-296 (2011).</li><li>Zhu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+protein+substrates+of+the+Dot/Icm+type+IV+transporter+of+Legionella+pneumophila.">Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila.</a> PLoS ONE. 6, e17638 (2011).</li><li>Hilbi, H., Weber, S., Finsel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchors+for+effectors:+subversion+of+phospho-inositide+lipids+by+Legionella.">Anchors for effectors: subversion of phospho-inositide lipids by Legionella.</a> Front Microbiol. 2, 91 (2011).</li><li>Hubber, A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+host+cell+function+by+Legionella+pneumophila+type+IV+effectors.">Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).</li><li>Kima, P. E., Dunn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+calnexin+expression+on+phagosomes+to+isolate+Leishmania+parasitophorous+vacuoles.">Exploiting calnexin expression on phagosomes to isolate Leishmania parasitophorous vacuoles.</a> Microb. Pathog. 38, 139-145 (2005).</li><li>L&#252;hrmann, A., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+purify+bacteria-containing+phagosomes+from+infected+macrophages.">A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages.</a> Methods Cell Sci. 22, 329-341 (2000).</li><li>Sturgill-Koszycki, S., Haddix, P. L., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+between+Mycobacterium+and+the+macrophage+analyzed+by+two-dimensional+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">The interaction between Mycobacterium and the macrophage analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 18, 2558-2565 (1997).</li><li>Fernandez-Mora, E., Polidori, M., L&#252;hrmann, A., Schaible, U. E., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+Rhodococcus+equi-containing+vacuoles+is+arrested+after+completion+of+the+early+endosome+stage.">Maturation of Rhodococcus equi-containing vacuoles is arrested after completion of the early endosome stage.</a> Traffic. 6, 635-653 (2005).</li><li>Mills, S. D., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+Salmonella+typhimurium+and+Yersinia+pseudotuberculosis-containing+phagosomes+from+infected+mouse+macrophages:+Y.+pseudotuberculosis+traffics+to+terminal+lysosomes+where+they+are+degraded.">Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y. pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded.</a> Eur. J. Cell Biol. 77, 35-47 (1998).</li><li>Shevchuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+Legionella-containing+phagosomes+isolated+from+Dictyostelium.">Proteomic analysis of Legionella-containing phagosomes isolated from Dictyostelium.</a> Int. J. Med. Microbiol. 299, 489-508 (2009).</li><li>Brombacher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab1+guanine+nucleotide+exchange+factor+SidM+is+a+major+phosphatidylinositol+4-phosphate-binding+effector+protein+of+Legionella+pneumophila.">Rab1 guanine nucleotide exchange factor SidM is a major phosphatidylinositol 4-phosphate-binding effector protein of Legionella pneumophila.</a> J. Biol. Chem. 284, 4846-4856 (2009).</li><li>Urwyler, S., Finsel, I., Ragaz, C., Hilbi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Legionella-containing+vacuoles+by+immuno-magnetic+separation.">Isolation of Legionella-containing vacuoles by immuno-magnetic separation.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 (2010).</li><li>Urwyler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+Legionella+vacuoles+purified+by+magnetic+immunoseparation+reveals+secretory+and+endosomal+GTPases.">Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases.</a> Traffic. 10, 76-87 (2009).</li><li>Mampel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planktonic+replication+is+essential+for+biofilm+formation+by+Legionella+pneumophila+in+a+complex+medium+under+static+and+dynamic+flow+conditions.">Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2885-2895 (2006).</li></ol>

وعلى النقيض من الأساليب المنشورة سابقا، ويستند هذا البروتوكول على خطوتين، لأول مرة فصل LCVs بواسطة نهج المناعية المغناطيسي، والثانية، وتنقية من LCVs بواسطة الطرد المركزي المتدرج الكثافة. ويمكن عزل LCV اتباعها بسهولة بواسطة المجهر مضان، عندما يتم استخدام أي من البكتيريا...

purification of pathogen vacuoles from legionella-infected phagocytes

والانتهازية الممرض الفيلقية المستروحة هو جرثومة الاميبا المقاوم، والذي يتطابق أيضا في الضامة السنخية وبذلك يكون الالتهاب الرئوي &quot;داء الفيالقة&quot; (1). في البالعات الأوالي والثدييات، L. بنوموفيلا توظف آلية الحفظ على تشكيل معين، والنسخ، متساهل مقصورة، و &quot;البكتيريا التي تحتوي على فجوة&quot; (LCV). LCV تشكيل يتطلب البكتيرية ICM / نقطة إفراز الرابع نوع النظام (T4SS)، والتي translocates ما يصل الى 275 &quot;المستجيب&quot; البروتينات في الخلايا المضيفة. والمستجيبات التلاعب البروتينات المضيفة، وكذلك نسبة الدهون والتواصل مع إفرازي، العضيات endosomal والميتوكوندريا 2-4. تشكيل LCVs يمثل عملية معقدة وقوية وزائدة عن الحاجة، والتي من الصعب فهم بطريقة اختزالية. مطلوب نهج تكاملي لفهم شامل تشكيل LCV، بما في ذلك تحليل عالمي للمسارالتفاعلات عامل ogen في استضافة وديناميتها الزمانية والمكانية. وذلك كخطوة أولى نحو تحقيق هذا الهدف، وتنقيته LCVs سليمة وتحليلها بواسطة البروتيوميات وlipidomics. وقد تم التحقيق في تكوين وتشكيل الممرض المحتوية على فجوات بواسطة تحليل البروتين باستخدام اللوني السائل أو 2 مد هلام الكهربائي بالإضافة إلى مطياف الكتلة. آوى فجوات معزولة عن إما discoideum التربة الاجتماعية Dictyostelium الأميبا أو البالعات الثدييات الليشمانيا 5، 6 الليستيريا، المتفطرة 7، Rhodococcus 8، 9 أو السالمونيلا النيابة البكتيريا. 10. ومع ذلك، فإن البروتوكولات المستخدمة في تنقية هذه الدراسات وقتا طويلا ومملا، لأنها تتطلب على سبيل المثال المجهر الإلكتروني لتحليل LCV مورفولوجيا والنزاهة والطهارة. بالإضافة إلى ذلك، هذه البروتوكولات لا استغلال الميزات الخاصة للفجوة الممرض لENrichment. الطريقة المعروضة هنا يتغلب على هذه القيود من خلال توظيف دال discoideum المنتجة للعلامة LCV الفلورسنت وذلك عن طريق استهداف البكتيرية صدق بروتين المستجيب، الذي انتقائي المراسي لغشاء LCV عن طريق الربط بين فوسفتيدلينوستول 4-الفوسفات (PtdIns (4) P) 3،11. يتم إثراء LCVs في خطوة أولى من قبل المناعية المغناطيسي الفصل باستخدام جسم مضاد الانجذاب-تنقية الابتدائية ضد صدق والأجسام المضادة الثانوية بالإضافة إلى حبات المغناطيسي، ثم في مرحلة ثانية من قبل الطرد المركزي Histodenz الكلاسيكية التدرج الكثافة 12،13 (الشكل 1) . دراسة بروتيوم من LCVs المعزولة من د. وكشفت discoideum أكثر من 560 بروتينات الخلية المضيفة، بما في ذلك البروتينات المرتبطة الحويصلات البلعمية، الميتوكوندريا، وأوروبا وجولجي، وكذلك GTPases عدة، والتي لم تكن قد تورطت في تشكيل LCV قبل 13. LCVs التخصيب وتنقيته معحدد بروتوكول هنا يمكن تحليل مزيد من الفحص المجهري (المناعي، المجهر الإلكتروني)، طرق كيميائية حيوية (الغربية وصمة عار) والنهج البروتين أو lipidomic.

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes at JoVE.com

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

توضح هذه المقالة طريقة لعزل وتنقية سليمة<em&gt; البكتيريا</em&gt; التي تحتوي على فجوات (LCVs) من الاميبا والضامة. البروتوكول على مرحلتين تشمل تخصيب LCV بواسطة المناعية المغناطيسي الفصل باستخدام الأجسام المضادة ضد علامة LCV البكتيرية وتنقية المزيد من الطرد المركزي المتدرج الكثافة.

تنقية من الفجوات المرضي من<em&gt; البكتيريا</em&gt; المصابة البالعات

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

غزو ​​الخلايا البشرية من قبل الممرض الجرثومي

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

في يوم واحد خطة سير العمل للكشف عن مسببات الأمراض البكتيرية ومضادات الميكروبات اختبار المقاومة من زرع الدم

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

تنقية والتصور من Lipopolysaccharide من البكتريا سالبة الجرام بواسطة استخراج مائي، الفينول الساخن

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

تنقية تقارب من المجمعات الأنفلونزا فيروس بروتين نووي ريبوزي من لونين من الخلايا المصابة

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

الخلية الحية المجهرية فيديو البلعمة الممرض الفطرية

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

متساوي التضخيم (LAMP) فحوصات بوساطة حلقة للكشف عن أنواع محددة من<em&gt; الأيمرية</em&gt; التي تصيب الدجاج

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA تنقية من داخل الخلية المزروعة<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em&gt; في خلايا البلاعم

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

التنمية وتحديد جزء من السكان رواية من المستمدة العدلات-الإنسان البالعات العملاق<em&gt; في المختبر</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

التكشف وظيفة من المستجيب البكتيرية من مسببات الأمراض النباتية غير الصالحة للزراعة باستخدام الخميرة شاشة ثنائية مختلطة

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

عزل وتوصيف وتنقية الضامة من الأنسجة المتضررة من التهاب المتصلة بالسمنة

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...